Что такое бакпосев на микрофлору: Посев на микрофлору отделяемого урогенитального тракта женщины с идентификацией микроорганизмов, в т.ч. кандида, методом времяпролетной МАСС-спектрометрии (MALDI-TOF) и определением чувствительности к основному спектру антибиотиков и антимикотиков

Содержание

Посев на флору с определением чувствительности к основному спектру антибиотиков и бактериофагам,в т.ч.кандида

Выберите требуемый вид биоматериала

Соскобы из урогенитального тракта не берутся в течение суток после местной терапии (свечи, мази, спринцевания), после полового контакта и во время менструации у женщин. После кольпоскопии, интравагинального УЗИ должно пройти 48 часов. В случае наличия признаков острого воспаления необходимость взятия мазка определяется лечащим врачом. Если исследование назначается для контроля излеченности, то взятие материала на микробиологические исследования не ранее,чем через 14 дней после окончания лечения.

Соскобы из урогенитального тракта не берутся в течение суток после местной терапии (свечи, мази, спринцевания), после полового контакта и во время менструации у женщин. После кольпоскопии, интравагинального УЗИ должно пройти 48 часов. В случае наличия признаков острого воспаления необходимость взятия мазка определяется лечащим врачом. Если исследование назначается для контроля излеченности, то взятие материала на исследование методом ПЦР возможно не ранее, чем через 28 дней после окончания приема антибиотиков, на микробиологические исследования не ранее,чем через 14 дней.

Соскобы из урогенитального тракта не берутся в течение суток после местной терапии (свечи, мази, спринцевания), после полового контакта и во время менструации у женщин. После кольпоскопии, интравагинального УЗИ должно пройти 48 часов. В случае наличия признаков острого воспаления необходимость взятия мазка определяется лечащим врачом. Если исследование назначается для контроля излеченности, то взятие материала на исследование методом ПЦР возможно не ранее, чем через 28 дней после окончания приема антибиотиков, на микробиологические исследования не ранее,чем через 14 дней.

Взятие материала на исследование возможно только врачом соответствующей квалификации.

Накануне исследования не применять местные лекарственные препараты и процедуры, исключить половой акт. При взятии соскоба из уретры не мочиться в течение 1,5-2 часов до процедуры. Если исследование назначается для контроля излеченности, то взятие материала на исследование методом ПЦР возможно не ранее, чем через 28 дней после окончания приема антибиотиков, на микробиологические исследования не ранее,чем через 14 дней.

Бактериологические исследования (бак посев) — (клиники Di Центр)


Чтобы выявить «виновника» заболевания, то есть микроорганизм, вызвавший ту или иную патологию, может быть назначено исследование, называемое бактериологическим посевом или сокращенно: бакпосев.

Определение

Бактериологический посев — метод исследования биологического материала (кровь, моча, кал и пр.), взятого у пациента и помещенного на искусственную питательную среду, способствующую росту и размножению возбудителя заболевания.

При исследовании можно выявить не только факт наличия возбудителя, но и его концентрацию. Таким образом можно исследовать:

  • кал, мочу, кровь
  • спинно-мозговую жидкость (ликвор)
  • мокроту
  • желчь
  • отделяемое из зева, носа, глаз, дыхательных путей, половых органов, ран.

То есть высевать микроорганизмы можно с практически любого участка организма. Подобные методики удобны для нахождения и идентификации бактерий и грибов, вирусы обнаружить таким образом гораздо сложнее, что связано с особенностями биологии вирусов.

Для чего сдают анализ на бакпосев?

Бактериологические посевы позволяют не только определить типы микробов, провоцирующих то или иное заболевание, но и подобрать эффективные антибиотики (определить чувствительность микробов к ним), которые помогут выздоровлению.

Только забор материала необходимо сделать до начала антибиотикотерапии. Назначать бактериологический посев могут как в поликлинике (например, всем известное исследование кала на дисбактериоз), так и в стационаре (например, при кишечных инфекциях, а также если биологический материал труднодоступен, как ликвор).

Мазок на бак посев в гинекологии

Анализ бак посева (мазок на бактерии) в гинекологии позволяет выявить в полученном материале вид бактерий, определить их количество и чувствительность к антибактериальным лекарственным средствам. Для этих целей может браться посев:

  • уреаплазмы
  • микоплазмы
  • молочницы
  • гарднереллы
  • возбудителя гонореи
  • стафилококки и др.

Забор материала, в зависимости от вида исследования, возможен из:
  • влагалища
  • цервикального канала
  • уретры
  • носа
  • горла
  • соскоба из прямой кишки.

В ряде случаев возможно проведение исследование грудного молока и бакпосев мочи, а также взятие мазка на золотистый стафилококк, стрептококки и энтерококки при беременности.

Посев из прямой кишки берется при подозрении на инфекционную патологию ануса и нижнего отдела кишечника. Анализ выявляет основные инфекции, передающиеся половым путем, попавшие туда после анального секса.

При выполнении анализа бак посева «Медицинский Ди центр» в Саратове, Энгельсе и области всегда проводит определение чувствительности выявленного микроба к антибиотикам в двух вариантах: к основному или расширенному спектру.

Как проходит бактериологический анализ?

После того как материал забирают у пациента, его помещают на специальные питательные среды, через 3−10 дней оценивают результаты. Распознать (идентифицировать) микроб специалисты его микробиологической лаборатории могут путем определения:

  • морфологических
  • культуральных
  • биохимических признаков.

Морфологию (строение) «вредителя» изучают под микроскопом, культуральные свойства характеризуются потребностями, условиями и типом роста микроорганизмов на питательных средах. Биохимические признаки определяются набором ферментов, синтезируемых микробом в процессе жизнедеятельности. Также обращают внимание на пигменты, окрашивающие колонии микроорганизмов и питательные среды, например, золотистый пигмент образует золотистый стафилококк.

Бактериологический анализ (бакпосев) в Саратове и Энгельсе можно сделать в Медицинском Ди центре. Цена на бакпосев совсем не велика и часто бывает, что для сдачи этого анализа специалистов вызывают на дом.
Узнать более точную информацию о времени приема и подготовке к сдаче анализов можно по телефону колл центра: 51−22−51

Бакпосев у/г материала на микрофлору на анализаторе + антибиотикограмма (определение чувствительности к антимикробным препаратам не проводится для Gardnerella spp.

)

Срок выполнения, дней: 5-7

Код исследования: М35

 

Микроорганизмы, составляющие нормальную микрофлору мочеполовой системы, составляют её биоценоз. У женщин детородного возраста микробная флора влагалища представлена строгими и факультативными анаэробными микроорганизмами (к ним в большей степени относятся лактобациллы) и значительно в меньшей степени аэробными и микроаэрофильными условно-патогенными бактериями. Другие отделы (полость матки, внутренний канал шейки матки) — стерильны. 

У девочек до наступления полового созревания преобладает кокковая флора и грамположительные палочки (дифтероиды). 

У здоровых мужчин дистальные отделы уретры контаминированы грамположительными кокками и палочками в небольшом количестве. Проксимальные отделы уретры, простата и семявыводящие канальца – стерильны. 

Изменение численности того или иного вида микроорганизмов или появление несвойственных данному месту обитания бактерий ведут к появлению признаков инфекционно-воспалительных заболеваний.  

Наиболее часто наблюдаются вагинит, уретрит, цервицит (у женщин), уретрит, простатит (у мужчин). 

Выделяемые возбудители (условно-патогенные бактерии): энтеробактерии, неферментирующие грамотрицательные бактерии, стрептококки, энтерококки, стафилококки, коринеформные бактерии, гемофилы и дрожжеподобные грибы. 

Рациональный выбор антибиотиков — основа радикального излечения — возможен только с помощью микробиологической диагностики. 

Выполнение исследований на современных автоматических анализаторах позволяет обеспечить высокую воспроизводимость и качество результатов. 

Основные преимущества анализатора – точность и скорость. Также не стоит забывать и о еще нескольких преимуществах, которые отличают его от прочих приборов:

— незаменим при спорном диагнозе – если специалист не может поставить точный диагноз, то прибор сможет дать полноценную характеристику состояния пациента и помочь решить эту задачу;
— необходим при тяжелых заболеваниях пациентов, перед операцией, когда требуется быстрое и максимально результативное исследование;

 

— работает без использования дополнительных материалов, для эффективности его исследования не требуются специальные инъекции или реактивы;
— выдает понятные любому специалисту результаты, что позволяет использовать эту информацию на приеме у нескольких специалистов и не проходить каждый раз новое обследование.

Подготовка пациента: Диагностическое исследование проводится до начала антибактериальной терапии. При исследовании отделяемого уретры, сбор материала проводят до или не ранее 2 — 3 часов после мочеиспускания.

У женщин культуральное исследование не проводится во время менструации, т. к. в этот период микробная обсемененность резко снижается из-за кровотечения. Материал исследуют не ранее 5 — 7 дня месячного цикла и до его окончания.


Материал: 
Урогенитальное отделяемое.

Метод: Микробиологический.

Референсные значения (норма): Роста нет.
 

Основные показания к назначению анализа:
1. Неспецифические воспалительные заболевания мочеполовых путей бактериальной природы и контроль после лечения (на 7 — 14 день после отмены антимикробных препаратов).


Интерпретация результатов: 
В норме нет роста или идентифицирован рост условно-патогенных микроорганизмов в низком титре (до 10кое/тамп, мл).  
При патологии выявляется рост УПМ в диагностическом титре (более 10кое/тамп, мл), S. agalactiae и S. pyogenes расцениваются как патогенные стрептококки, к ним всегда определяется чувствительность к антибиотикам независимо от титра. 

Бактериологические исследования

Бактериологическое исследование биологического материала (мазок, моча, грудное молоко, сперма и т. д.) на микрофлору с определением антибиотикочувствительности к выделенному микроорганизму (БИ001)

1. Бакпосев мазков:

1.1. Из влагалища, цервикального канала:

Нельзя сдавать мазок во время менструации, сразу после любого диагностического и лечебного вмешательства во влагалище или в течение 3-х дней после этого, во время приема внутрь антибиотиков или противовирусных препаратов. Провести тщательный туалет наружных половых органов.

1.2. Из уретры:

Перед взятием материала должно пройти не менее 4-х часов от последнего мочеиспускания. Провести тщательный туалет наружных половых органов.

1.3. Из зева:

Взятие материала проводится до приема антибактериальных лекарственных препаратов. Должно пройти не менее 4-х часов после чистки зубов, приема пищи, питья, жевательной резинки.

1.4. Из пазух носа, уха, глаза, раневой поверхности:

Взятие материала проводится до умывания, перевязки или промывания предполагаемой области.

2. Бакпосев грудного молока:

Тщательно вымыть кипяченой водой с мылом руки и грудь, осушить их салфетками. Руки, соски и околососковую область обрабатывают 70% спиртом. Первую порцию молока сцедить на салфетку. Затем аккуратно, не прикасаясь грудью или руками к внутренней поверхности стерильной емкости и крышки сцедить туда молоко не менее 10 мл. Материал при комнатной температуре в течение 1-2-х часов доставляется в лабораторию.

С каждой молочной железы (груди) биоматериал собирается в отдельную стерильную емкость. И, при необходимости (если сдаётся биоматериал с 2-х молочных желёз), ёмкость подписывается соответственно (левая, правая).

3. Бакпосев мочи:

Утренняя моча собирается в стерильную емкость. Перед тем как собрать мочу, необходимо тщательно вымыть кипяченой водой с мылом наружные половые органы, осушить их салфетками. После этого открыть баночку, не прикасаясь к внутренней поверхности баночки и крышки, выделить первую порцию мочи в унитаз или судно на счет «1» — «2». Задержать мочеиспускание, подставить баночку и выделить в нее не менее 10 мл мочи, остальное выделить в унитаз или судно. Доставить материал при комнатной температуре в течение 1-2 часов в лабораторию.

Исследование кала на кишечный дисбиоз (БИ002)

Утренний кал для исследования собирается в стерильную емкость после естественной дефекации (без применения слабительных средств или клизмы) из последних порций утреннего кала в объеме 10 гр. и доставляется в лабораторию в течение 1-2 часов, не допуская переохлаждения или перегрева материала. После курса антибиотикотерапии или приема препаратов для коррекции микрофлоры кишечника должно пройти не менее 7 дней. За 3 дня до исследования исключить из рациона бобовые (горох, фасоль), капусту, черный хлеб и другие газообразующие продукты. При запорах можно использовать чернослив, свеклу.

Исследование отделяемого влагалища на вагинальный дисбиоз (БИ003)

Нельзя сдавать мазок во время менструации, сразу после любого диагностического и лечебного вмешательства во влагалище или в течение 3-х дней после этого, во время приема внутрь антибиотиков или противовирусных препаратов. Провести тщательный туалет наружных половых органов.

Бактериологическое исследование кала на возбудители дизентерии, сальмонеллеза (БИ004)

Утренний кал для исследования собирается в стерильную емкость после естественной дефекации (без применения слабительных средств или клизмы) из последних порций утреннего кала в объеме 10 гр. и доставляется в лабораторию в течение 1-2 часов, не допуская переохлаждения или перегрева материала.

Бактериологическое исследование кала на условную и условно-патогенную флору (БИ005)

Собирается утренний кал для исследования в стерильную емкость после естественной дефекации (без применения слабительных средств или клизмы) в объеме, не менее 10 гр. и доставляется в лабораторию в течение 1-2 часов, не допуская переохлаждения или перегрева материала. Банку можно приобрести в ВДЦ. После курса антибиотикотерапии или приема препаратов для коррекции микрофлоры кишечника должно пройти не менее 7 дней.

Бактериологическое исследование отделяемого из зева на стафилококк (БИ006)

Взятие материала проводится до приема антибактериальных лекарственных препаратов. Должно пройти не менее 4-х часов после чистки зубов, приема пищи, питья, жевательной резинки.

Бактериологическое исследование отделяемого из носа на стафилококк (БИ007)

Взятие материала проводится до умывания или промывания предполагаемой области.

Бактериологическое исследование биологическое материала на золотистый стафилококк (мазок, моча, грудное молоко, сперма и т. д.) с определением антибиотикочувствительности к выделенному микроорганизму (БИ008)

1. Из влагалища, цервикального канала:

Нельзя сдавать мазок во время менструации, сразу после любого диагностического и лечебного вмешательства во влагалище или в течение 3-х дней после этого, во время приема внутрь антибиотиков или противовирусных препаратов. Провести тщательный туалет наружных половых органов.

2. Из уретры:

Перед взятием материала должно пройти не менее 4-х часов от последнего мочеиспускания. Провести тщательный туалет наружных половых органов.

3. Из зева:

Взятие материала проводится до приема антибактериальных лекарственных препаратов. Должно пройти не менее 4-х часов после чистки зубов, приема пищи, питья, жевательной резинки.

4. Из пазух носа, уха, глаза, раневой поверхности:

Взятие материала проводится до умывания, перевязки или промывания предполагаемой области. Очаг (рана) вскрывается врачом в стерильных условиях (операционной)!

5. Бакпосев грудного молока:

Тщательно вымыть кипяченой водой с мылом руки и грудь, осушить их салфетками. Руки, соски и околососковую область обрабатывают 70% спиртом. Первую порцию молока сцедить на салфетку. Затем аккуратно, не прикасаясь грудью или руками к внутренней поверхности стерильной емкости и крышки сцедить туда молоко не менее 10 мл. Материал при комнатной температуре в течение 1-2-х часов доставляется в лабораторию.

С каждой молочной железы (груди) биоматериал собирается в отдельную стерильную емкость. И, при необходимости (если сдаётся биоматериал с 2-х молочных желёз), ёмкость подписывается соответственно (левая, правая).

6. Бакпосев мочи:

Утренняя моча собирается в стерильную емкость. Перед тем как собрать мочу, необходимо тщательно вымыть кипяченой водой с мылом наружные половые органы, осушить их салфетками. После этого открыть баночку, не прикасаясь к внутренней поверхности баночки и крышки, выделить первую порцию мочи в унитаз или судно на счет «1» — «2». Задержать мочеиспускание, подставить баночку и выделить в нее не менее 10 мл мочи, остальное выделить в унитаз или судно. Доставить материал при комнатной температуре в течение 1-2 часов в лабораторию.

Бактериологическое исследование отделяемого из зева на дифтерию (БИ009)

Взятие материала проводится до приема антибактериальных лекарственных препаратов. Должно пройти не менее 4-х часов после чистки зубов, приема пищи, питья, жевательной резинки.

Бактериологическое исследование отделяемого из носа на дифтерию (БИ010)

Взятие материала проводится до умывания, перевязки или промывания предполагаемой области.

Исследование крови на стерильность (БИ011)

Специальная подготовка не требуется. Рекомендуется взятие крови не ранее чем через 4 часа после последнего приема пищи.

Исследование крови на гемокультуру (БИ012)

Специальная подготовка не требуется. Рекомендуется взятие крови не ранее чем через 4 часа после последнего приема пищи.

Бактериологическое исследование на грибы рода Кандида (БИ013)

1. Из влагалища, цервикального канала:

Нельзя сдавать мазок во время менструации, сразу после любого диагностического и лечебного вмешательства во влагалище или в течение 3 дней после этого, во время приема внутрь антибиотиков или противовирусных препаратов. Провести тщательный туалет наружных половых органов.

2. Из уретры:

Перед взятием материала должно пройти не менее 4 часов от последнего мочеиспускания. Провести тщательный туалет наружных половых органов.

3. Из зева:

Взятие материала проводится до приема антибактериальных лекарственных препаратов. Должно пройти не менее 4 часов после чистки зубов, приема пищи, питья, жевательной резинки.

4. Из пазух носа, уха, глаза, раневой поверхности:

Взятие материала проводится до умывания, перевязки или промывания предполагаемой области.

Посев на флору — Цены на процедуры в Москве

Посев на флору с определением чувствительности к антибиотикам – это микробиологический анализ высокой точности, проводящийся в условиях лаборатории. В благоприятную среду помещается биоматериал, в котором развиваются патогенные микроорганизмы. В настоящее время многие современные клиники предлагают такую услугу, в том числе и мы, «Доктор 2000».

Биоматериалом может быть не только микрофлора влагалища, но и мокрота, сперма, грудное молоко, желчь, секрет простаты. Этот анализ дает развернутую картину, имеет приемлемую стоимость и достаточно прост в выполнении. При помощи такого исследования специалист видит полную клиническую картину заболевания пациента, что дает ему возможность поставить правильный диагноз и определить, какую группу антибиотиков назначать для последующего лечения.

Фармакология не стоит на месте, и ассортимент антибиотиков велик, поэтому выделяют два основных способа определения чувствительности:
— к основному спектру антибиотиков;
— к развернутому спектру антибиотиков.

При помощи этой несложной процедуры происходит обнаружение таких микроорганизмов, как стафилококки, стрептококки, энтерококки, неферментирующие бактерии, энтеробактерии. Посев очень важен, так как лечащий врач должен непременно знать, какие именно антибиотики успешно справятся с течением болезни. Именно поэтому наличие аллергии на препарат не принесет должного результата.

Во время анализа просматривается, как биоматериал реагирует на тот или иной вид антибиотика, подавляются ли микроорганизмы предписанными дозами препарата или они остаются устойчивы к его воздействию. От этого во многом зависит правильный подход к локализации очага болезни.

Можно сделать вывод, что посев на флору необходим для установления возбудителя инфекции и подбора надлежащего препарата. Эта мера необходима для того, чтобы в случае нерезультативности предыдущего курса лечения выявить его причину.

Если в результатах вашего анализа вы видите латинскую букву R – это говорит о том, что биоматериал устойчив к действию антибиотика. Если же стоит буква S, значит, был проведен результативный курс лечения.

В заключении нужно отметить, что посев на флору с определением чувствительности к антибиотикам – это лучшее исследование, которое можно провести для правильной постановки диагноза. Он является гарантом не только точной диагностики, но и определяет группу антибиотиков, которые хорошо воспринимает организм пациента.

Бактериологический посев (бакпосев) — Клиника 1

Для наиболее точного диагностирования заболеваний недостаточно самого современного лабораторного оборудования. Точность результатов зависит не только от используемых реактивов и аппаратуры, но и от времени и правильности сбора исследуемого материала. При несоблюдении основных правил подготовки к анализам их результаты могут быть значительно искажены.

В бактериологической лаборатории проводятся исследования для обнаружения в клиническом материале микроорганизмов, являющихся возбудителями гнойно-воспалительных и инфекционных заболеваний, а также определение чувствительности микроорганизмов к антибактериальным и антимикотическим средствам, лечебным фагам.

В качестве клинического (биологического) материала используются: кровь, желчь, моча, грудное молоко, отделяемое верхних и нижних дыхательных путей, отделяемое инфицированных ран, отделяемое глаз, отделяемое ушей, отделяемое половых органов, содержимое пустул, полостей, кал. Выявляется 996 видов микроорганизмов (бактерии, дрожжеподобные грибы, грибы), имеющих диагностическое (медицинское) значение.

Кроме того выполняются отдельные методики: микробиологическое исследование кала на наличие дисбактериоза; бактериологическое исследование кала на наличие патогенных энтеробактерий; микробиологическое исследование отделяемого влагалища на дисбиоз, бактериологическое исследование на наличие Gardnerella vaginalis.

Комплексное исследование основных инфекций урогенитального тракта Бакпосев Ureaplasma spp. Бакпосев Mycoplasma hominis Бакпосев Gardnerella vaginalis Бакпосев Trichomonas vaginalis Чувствительность Ureaplasma spp. Чувствительность Mycoplasma hominis Бакпосев на флору и чувствительность к антибиотикам — из НОСА Бакпосев на флору и чувствительность к антибиотикам — из ЗЕВА Бакпосев на флору и чувствительность к антибиотикам — из СЛИЗИСТОЙ ГЛАЗА Бакпосев на флору и чувствительность к антибиотикам (отделяемое влагалища) Бакпосев на флору и чувствительность к антибиотикам — из ЦЕРВИКАЛЬНОГО КАНАЛА Бакпосев на флору и чувствительность к антибиотикам — из УРЕТРЫ Бакпосев на флору и чувствительность к антибиотикам — из МОЧИ Бакпосев на флору и чувствительность к антибиотикам — из МОЧИ (cito) Бакпосев на флору и чувствительность к антибиотикам — из СПЕРМЫ Бакпосев на флору и чувствительность к антибиотикам — из СЕКРЕТА ПРЕДСТ. ЖЕЛЕЗЫ Бакпосев на флору и чувствительность к антибиотикам — из КРОВИ Бакпосев на флору и чувствительность к антибиотикам — из МОКРОТЫ Бакпосев на флору и чувствительность к антибиотикам Микробиологический метод исследования грибов рода Candida с определением чувствительности к антимикотикам Дисбиоз влагалища Исследование биоматериала на наличие анаэробной микрофлоры (содержимое кист, полостей, закрытых ран) Бакпосев на золотистый стафилококк (Staphylococcus aureus) и определение чувствительности к антибиотикам Посев на гемофильную палочку (Haemphylus influenrae) и определение чувствительности к антибиотикам Исследование кала на скрытую кровь Анализ кала на дисбактериоз Кал на яйца/глистов (гельминтов) Скрытая кровь в кале, количественно (метод FOB Gold)

Как сдать материал на бактериологическое исследование -Лаборатории, параклиники

Как сдать материал на бактериологическое исследование

Бактериологическая лаборатория
-пациентам: как сдать материал на бактериологическое исследование

Общие требования к сбору и транспортировке проб биологического материала для бактериологического исследования:

  • Пробы необходимо собирать до начала антибактериальной терапии, при отсутствии такой возможности – посредственно перед повторным приемом (введением) препарата.
  • Пробы необходимо собирать с минимальным загрязнением материала нормальной микрофлорой, т.к. её наличие приводит к ошибочной трактовке результата
  • Пробы необходимо собирать в стерильную одноразовую посуду, предназначенную для бактериологических исследований. Недопустимо мыть стерильный контейнер перед использованием!
  • При сборе и транспортировке пробы не загрязнять наружную поверхность посуды и сопроводительные документы (направления)
  • Собранные пробы доставляют в лабораторию не позднее 2-х часов с момента сбора, в случае использования транспортной системы (стерильная пробирка с транспортной средой и тампоном, стерильно упакованным вместе с пробиркой) – в течение 48-72 часов.

ВНИМАНИЕ!

Несоблюдение правил может привести к необходимости повторной сдачи анализа или неправильной трактовке результата

Посуда, используемая для транспортировки проб в бактериологическую лабораторию

Направление в бактериологическую лабораторию ГКБ №15 им. О.М.Филатова на бактериологическое исследование (бак. посев)
Копия страхового полиса

Посуда, используемая для транспортировки проб в бактериологическую лабораторию

Вид исследования

Посуда

Материал собирает пациент самостоятельно

бактериологическое исследование мочи с определением степени бактериурии

стерильный одноразовый контейнер

бактериологическое исследование кала на патогенную кишечную флору

стерильный одноразовый контейнер с вмонтированной в крышку ложечкой

бактериологическое исследование кала на дисбактериоз

стерильный одноразовый контейнер с вмонтированной в крышку ложечкой

бактериологическое исследование мокроты

стерильный одноразовый контейнер

бактериологическое исследование грудного молока

стерильный одноразовый контейнер

качественное определение антигена Helicobacter pylori в фекалиях человека

Стерильный одноразовый контейнер с вмонтированной в крышку ложечкой

качественное определение антигенов токсинов А и В Clostridium difficile в фекалиях человека

стерильный одноразовый контейнер с вмонтированной в крышку ложечкой

Материал забирает специалист в медицинском учреждении

бактериологическое исследование отделяемого из различных очагов воспаления:, отиты, синуситы, отделяемое ран и др.

стерильная пробирка с транспортной средой и тампоном, стерильно упакованным вместе с пробиркой

бактериологическое исследование пунктатов, выпотов, экссудатов

стерильный одноразовый контейнер,

стерильная пробирка с транспортной средой и тампоном, стерильно упакованным вместе с пробиркой

бактериологическое исследование отделяемого слизистой оболочки зева и носа на условно патогенную микрофлору

стерильная пробирка с транспортной средой и тампоном, стерильно упакованным вместе с пробиркой

Бактериологическое исследование отделяемого слизистой оболочки зева и носа на золотистый стафилококк (S.aureus)

стерильная пробирка с транспортной средой и тампоном, стерильно упакованным вместе с пробиркой

бактериологическое исследование отделяемого половых органов на условно патогенную микрофлору

стерильная пробирка с транспортной средой и тампоном, стерильно упакованным вместе с пробиркой

бактериологическое исследование отделяемого конъюнктивы

стерильная пробирка с транспортной средой и тампоном, стерильно упакованным вместе с пробиркой

Правила сбора биологических материалов, собираемых пациентами самостоятельно

МОЧА

  • Перед сбором пробы необходимо тщательно промыть наружные половые органы и область заднего прохода теплой водой с мылом.
  • Не допускается использование дезинфектантов для проведения обработки.
  • Не допускается собирать мочу с постельного белья, из мочеприемника или судна.
  • Для анализа следует собирать среднюю порцию утренней мочи. Начать мочеиспускание в унитаз, среднюю порцию собрать в стерильный одноразовый контейнер в количестве 10-20 мл, закончить мочеиспускание в унитаз.
  • Пробу необходимо доставить в лабораторию не позднее 2 часов с момента сбора.

ФЕКАЛИИ

  • Собирать фекалии для исследования следует утром.
  • Дефекацию производят в сухую чистую, предварительно продезинфицированную ёмкость. Важно тщательно удалить дезинфектанты с поверхности емкости, ополоснуть кипятком и охладить до комнатной температуры.
  • Перенести пробу кала 3-4 ложечки (1,5-2,0 г) в стерильный одноразовый контейнер при помощи вмонтированного в его крышку стерильного шпателя-ложечки. При наличии в испражнении патологических примесей – гной, слизь, кровь, хлопья – их необходимо включить в отбираемую пробу. — Если фекалии жидкие, контейнер заполняют не более чем на 1/3 объема.
  • У реанимационных больных, маленьких детей допускается собирать материал со стерильной сухой пеленки, не касаясь ткани.
  • Не допускать попадания в пробу кала мочи или воды.
  • Пробу доставляют в лабораторию не позднее 2-х часов с момента сбора. В случае крайней необходимости (невозможности получить утреннюю пробу), допустимо оставить материал, полученный накануне во время вечерней дефекации, в холодильнике, и доставить его в лабораторию утром.
  • Внимание! При назначении анализа кала на определение антигена токсинов Clostridium difficile исследованию подлежит только жидкий стул.

МОКРОТА

  • Перед сбором мокроты пациент должен почистить зубы и прополоскать рот и горло теплой кипяченой водой.
  • Важно, чтобы в контейнер не попало содержимое носоглотки или слюни.
  • Пробу мокроты, полученную в результате глубокого кашля, собирают в стерильный одноразовый контейнер с завинчивающейся крышкой.
  • Пробу доставляют в лабораторию не позднее 2-х часов с момента сбора.

ГРУДНОЕ МОЛОКО

  • При сцеживании молока женщина моет руки с мылом и тщательно обрабатывает соски и околососковую область отдельными смоченными 700 спиртом ватными тампонами.
  • Молоко из правой и левой молочных желез исследуется отдельно.
  • Первые 5-10 мл молока выливаются, последующие 3-4 мл сцеживаются в стерильный одноразовый контейнер.
  • Пробы доставляют в лабораторию в сроки не более 3 часов до момента исследования.
  • Молоко, сцеженное накануне, исследованию не подлежит.

Стерильные одноразовые контейнеры для бактериологических исследований приобретаются самостоятельно в аптеках.

В бактериологической лаборатории проводится бактериологическое исследование других биологических материалов, которые забирает специалист в медицинских учреждениях.

Время приема биологического материала на бактериологическое исследование:

понедельник-пятница
8. 30-10.00
Тел. 8 (495) 375-12-24

Главный корпус больницы, центральный вход, справа от справочной

При сдаче материала на исследование необходимо при себе иметь документы:

  1. Направление в бактериологическую лабораторию ГКБ №15 им. О.М.Филатова на бактериологическое исследование (бак. посев)
  2. Копия страхового полиса

Бактериологические методы культивирования — Микробиология: лабораторный опыт

Рождение бактериологии

Хотя бактерии, возможно, наиболее известны нам как причина болезней человека, на самом деле они должны быть гораздо более известны своим положительным вкладом, чем своим отрицательным. Ниже перечислите три положительных фактора, которые бактерии делают для вас.

  1. ______________________________________________________________________
  2. ______________________________________________________________________
  3. ______________________________________________________________________

Бактерии были впервые обнаружены Антоном фон Левенгук в конце 17 века, но не стали объектами серьезных научных исследований до 19 века, когда стало очевидно, что некоторые виды вызывают болезни человека. Методы, разработанные Робертом Кохом, Луи Пастером и их соратниками во время «Золотого века» микробиологии, который охватил период с середины 1800-х до начала 1900-х годов, все еще широко используются сегодня. Большинство из этих методов предполагало выделение отдельных бактерий, происходящих из природного источника (например, от больного животного или человека), и их культивирование в искусственной среде в виде чистой культуры для облегчения дополнительных исследований.

В середине двадцатого века, когда мы считали, что победили их в их болезнетворной игре, бактерии стали популярными объектами эмпирических исследований в таких областях, как генетика, генная инженерия и биохимия.С развитием устойчивых к антибиотикам штаммов и расширением наших знаний о стратегиях скрытых атак бактерий, таких как биопленки и внутриклеточный рост, медицинские исследователи переориентировали свое внимание на болезнетворные бактерии и ищут новые способы победить их.

Выращивание бактерий в чистой культуре до сих пор остается одним из наиболее широко используемых методов в микробиологии. Многие бактерии, особенно те, которые вызывают заболевания и которые используются в научных исследованиях, являются гетеротрофными, что означает, что они полагаются на органические соединения в качестве пищи, чтобы обеспечить энергию и углерод.Некоторым бактериям также требуются дополнительные пищевые компоненты, такие как витамины, в своем рационе. Должна быть создана соответствующая физическая среда, в которой контролируются и поддерживаются такие важные факторы, как температура, pH и концентрация атмосферных газов (особенно кислорода).

Питательные потребности бактерий могут быть удовлетворены с помощью специализированных микробиологических сред, которые обычно содержат экстракты белков (в качестве источника углерода и азота), неорганические соли, такие как фосфат калия или сульфат натрия, и в некоторых случаях углеводы, такие как глюкоза или лактоза. .Для привередливых бактерий (то есть привередливых в еде) также необходимо добавить витамины и / или другие факторы роста.

Рис. 1. Различные типы культивирования

Бактериологические культуральные среды могут быть приготовлены в виде жидкости (бульон), твердого вещества (среда для планшетов или наклонная среда) или полутвердого вещества (глубина), как показано на рисунке 1. Твердые и полутвердые. твердые среды содержат отвердитель, такой как агар или желатин. Агар, представляющий собой полисахарид, полученный из красных морских водорослей ( Rhodophyceae ), является предпочтительным, поскольку он является инертным, непитательным веществом.Агар обеспечивает прочную поверхность для роста бактерий, на которой бактерии размножаются до тех пор, пока не образуются характерные комочки клеток, которые мы называем колониями.

Кох, Пастер и их коллеги в 19-м и начале 20-го веков создали составы сред, которые содержали коровий мозг, картофель, сено и все виды других заманчивых микробных пищевых продуктов. Сегодня препараты бактериологической среды можно приобрести в порошкообразной форме, поэтому все, что нужно сделать разработчику, — это отмерить правильное количество, добавить нужное количество воды и перемешать. После приготовления основной формулы среда стерилизуется в автоклаве, который производит пар под давлением и достигает температуры выше кипения. Когда стерилизованная среда остынет, ее можно использовать.

Выращивание бактерий в культуре

Популяция бактерий, выращенная в лаборатории, называется культурой . чистый культура содержит только один единственный тип; смешанная культура содержит две или более разных бактерий.Если бактериальная культура остается в той же среде слишком долго, клетки израсходуют доступные питательные вещества, выделяют токсичные метаболиты, и в конечном итоге вся популяция погибнет. Таким образом, бактериальные культуры необходимо периодически переносить или субкультивировать в новые среды для поддержания роста бактериальной популяции.

Микробиологи используют методы субкультивирования для выращивания и поддержания бактериальных культур, для проверки культур на чистоту или морфологию или для определения количества жизнеспособных организмов. В клинических лабораториях субкультивирование используется для получения чистой культуры инфекционного агента, а также для исследований, ведущих к идентификации возбудителя. Поскольку бактерии могут жить практически где угодно, этапы субкультивирования должны выполняться асептически, , чтобы гарантировать, что нежелательное бактериальное или грибковое заражение не попадет в важную культуру.

В микробиологии асептические методы по существу требуют только здравого смысла и хороших лабораторных навыков. Во-первых, учтите, что каждая поверхность, к которой вы прикасаетесь, и воздух, которым вы дышите, могут быть загрязнены микроорганизмами.Затем подумайте о шагах, которые вы можете предпринять, чтобы свести к минимуму воздействие нежелательных невидимых злоумышленников. Вам также следует подумать о том, как предотвратить заражение ваших бактериальных культур бактериями из окружающей среды (включая вас).

Чтобы поддерживать асептическую рабочую среду, все, с чем вы работаете, изначально не должно содержать микробов. Таким образом, мы начинаем с предварительно стерилизованных пипеток, культуральных пробирок и стеклянной посуды. Инокуляционные петли и иглы из металлической проволоки можно использовать для переноса бактерий из одной среды в другую, например, с поверхности чашки с агаром в бульон.Металлические инструменты можно стерилизовать, нагревая их в пламени горелки Бунзена. Стеклянные инструменты, металлические расширители или щипцы, которые нельзя стерилизовать прямым нагревом, окунают в спирт с последующим коротким пропусканием через пламя для ускорения процесса испарения. Стандартные асептические методы, используемые для культивирования бактерий, будут продемонстрированы в начале лаборатории.

Рис. 2. Колонии на чашке с агаром

Одним из очень важных методов в микробиологии является выделение одного типа бактерий из источника, в котором их много.Наиболее эффективный способ сделать это — метод streak plate , который разбавляет отдельные клетки, распределяя их по поверхности чашки с агаром (см. Рисунок 2). Одиночные клетки воспроизводят и создают миллионы клонов, которые накапливаются поверх исходной клетки. Груды бактериальных клеток, наблюдаемые после инкубационного периода, называются колониями . Каждая колония представляет собой потомков одной бактериальной клетки, и поэтому все клетки в колониях являются клонами.Следовательно, когда вы переносите одну колонию с планшета на новую среду, вы получаете чистую культуру только с одним типом бактерий.

Разные бактерии дают начало колониям, которые могут сильно отличаться от бактерий, создавших их. Следовательно, полезным предварительным шагом в идентификации бактерий является изучение характеристики, называемой колониальной морфологии , которая определяется как появление колоний на чашке с агаром или скошенной поверхности.В идеале эти определения должны производиться по одной колонии; однако, если рост колоний более обильный и единичные колонии отсутствуют, все же возможно описание некоторых колониальных характеристик, таких как текстура и цвет роста бактерий.

Описание морфологии колоний бактерий

Посмотрев внимательно на рост колоний на поверхности твердой среды, можно описать такие характеристики, как текстура поверхности, прозрачность, а также цвет или оттенок роста.Следующие три характеристики очевидны независимо от того, смотрите ли вы на отдельную бактериальную колонию или на более плотный рост, без помощи какого-либо увеличительного устройства.

Текстура — описывает, как выглядит поверхность колонии. Общие термины, используемые для описания текстуры, могут включать гладкую, блестящую, слизистую, слизистую, сухую, порошкообразную, шелушащуюся и т. Д.

Прозрачность — колонии могут быть прозрачными (вы можете видеть сквозь них), полупрозрачными (через них проходит свет) или непрозрачными (они выглядят сплошными).

Цвет или Пигментация — многие бактерии производят внутриклеточные пигменты, которые заставляют их колонии приобретать отчетливый цвет, например желтый, розовый, фиолетовый или красный. Многие бактерии не производят пигмента и выглядят белыми или серыми.

Рисунок 3. Бактериологические описания морфологии колоний

По мере увеличения численности бактериальной популяции колонии становятся больше и начинают принимать форму или форму. Они могут быть весьма различимыми и обеспечивать хороший способ отличить колонии друг от друга, если они похожи по цвету или текстуре.Следующие три характеристики могут быть описаны для бактерий, когда можно наблюдать одну отдельную колонию. Может быть полезно использовать увеличительное приспособление, такое как счетчик колоний или препаровальный микроскоп, чтобы рассмотреть колонии крупным планом. Следует описать колонии в отношении их общего размера, формы или формы, того, как выглядят края колонии крупным планом (край или граница колонии), и как колония выглядит, когда вы наблюдаете за ней сбоку ( высота).

На рис. 4 крупным планом показаны колонии, растущие на поверхности чашки с агаром.В этом примере различия между двумя бактериями очевидны, потому что каждая имеет отличительную колониальную морфологию.

Рисунок 4. Два разных типа бактериальных колоний на чашке с агаром.

Используя термины микробиологии, полностью опишите колониальную морфологию двух колоний, показанных выше. Полное описание будет включать текстуру, прозрачность, цвет и форму (размер, общую форму, поля и высоту).

Теперь опишите морфологию колоний Micrococcus luteus , используя пластинчатую культуру этой бактерии TSA, предоставленную вашей группе в начале лаборатории:

Размер: ___________________________________________________________________

Текстура: ________________________________________________________________

Прозрачность: ___________________________________________________________

Пигментация: ___________________________________________________________

Форма (форма, поля, возвышение): ____________________________________________

Рекомендации по работе с носителями

Питательная среда должна содержать достаточное количество питательных веществ для поддержки роста бактерий. Как минимум, сюда входят органические соединения, которые могут обеспечить строительные блоки, необходимые для клеточного воспроизводства. Во многих случаях предварительно переваренный белок, такой как гидролизованный соевый белок, служит этой цели и поддерживает рост множества различных бактерий. Эти составы сред обычно называют комплексными средами , чтобы указать, что это смесь со многими компонентами.

Многие среды содержат дополнительные вещества, такие как антибиотик, который может быть селективным, для определенного типа бактерий, подавляя большинство или все другие типы. Дифференциальная среда будет содержать дополнительные соединения, которые позволят нам различать типы бактерий на основе различий в моделях роста. В конечном итоге мы будем использовать селективные и дифференциальные среды в наших экспериментах, но цель этой лаборатории — изучить основные методы культивирования, и поэтому в качестве среды будет использоваться триптическая соевая среда, сложная среда, в состав которой входит гидролизованный соевый белок.

Среды, которые вы будете использовать в этой лаборатории и во всех будущих лабораториях, будут уже подготовлены, но для вас, как начинающего микробиолога, важно понимать и ценить, как готовятся питательные среды.Имея это в виду, ваш инструктор может попросить вас посмотреть короткое видео, демонстрирующее искусство создания мультимедиа.

Рисунок 5. Градуированные пипетки для перекачки жидкостей

Жидкие среды

Предварительно стерилизованные стеклянные или пластиковые градуированные пипетки (рис. 5) используются для точного переноса определенных объемов стерильных жидкостей. Важно, чтобы вы научились правильно пользоваться этими инструментами, поскольку может потребоваться перенос стерильных, а иногда и загрязненных жидкостей между различными бутылками и пробирками.Их правильное использование будет обсуждено и продемонстрировано в лаборатории. Несколько советов, которые следует запомнить:

  • Пипетка и среда стерильны; ни в коем случае нельзя допускать прямого контакта с вашими руками, кожей или лабораторными поверхностями.
  • Крышки пробирок и бутылок нельзя ставить на лабораторные поверхности.
  • Пробирки или флаконы во время переноса следует держать под углом, чтобы свести к минимуму возможность попадания переносимых по воздуху загрязняющих веществ в отверстие.
  • Кратковременное пропускание отверстия пробирки или бутылки через пламя до и после процесса переноса будет препятствовать попаданию переносимых по воздуху загрязняющих веществ в стерильную жидкость.
Рисунок 6. Измерение объема
Дозатор:
  • Возьмите воду в небольшой химический стакан, стерильную градуированную пипетку на 10 мл и приспособление для пипетки (помпу). Найдите минутку, чтобы отметить деления на пипетке и понять, какой объем представляет каждая метка. Будет продемонстрировано использование пипетки для переноса жидкостей. Перед тем, как пробовать пипетку стерильной жидкости, потренируйтесь набирать 5 мл воды из стакана и спускать ее обратно в стакан с шагом 1 мл.Продолжайте, пока не почувствуете себя комфортно, держа пипетку и помпу. Затем повторите это снова с водой в закрытом флаконе со средой, используя асептические методы.

Часть градуированной пипетки на 10 мл показана на рисунке 6. Каков объем жидкости в этой пипетке?

Объем: ________________________________

Твердые и полутвердые носители

Выращивание культур бактерий на твердой среде (чашке с агаром или скошенной среде) позволяет нам просматривать и идентифицировать колониальные характеристики, а также обеспечивает способ разделения бактерий в смешанной культуре.Культуры, выращенные на чашках с агаром, обычно не выживают долго, так как крышки чашек Петри не плотно прилегают, а среда (и бактерии) обезвоживаются. С культурами, выращенными на чашках с агаром, всегда следует обращаться «снизу вверх», чтобы предотвратить попадание конденсата, который часто накапливается на крышке чашки во время инкубации, на культуру.

Бактерии можно выращивать в скошенной среде агара или в пробирках, если цель состоит в том, чтобы поддерживать их в более длительной культуре. Как правило, бактерии, выросшие на наклонных участках, сохраняют жизнеспособность от нескольких недель до нескольких месяцев, а иногда и дольше, если они хранятся в холодильнике.

В этой лаборатории вы познакомитесь с асептическими методами и базовыми лабораторными навыками, необходимыми для выращивания и поддержания бактерий в культуре. Вы будете часто применять эти навыки, поэтому мастерство очень важно.

Волонтер из вашего лабораторного стенда должен получить по одной из следующих культур:

  • TSA штриховая культура на пластине Micrococcus luteus и Enterococcus faecalis

Какие уровни защиты BSL следует использовать?

М . лютеус __________________

Е . faecalis __________________

  • «Смешанная культура» в TSB, содержащая две разные бактерии

Ниже напишите названия двух бактерий в смешанной культуре и соответствующий BSL, как указано вашим инструктором:

Бактерия смешанная культура 1 ____________________________________________________

Бактерия смешанная культура 2 ____________________________________________________

Необходимые методы сначала продемонстрирует ваш инструктор. После демонстрации выполните следующие задачи и запишите свои наблюдения / результаты.

Субкультура бульона

Получите 2 стерильные стеклянные пробирки для культивирования, бутылку с триптическим соевым бульоном (TSB) и штатив для пробирок. Небольшими кусочками цветной ленты пометьте каждую пробирку своим именем и буквой «S» для субкультуры или буквой «C» для контроля. Используя асептическую технику, с помощью градуированной пипетки на 10 мл перенесите по 2 мл бульона в каждую пробирку.

Как показано, используйте стерилизованную пламенем инокуляционную петлю для снятия с поверхности M . luteus штриховую культуру на пластине, отдельную колонию (если она малая) или часть колонии (если большая) и перенесите ее в бульон в пробирке, помеченной буквой «S.» Ничего не добавляйте во вторую пробирку «C», которая будет служить контролем стерильности. Обратите внимание на то, как бульоны выглядят сразу после их инокуляции (они все равно должны выглядеть в основном прозрачными). На рост бактерий в бульонах указывает появление мутности. Если только что инокулированный бульон вначале выглядит мутным, у вас не будет возможности определить, вызвано ли это ростом бактерий во время инкубационного периода.Если ваш бульон выглядит мутным, откажитесь от него и приготовьте другой бульон с меньшим количеством бактерий.

Поместите субкультуры бульона в инкубатор при температуре и времени, указанном вашим инструктором.

Штриховая пластина

Разделение смешанной культуры на отдельные колонии, которые можно субкультивировать для получения чистых культур, зависит от того, насколько хорошо подготовлен планшет. Цель метода штриховой пластинки — разбавить клетки, распределив их по поверхности агара. Это выполняется поэтапно, как будет продемонстрировано в лаборатории, прежде чем вы попробуете это сами.

Используйте смоделированную поверхность агара ниже, чтобы потренировать рисунок полос с помощью ручки или карандаша.

Возьмите две чашки TSA и напишите свое имя на нижней половине (половина, содержащая среду) по краю и по кривой (так, чтобы надпись не скрывала ваш вид на колонии бактерий, когда они вырастут). Также напишите M . luteus на одной чашке (название бактерий, которые вы будете пересевать на эту чашку). С другой стороны, напишите «смешанный», чтобы указать, что вы пересеваете из бульона смешанной культуры в эту чашку.

Как показано, используйте стерилизованную петлю для посева, чтобы взять один M . luteus колонии (или части колонии) и переносят ее на поверхность чашки с агаром. Распределите бактерии примерно на четверть тарелки, край к краю. Рассмотрим этот шаг 1.

Подожгите петлю и охладите ее в агаре. Перекрывайте полоску шага 1 3-4 раза, чтобы удалить меньшее количество бактерий и распределить их по краю тарелки. Рассмотрим этот шаг 2.

Подожгите петлю и охладите ее в агаре. Перекрыть полоску шага 2 3-4 раза и распределить по поверхности. Продолжайте этот процесс, зажигая петлю между каждым шагом, пока не будет покрыта вся поверхность чашки с агаром.

После выполнения этого с помощью M . luteus культура для практики, повторите процесс с каплей смешанного культурального бульона, который вы перенесете в чашку с помощью стерильной петли для посева.

Поместите субкультуры на планшетах с полосами в инкубатор при температуре и времени, указанном вашим инструктором.

Косая субкультура

M . лютеус

Возьмите одну наклонную пробирку с TSA и пометьте ее небольшим кусочком ленты своим именем и культурой ( M . luteus ). Используя стерилизованную инокуляционную петлю , возьмите бактериальную колонию (или часть колонии) с поверхности чашки культуры M . luteus и засеять поверхность скошенного участка.Поместите наклонную субкультуру в инкубатор при температуре и времени, указанном вашим инструктором.

Укол или субкультура из глубокой трубки

E . faecalis

Возьмите одну колющую пробирку, содержащую полутвердый TSA, и промаркируйте ее с помощью небольшого куска ленты своим именем и названием культуры ( E . faecalis ). Используя стерилизованную посевную иглу , возьмите бактериальную колонию (или часть колонии) с поверхности чашки с культурой E . faecalis и засевают среду, воткнув иглу в центр агара в пробирке и нажав на нее до дна. Осторожно извлеките иглу и попытайтесь удалить ее, следуя той же линии укола, которую вы сделали, нажимая на иглу. Поместите субкультуру в инкубатор при температуре и времени, указанном вашим инструктором.

Примечание о температурах инкубации

Как вы узнаете, бактерии предпочитают температуры роста, при которых скорость их размножения максимальна.Все бактерии, с которыми мы работаем в лаборатории, являются мезофильными , что означает, что они растут при температуре 20–40 ° C. Однако некоторые предпочитают температуру тела (37 ° C), в то время как другие лучше всего растут при комнатной температуре (примерно 25 ° C). Эта лаборатория оснащена инкубаторами, рассчитанными на любую температуру.

Следует также учитывать, как долго вы планируете хранить свои культуры в инкубаторе. Выращивание культур при более высокой температуре может ускорить их рост, но также вызывает обезвоживание среды и более раннюю гибель бактерий в культуре.

Как правило, для бактерий , что растут лучше при тело температура , если вы собираетесь вернуться в лабораторию в течение 24–36 часов (настоятельно рекомендуется), а затем инкубируйте их при 37 ° C. Если вы не можете вернуться в лабораторию во время периода «открытой лаборатории», инкубируйте их при комнатной температуре или перенесите свои культуры в холодильник после того, как они вырастут, чтобы культура не вымерла до того, как вы сможете закончить свои эксперименты. .Бактерии, которые лучше всего растут при комнатной температуре, всегда следует инкубировать при комнатной температуре, и рост может занять немного больше времени.

Первичная культура из источника окружающей среды — вы!

Закончив знакомство с основными методами бактериологического культивирования, пришло время применить эти навыки. Сегодня начало проекта Человек Кожа Микробиом Проект , который начинается с первичного культивирования бактерий из вашей кожи на среде TSA.Важно, чтобы вы прочитали описание проекта (в следующей главе), чтобы понять цели и объем проекта.

Для начала вы возьмете образец со своей кожи. Ваше первое решение будет заключаться в том, какую часть вашей кожи вы хотите взять на пробу? Примечание. Допускаются ТОЛЬКО внешние поверхности кожи.

Возьмите стерильный тампон и пробирку со стерильной дистиллированной водой и пометьте чашку TSA своим именем и датой. Снимите упаковку с тампона и смочите стерильной водой в асептических условиях.

Тщательно протрите влажным тампоном взад и вперед участок кожи, который вы выбрали для пробы. Затем протрите тампоном примерно треть поверхности чашки с агаром TSA.

Стерилизуйте петлю для посева и завершите оставшуюся часть рисунка на пластине с полосами, используя петлю. Инкубируйте этот планшет при комнатной температуре до недели.

После инкубации проверьте, развились ли на планшете изолированные колонии. Если нет колоний или нет изолированных колоний, вам нужно будет сделать еще одну пластину для штриховки, посоветовавшись с вашим инструктором о том, как действовать.Если есть изолированные колонии, перенесите планшет в холодильник. Из этой тарелки вы в конечном итоге выберете одну единственную колонию и приготовите чистую культуру. Критерии выбора колонии и следующие шаги описаны в следующей главе «Проект микробиома кожи человека».

К полный лаборатория , бактерии в культуры до рост . Следовательно, , после наблюдений сделано ПОСЛЕ культур имеют было время до расти .

Наблюдения и результаты

Бульонные субкультуры

Посмотрите на пробирки для культивирования бульона и опишите, что вы ожидали увидеть, и как они выглядят с точки зрения того, насколько «мутными» они выглядят — помутнение является признаком роста бактерий.

Мутность бульона перед инкубацией Прогнозируемый внешний вид бульона после инкубации Фактический Внешний вид бульона после инкубации

M. luteus

субкультура («S»)

Контроль стерильности («C»)

Субкультуры штриховых пластин

Посмотрите на созданные вами субкультуры с штриховой пластиной.Проведите самооценку того, насколько хорошо вы выполнили технику. Вы надеетесь увидеть отдельные колонии, хорошо отделенные друг от друга. На планшете со смешанной культурой вы должны увидеть два совершенно разных типа колоний.

М . luteus штриховая пластина:

  • Хорошо ли разделены колонии?

  • Сколько разных типов колоний вы видите?

  • Полностью опишите колониальную морфологию бактерий на этой пластине:

Полоса плита смешанная культура :

  • Хорошо ли разделены колонии?

  • Не могли бы вы сделать чистую культуру обеих бактерий из этой чашки? Если вы думаете, что можете, пересейте одну колонию каждого типа на половину чашки TSA, разделив ее, проведя линию с маркером в нижней части чашки, как показано ниже.Инкубируйте чашку, а затем понаблюдайте, чтобы убедиться, что вы успешно разделили две бактерии в смешанной культуре на две чистые культуры. Используйте этот самоанализ, чтобы подумать об улучшениях, которые вы могли бы внести в технику, которую вы применили для создания штриховой пластины.

  • Полностью описать колониальную морфологию обеих бактерий из смешанной культуры:

Колония типа 1 Колония типа 2
Размер
Текстура
Прозрачность
Пигментация
Вся колония

наклонная субкультура TSA

Изучите субкультуру M . luteus вы приготовили на уклоне TSA.

  • Опишите текстуру , прозрачность , и пигментацию роста бактерий на скосе. Только эти характеристики могут быть описаны для косой культуры, так как не должно быть дискретных колоний на наклоне, только область плотного роста вдоль линии штрихов.

  • Соответствует ли ваше описание тому, что было отмечено для M . luteus колоний, когда вы описывали морфологию колоний ранее?

  • Видите ли вы доказательства присутствия каких-либо других типов бактерий (имеется в виду другая колониальная морфология) на склоне?

Субкультура TSA stab

Посмотрите внимательно на линию укола в носителе в трубке. Вы видите доказательства роста бактерий? Если да, опишите и / или зарисуйте, как это выглядит.

Полутвердый агар того типа, который использовался в этом упражнении, можно использовать как способ оценить, подвижна ли бактерия, что означает наличие одного или нескольких жгутиков, которые облегчают движение через жидкости или полутвердые вещества. Чтобы оценить подвижность, внимательно посмотрите на линию посева, созданную вами, когда пробирку проткнули. Неподвижные бактерии будут расти только вдоль линии укола. Если они подвижны, они смогут перемещаться через полутвердый агар (например, плавать через желе), и вы не сможете увидеть четкую линию в агаре — только облачность вокруг линии укола.

  • Основываясь на ваших наблюдениях за бактериями в культуре для укола, есть ли доказательства того, что бактерии подвижны?

  • Для бактерий способность двигаться (подвижность) требует, чтобы у них была определенная клеточная структура?

Культивирование бактерий | Безграничная микробиология

Средства массовой информации

Питательная среда — это пища, используемая для выращивания микробов и борьбы с ними.

Цели обучения

Классифицируйте питательные среды

Основные выводы

Ключевые моменты
  • Питательные среды содержат питательные вещества, необходимые для поддержания жизнедеятельности микробов.
  • Питательные среды могут различаться по многим ингредиентам, что позволяет выбирать среды для микробов или против них.
  • Глюкоза или глицерин часто используются в качестве источников углерода, а соли или нитраты аммония — в качестве источников неорганического азота в питательных средах.
Ключевые термины
  • культура : Процесс выращивания бактерии или другого биологического объекта в искусственной среде.
  • бульон для лизогении : бульон для лизогении (LB) является питательной средой; в основном используется для роста бактерий.

Микробиологические культуры

Культуральная среда или питательная среда — это жидкость или гель, предназначенные для поддержки роста микроорганизмов. Существуют разные типы сред, подходящие для выращивания разных типов клеток. Здесь мы обсудим микробиологические культуры, используемые для выращивания микробов, таких как бактерии или дрожжи.

ПИТАТЕЛЬНЫЕ БУМАГИ И АГАРОВЫЕ ТАРЕЛКИ

Это наиболее распространенные питательные среды, хотя иногда требуются специальные среды для роста микроорганизмов и культур клеток.Некоторые организмы, называемые привередливыми, нуждаются в специальной среде из-за сложных пищевых потребностей. Например, вирусы являются облигатными внутриклеточными паразитами и требуют среды для роста, содержащей живые клетки. Многие микробные патогены человека также требуют использования человеческих клеток или клеточных лизатов для роста на среде.

Наиболее распространенные питательные бульоны со средой для выращивания (жидкая питательная среда) или среда LB (бульон Lysogeny) являются жидкими. Их часто смешивают с агаром и разливают в чашки Петри для застывания.Эти чашки с агаром обеспечивают твердую среду, на которой можно культивировать микробы. Они остаются твердыми, так как очень немногие бактерии способны разлагать агар. Многие микробы также можно выращивать в жидких культурах, состоящих из жидких питательных сред без агара.

Микробный патоген, растущий на чашке с кровяным агаром : Красные кровяные тельца используются для изготовления чашки с агаром. На этих пластинах показаны различные патогены, которые могут использовать для роста эритроциты. Слева — стафилококк, а справа — стрептококк.

ОПРЕДЕЛЕННЫЕ ПРОТИВ НЕОПРЕДЕЛЕННЫХ СМИ

Это важное различие между типами питательной среды. Определенная среда будет иметь известные количества всех ингредиентов. Для микроорганизмов он обеспечивает микроэлементы и витамины, необходимые микробу, и особенно определенный источник углерода и азота. Глюкоза или глицерин часто используются в качестве источников углерода, а соли или нитраты аммония — в качестве источников неорганического азота. Среда undefined содержит некоторые сложные ингредиенты, такие как дрожжевой экстракт, который состоит из смеси многих, многих химических веществ в неизвестных пропорциях.Неопределенные среды иногда выбираются по цене, а иногда по необходимости — некоторые микроорганизмы никогда не культивировались на определенных средах.

Существует множество различных типов сред, которые можно использовать для выращивания определенных микробов и даже для стимулирования определенных клеточных процессов; такие как сусло, среда, которая является питательной средой для дрожжей, из которых делают пиво. Без сусла в определенных условиях брожение не может происходить, и пиво не будет содержать алкоголь и не будет газированным (пузырьковым).

ОБЩИЕ ШИРОКОЕ ОПИСАНИЕ КУЛЬТУРНЫХ СРЕДСТВ

Питательные среды — источник аминокислот и азота (например,г., говядина, дрожжевой экстракт). Это неопределенная среда, потому что источник аминокислот содержит множество соединений, точный состав которых неизвестен. Эти среды содержат все элементы, которые необходимы большинству бактерий для роста, и являются неизбирательными, поэтому они используются для общего культивирования и поддержания бактерий, хранящихся в коллекциях лабораторных культур.

Минимальная среда — Среда, которая содержит минимально возможное количество питательных веществ для роста колоний, как правило, без аминокислот, и часто используется микробиологами и генетиками для выращивания микроорганизмов «дикого типа».Эти среды также можно использовать для отбора за или против роста определенных микробов. Обычно о микробе необходимо знать достаточный объем информации, чтобы определить минимальные требования к среде обитания.

Селективная среда — Используется для роста только выбранных микроорганизмов. Например, если микроорганизм устойчив к определенному антибиотику, такому как ампициллин или тетрациклин, то этот антибиотик можно добавить в среду, чтобы предотвратить рост других клеток, не обладающих устойчивостью.

Дифференциальная среда — Также известная как индикаторная среда, используется для отличия одного типа микроорганизмов от другого, растущего на той же среде. Этот тип сред использует биохимические характеристики микроорганизма, растущего в присутствии определенных питательных веществ или индикаторов (таких как нейтральный красный, феноловый красный, эозин y или метиленовый синий), добавленных в среду, чтобы наглядно указать определяющие характеристики микроорганизма. Этот тип сред используется для обнаружения и идентификации микроорганизмов.

Эти несколько примеров общих типов носителей дают только некоторые указания; существует множество различных типов сред, которые можно использовать для выращивания микробов и борьбы с ними.

Сложные и синтетические среды

В определенных средах известны все химические соединения, а в неопределенных средах есть частично неизвестные химические составляющие.

Цели обучения

Дифференцирующие комплексные и синтетические среды

Основные выводы

Ключевые моменты
  • Defined media состоит из полностью понятных компонентов.
  • Неопределенный носитель, часть которого не полностью определена.
  • Присутствие экстрактов животных или других микробов делает среду неопределенной, поскольку весь химический состав экстрактов полностью не известен.
Ключевые термины
  • рекомбинантный : Этот термин относится к чему-то, образованному путем объединения существующих элементов в новую комбинацию. Таким образом, фраза «рекомбинантная ДНК» относится к организму, созданному в лаборатории путем добавления ДНК другого вида.
  • сыворотка : Прозрачная желтоватая жидкость, полученная при разделении цельной крови на твердые и жидкие компоненты после того, как она свернулась. Также называется сывороткой крови.

Существует много типов питательных сред, которые представляют собой пищу, на которой могут жить микробы. Два основных подтипа сред — это сложные и синтетические среды, известные как неопределенные и определенные среды.

Неопределенная среда : Бульон Лурии, как показано здесь, приготовлен из дрожжевого экстракта, поскольку дрожжевой экстракт не полностью химически определен, поэтому бульон Лурия является неопределенной средой.Автор Lilly_M [GFDL (http://www.gnu.org/copyleft/fdl.html), CC-BY-SA, через Wikimedia Commons

Неопределенная среда содержит несколько сложных ингредиентов, таких как дрожжевой экстракт или гидролизат казеина, которые состоят из смеси многих, многих химических веществ в неизвестных пропорциях. Неопределенные среды иногда выбираются на основании цены, а иногда и по необходимости — некоторые микроорганизмы никогда не культивировались на определенных средах. Определенная среда (также известная как среда определенного химического состава или синтетическая среда) — это среда, в которой все используемые химические вещества известны, нет присутствуют дрожжи, животные или растительные ткани.Среда определенного химического состава — это среда для выращивания, подходящая для культивирования микробов или клеток животных (включая человека), все химические компоненты которой известны. Термин «среда определенного химического состава» был определен Джейми и Смитом как «базальный состав, который также может не содержать белков и состоит исключительно из биохимически определенных низкомолекулярных компонентов.

Среда определенного химического состава не содержит компонентов животного происхождения (включая компоненты микробного происхождения, такие как дрожжевой экстракт) и представляет собой наиболее чистую и стабильную среду для культивирования клеток.По определению химически определенные среды не могут содержать фетальную бычью сыворотку, бычий сывороточный альбумин или человеческий сывороточный альбумин, поскольку эти продукты получены из бычьих или человеческих источников и содержат сложные смеси альбуминов и липидов. Термин «среда определенного химического состава» часто неправильно используется в литературе для обозначения среды, содержащей сывороточный альбумин. Сыворотка животного или альбумин обычно добавляется в питательные среды в качестве источника питательных веществ и других неопределенных факторов, несмотря на технические недостатки их включения и его высокую стоимость.Технические недостатки использования сыворотки включают неопределенный характер сыворотки, вариабельность состава от партии к партии и риск контаминации. Растут опасения по поводу страданий животных, причиненных во время сбора сыворотки, что добавляет этический императив — отказаться от использования сыворотки везде, где это возможно. Химически определенные среды отличаются от бессывороточных сред тем, что бычий сывороточный альбумин или человеческий сывороточный альбумин либо химически определенным рекомбинантным вариантом (в котором отсутствуют липиды, связанные с альбумином), либо синтетическим химическим веществом, таким как полимерный поливиниловый спирт, который может воспроизводить некоторые функции сыворотки.

Селективная и дифференциальная среда

Селективная среда позволяет выращивать определенные организмы, в то время как дифференциальная среда используется, чтобы отличить один организм от другого.

Цели обучения

Сравнение селективных и дифференциальных носителей

Основные выводы

Ключевые моменты
  • Селективная среда обычно выбирает рост желаемого организма, останавливая рост или полностью убивая нежелательные организмы.
  • Дифференциальная среда использует преимущества биохимических свойств организмов-мишеней, что часто приводит к видимым изменениям при росте организмов-мишеней.
  • Дифференциальная среда, в отличие от селективной, не убивает организмы. Он указывает, присутствует ли целевой организм.
Ключевые термины
  • рекомбинантный : Этот термин относится к чему-то, образованному путем объединения существующих элементов в новую комбинацию. Таким образом, фраза «рекомбинантная ДНК» относится к организму, созданному в лаборатории путем добавления ДНК другого вида.
  • ген : единица наследственности; сегмент ДНК или РНК, который передается от одного поколения к другому. Он несет генетическую информацию, такую ​​как последовательность аминокислот белка.
  • аллель : одна из множества альтернативных форм одного и того же гена, занимающая данное положение на хромосоме.

Существует множество типов сред, используемых для изучения микробов. Два типа носителей с одинаковыми подразумеваемыми именами, но очень разными функциями, называемые селективными и дифференциальными носителями, определяются следующим образом.

Селективные среды используются для роста только избранных микроорганизмов. Например, если микроорганизм устойчив к определенному антибиотику, такому как ампициллин или тетрациклин, то этот антибиотик можно добавить в среду, чтобы предотвратить рост других клеток, не обладающих устойчивостью. Среды, в которых отсутствует аминокислота, такая как пролин, в сочетании с E. coli, неспособной ее синтезировать, обычно использовались генетиками до появления геномики для картирования бактериальных хромосом.Среды для селективного роста также используются в культуре клеток для обеспечения выживания или пролиферации клеток с определенными свойствами, такими как устойчивость к антибиотикам или способность синтезировать определенный метаболит. Обычно присутствие определенного гена или аллеля гена придает клетке способность расти в селективной среде. В таких случаях ген называют маркером. Среда для селективного роста эукариотических клеток обычно содержит неомицин для отбора клеток, которые были успешно трансфицированы плазмидой, несущей ген устойчивости к неомицину в качестве маркера.Ганцикловир является исключением из правил, поскольку он используется для специфического уничтожения клеток, несущих соответствующий маркер, тимидинкиназу вируса простого герпеса (HSV TK). Некоторые примеры селективных сред включают:

Неселективная среда в сравнении с селективной. : Неселективная среда справа допускает рост нескольких различных видов бактерий и заросла бактериями (беловатые линии). В то время как пластина справа выборочно позволяет расти только бактериям Neisseria gonorrhoeae (белые точки).

  • Эозин метиленовый синий (EMB), содержащий метиленовый синий — токсичен для грамположительных бактерий, позволяя размножаться только грамотрицательным бактериям.
  • YM (дрожжи и плесень) с низким pH, сдерживающим рост бактерий.
  • Агар МакКонки для грамотрицательных бактерий.
  • Кишечный агар Hektoen (HE), который является селективным в отношении грамотрицательных бактерий.
  • Маннитовый солевой агар (MSA), который является селективным в отношении грамположительных бактерий и дифференциалом для маннита.
  • Terrific Broth (TB) используется с глицерином при культивировании рекомбинантных штаммов Escherichia coli.
  • Ксилозолизиндезоксисхолат (XLD), который является селективным в отношении агара с угольным дрожжевым экстрактом, забуференным грамотрицательными бактериями, который является селективным в отношении некоторых грамотрицательных бактерий, особенно Legionella pneumophila.

Дифференциальные среды или индикаторные среды позволяют отличить один тип микроорганизмов от другого, растущего на той же среде. Этот тип сред использует биохимические характеристики микроорганизма, растущего в присутствии определенных питательных веществ или индикаторов (таких как нейтральный красный, феноловый красный, эозин y или метиленовый синий), добавленных в среду, чтобы наглядно указать определяющие характеристики микроорганизма.Этот тип сред используется для обнаружения микроорганизмов и молекулярными биологами для обнаружения рекомбинантных штаммов бактерий. Примеры дифференциальных сред:

  • Кровяной агар (используется в стрептококковых тестах), содержащий кровь из сердца крупного рогатого скота, которая становится прозрачной в присутствии гемолитика.
  • Стрептококкозин метиленовый синий (EMB), дифференцированный для ферментации лактозы и сахарозы.
  • MacConkey (MCK), дифференцированный для ферментации лактозы, агар с солью маннита (MSA), дифференцированный для ферментации маннита.
  • планшетов X-gal, которые являются дифференциальными для мутантов lac-оперона.

Асептическая техника, планшеты для разбавления, полос и намазывания

Микробиологи полагаются на асептическую технику, разбавление, штриховку колоний и распространение планшетов в повседневных экспериментах.

Цели обучения

Вызов асептической техники, серии разбавления, планшеты для штриховки и распределения

Основные выводы

Ключевые моменты
  • Асептическая техника — это, по сути, установка на защиту вещей от загрязнений, поскольку в мире, в котором мы живем, очень много микробов, которые могут мешать экспериментам.
  • Штрихи колоний приводят к изоляции отдельных колоний, которые представляют собой группу микробов, происходящих от одного единственного зеркала-предшественника.
  • Распределительные чашки обеспечивают равномерное распространение бактерий на чашке Петри; позволяя изолировать отдельные колонии для подсчета или дальнейших экспериментов.
Ключевые термины
  • колония : бактериальная колония определяется как видимый кластер бактерий, растущих на поверхности или в твердой среде, предположительно культивируемый из одной клетки.
  • Горелка Бунзена : Маленькая лабораторная газовая горелка, подача воздуха которой может регулироваться с помощью регулируемого отверстия.

У микробиологов есть много инструментов, но микробиологи ежедневно используют четыре относительно простых метода, они описаны здесь.

Асептический метод или стерильный метод используется, чтобы избежать загрязнения стерильной среды и оборудования во время культивирования клеток. При работе с живыми культурами клеток и реагентами / средами, которые будут использоваться для таких культур, всегда следует использовать стерильный метод.Этот метод включает использование пламени для уничтожения заражающих организмов и общий режим работы, который сводит к минимуму воздействие загрязнителей на стерильные среды и оборудование.

Серийное разведение : Пример серийного разведения бактерий в пять этапов. Затем разбавленные бактерии распределяли по чашкам. Автор Leberechtc (собственная работа) [GFDL (http://www.gnu.org/copyleft/fdl.html) и CC-BY-3.0 (http://creativecommons.org/licenses/by/3.0)] через Викимедиа Commons

При работе с культурами живых организмов чрезвычайно важно поддерживать среду, в которой клетки выращивают и манипулируют, как можно более свободной от других организмов.Для этого необходимо свести к минимуму воздействие внешнего воздуха на контейнеры со стерилизованными питательными средами и использовать пламя для «повторной стерилизации» крышек и ободков контейнеров. Это означает пропускание ободов и крышек через пламя, создаваемое горелкой Бунзена, чтобы убить микроорганизмы, контактирующие с этими поверхностями.

Стерильная техника, как правило, представляет собой усвоенное состояние или мантру, при которой каждое использование любого стерильного материала сопровождается предупреждением о принятии всех мер предосторожности, чтобы гарантировать, что он остается как можно более свободным от контаминантов как можно дольше.Тепло — отличное средство уничтожения микроорганизмов, а горелка Бунзена — лучший друг стерильного техника.

Серийное разведение — это поэтапное разведение вещества в растворе. Обычно коэффициент разбавления на каждом этапе постоянен, что приводит к геометрической прогрессии концентрации в логарифмической форме. Десятикратное серийное разведение может составлять 1 M, 0,1 M, 0,01 M, 0,001 M… Серийные разведения также используются для точного создания сильно разбавленных растворов. Таким же образом можно развести культуру микробов.Для десятикратного разбавления в масштабе 1 мл флаконы наполняются 900 микролитрами воды или среды и последовательно переносят 100 микролитров исходного микробного раствора с тщательным перемешиванием после каждого этапа разбавления. Разбавление микробов очень важно, чтобы микробы были разведены в достаточной степени, чтобы их можно было посчитать на чашке для распределения (описано ниже).

Штриховая пластина : Четыре штрих-пластины. Удачные полосы приводят к отдельным колониям микробов.

В микробиологии штриховка — это метод, используемый для выделения чистого штамма из одного вида микроорганизмов, часто бактерий.Затем из образовавшихся колоний могут быть взяты образцы, и микробиологическая культура может быть выращена на новой чашке, чтобы можно было идентифицировать, изучить или протестировать этот организм. Штриховку проводят с помощью стерильного инструмента, такого как ватный тампон или обычно посевная петля. Его погружают в посевной материал, такой как бульон или образец от пациента, содержащий много видов бактерий. Образец распределяют по одному квадранту чашки Петри, содержащей питательную среду, обычно чашку с агаром, стерилизованную в автоклаве.Выбор среды для выращивания зависит от того, какой микроорганизм культивируется или для которого выбран. Среды для выращивания обычно представляют собой агар, гелеобразное вещество, полученное из морских водорослей.

Распределительные тарелки — это просто микробы, которые разбрасываются на медиа-тарелке. Микробы находятся в растворе, и его можно разводить. Затем их переносят в чашку Петри со средой, специфичной для роста интересующего микроба. Затем раствор равномерно распределяют с помощью ряда возможных способов, наиболее популярным из которых является использование стерильных стеклянных шариков, которые встряхивают поверх среды, равномерно распределяя содержащую микробов жидкость на планшете.Также распространено использование стержня из гнутого стекла, часто называемого хоккейной клюшкой из-за его схожей формы. Стеклянный стержень стерилизуют и используют для равномерного распределения жидкости, содержащей микробы, по пластине.

Особые методы культивирования

Многие микробы имеют особые условия роста или требуют мер предосторожности при выращивании в лабораторных условиях, что требует специальных методов культивирования.

Цели обучения

Оценить специальные методы культивирования

Основные выводы

Ключевые моменты
  • Микробы, часто те, о которых мы мало знаем, необходимо культивировать в неопределенных средах или условиях роста.
  • Использование животных для выращивания животных иногда необходимо, поскольку нельзя использовать простые среды, что создает технические и этические проблемы.
  • Поскольку патогенные микроорганизмы человека часто изучаются микробиологами, специальные условия безопасности, известные как уровни биобезопасности, используются для защиты исследователей от заражения патогенами, которые они изучают.
Ключевые термины
  • желтая лихорадка : Острое лихорадочное заболевание в тропических регионах, вызываемое флавивирусом и распространяемое комарами, характеризующееся желтухой, черной рвотой и отсутствием мочеиспускания.
  • Болезнь Лайма : Заражение бактериями рода Borrelia, передающимися клещами. Симптомы включают сыпь, за которой следует лихорадка, боли в суставах и головные боли.

Микробиологи предпочли бы использовать четко определенные среды для выращивания микробов, что упрощает борьбу с ними. Однако микробы невероятно разнообразны по тому, что они используют в качестве источника пищи, окружающей среде, в которой они живут, и уровням опасности, которые они могут представлять для людей и других организмов, с которыми они могут конкурировать.Поэтому им нужны особые питательные вещества и среда для роста. Для выращивания этих сложных микробов микробиологи часто обращаются к неопределенным средам, которые выбираются на основе цены и, более того, в данном случае по необходимости, поскольку некоторые микроорганизмы никогда не культивировались на определенных средах. Некоторые особые условия культивирования относительно просты, как продемонстрировал микроаэрофил.

Микроаэрофил — это микроорганизм, которому для выживания необходим кислород, но в среде с более низким содержанием кислорода, чем в атмосфере (концентрация ~ 20%).Многие микрофилы также являются капнофилами, поскольку им требуется повышенная концентрация углекислого газа. В лаборатории их можно легко выращивать в банке для свечей. Баночка для свечей — это контейнер, в который помещается зажженная свеча перед тем, как закрыть герметичную крышку контейнера. Пламя свечи горит до тех пор, пока не гаснет из-за кислородного голодания, в результате чего в сосуде создается богатая углекислым газом и бедная кислородом атмосфера. Многие лаборатории также имеют прямой доступ к диоксиду углерода и могут добавлять желаемые уровни диоксида углерода непосредственно в инкубаторы, где они хотят выращивать микроаэрофилы.

Баночка для свечей : Свеча зажигается в сосуде с чашкой для культивирования. Накрывается крышка, так как при ожогах повышается уровень углекислого газа в банке.

Животных часто можно использовать для культивирования микробов. Например, броненосцы часто используются при изучении проказы. Они особенно уязвимы из-за необычно низкой температуры тела, благоприятной для бактерии проказы Mycobacterium leprae. Бактерии проказы трудно культивировать, а температура тела броненосцев составляет 34 ° C, как у кожи человека.Точно так же люди могут заразиться проказой от броненосцев, обращаясь с ними или употребляя мясо броненосцев. Кроме того, сифилис, вызываемый бактериями Treponema pallidum , трудно выращивать в определенных средах, поэтому кролики используются для культивирования Treponema pallidum . Treponema pallidum принадлежит к Spirochaetesphylum бактерий.

На сегодняшний день спирохет очень трудно, если вообще возможно, выращивать в контролируемых лабораторных условиях.Сюда также входят другие патогены человека, такие как бактерии, вызывающие болезнь Лайма. Использование животных для культивирования патогенов человека сопряжено с проблемами. Во-первых, использование животных всегда затруднено по техническим и этическим причинам. Кроме того, микроб, растущий на животном, отличном от человека, может вести себя совершенно иначе, чем тот же микроб на человеке. Некоторые патогенные микроорганизмы человека выращиваются непосредственно на клетках, полученных от человека. Примером могут служить бактерии Chlamydia trachomatis , бактерии, ответственные за инфекцию, передающуюся половым путем (ИППП) у людей, известную как хламидиоз.Как , Chlamydia trachomatis растет только у людей. Культура клеток человека, известная как культура клеток Маккой, используется для культивирования этих бактерий.

Группа бактерий хламидий : вид под световым микроскопом клеток, инфицированных хламидиями, как показано коричневыми тельцами включения.

Крупная проблема микробиологии состоит в том, чтобы найти способы, с помощью которых люди могут избежать микробных инфекций или избавиться от них. Как видно из некоторых из приведенных выше примеров, некоторые микробы необходимо выращивать в лаборатории, а некоторые из них могут инфицировать людей.Чтобы справиться с этим, микробиологи используют классификацию уровней биобезопасности. Уровень биобезопасности — это уровень мер биологической защиты, необходимых для изоляции опасных биологических агентов в закрытом помещении. Уровни локализации варьируются от самого низкого уровня биобезопасности 1 (BSL-1) до самого высокого уровня 4 (BSL-4). В Соединенных Штатах Центры по контролю и профилактике заболеваний (CDC) установили эти уровни.

Уровень биобезопасности 1 : Этот уровень подходит для работы с хорошо изученными агентами, которые, как известно, не вызывают постоянных заболеваний у здоровых взрослых людей, с минимальной потенциальной опасностью для лабораторного персонала и окружающей среды.

Уровень биобезопасности 2 : Этот уровень аналогичен уровню биобезопасности 1 и подходит для работы с агентами средней потенциальной опасности для персонала и окружающей среды. Он включает в себя различные бактерии и вирусы, которые вызывают у людей лишь легкие заболевания или с которыми трудно заразиться через аэрозоль в лабораторных условиях, например, при хламидиозе.

Уровень биобезопасности 3 : Этот уровень применим к клиническим, диагностическим, обучающим, исследовательским или производственным объектам, в которых работа выполняется с местными или экзотическими агентами, которые могут вызвать серьезное или потенциально смертельное заболевание после вдыхания.Он включает в себя различные бактерии, паразиты и вирусы, которые могут вызывать у людей тяжелые или смертельные заболевания, но для которых существуют методы лечения (например, желтая лихорадка).

Уровень биобезопасности 4 : Этот уровень зарезервирован для работы с опасными и экзотическими агентами, которые представляют высокий индивидуальный риск лабораторных инфекций, передаваемых аэрозолями, агентами, вызывающими тяжелые или смертельные заболевания у людей, для которых вакцины или другие методы лечения недоступны, такие как боливийская и аргентинская геморрагические лихорадки, вирус Марбург и вирус Эбола.Очень немногие лаборатории имеют уровень биобезопасности 4.

Костюм с избыточным давлением : Ученый надевает костюм с избыточным давлением, необходимый для работы с наиболее опасными патогенами человека в лаборатории с четвертым уровнем биобезопасности.

Не культивируемые бактерии — не охарактеризованные организмы, вызывающие инфекции полости рта.

J R Soc Med. 2002 Feb; 95 (2): 81–83.

Программа молекулярной микробной экологии, Guy’s, King’s and St Thomas ‘ Стоматологический институт, Королевский колледж в Лондоне, 28 этаж, Guy’s Tower, Guy’s Госпиталь, Лондон, SE1 9RT, UK

Copyright © 2002, Королевское медицинское общество. Эта статья цитируется в других статьях в PMC.

Первыми питательными средами для бактерий были бульоны, приготовленные путем инфузии или ферментативное переваривание мяса из различных источников. Первоначально разработан Спалланцани в 18 веке, а затем усовершенствован Пастером в 19 веке. века, они позволили излечить бактерии от болезней человека сайты 1 , 2 . Однако быстро стало понятно, что такие бульоны могут содержать смеси микроорганизмов, и Роберт Кох увидел необходимость разработки твердые питательные среды, которые позволят физически отделить бактериальные колонии.Сначала он попробовал разделенный в асептических условиях картофель. Материал взят из инфицированные поражения были распределены по картофелю, а затем инкубированы на теле температура. После инкубации были обнаружены бактериальные колонии, которые могли быть субкультивировали для дальнейшего картофеля, чтобы получить чистые культуры. Несмотря на успех, Кох заметил, что только ограниченное количество микроорганизмов, присутствующих в образец рос на картофеле. Вероятно, это было первое признание феномен некультивируемости in vitro .Тем не менее, успех методика привела к использованию отверждающих агентов, таких как желатин и агар, для создавать твердые среды из бульонов, разработанных Пастером и другими. Этот прогресс привел к золотому веку медицинской микробиологии, в последней четверти 19 век, когда многие бактерии, вызывающие серьезные инфекции у человека были идентифицированы. Однако этот грандиозный успех, вероятно, привел к микробиологов успокаиваться просто потому, что так много важных Таким способом можно было культивировать патогенные бактерии in vitro .

БЕЗКУЛЬТУРНОСТЬ

Мы совершенно игнорируем бактериальную жизнь на Земле. Относящийся к окружающей среде микробиологи подсчитали, что менее 2% бактерий можно культивировать в лаборатория. Во рту мы чувствуем себя лучше, около 50% перорального микрофлора существо культивируемый 3 . Для другие участки тела, цифра неизвестна, но, вероятно, будет похожа на эту находится во рту или выше. Например, подозревается микрофлора толстой кишки. быть преимущественно некультивируемым.Следовательно, вероятно, по количественным причинам только эти некультивируемые и, следовательно, не охарактеризованные организмы являются отвечает за несколько оральных и других инфекций человека. Известный экземпляр сифилис, вызываемый спирохетой Treponema pallidum , которая остается некультивируемый сегодня.

МОЛЕКУЛЯРНАЯ ИДЕНТИФИКАЦИЯ БАКТЕРИЙ

Только с появлением молекулярной биологии методы стали доступны для изучения смешанных бактериальных сообществ в целом, без предубеждения культуры.Теоретическая основа для разработки этих методы пришли сначала от Zuckerandl и Полинг 4 , который предложил использовать биологические макромолекулы для выяснения эволюционные отношения между организмами. Эта идея, которая переросла в отрасль науки, известная как молекулярная филогения, полагается на анализ последовательности ДНК генов общего происхождения или самих белков в круг организмов. Математические методы используются для оценки сходства этих последовательностей и построить филогенетические деревья, демонстрирующие эволюция целых организмов, из которых были изолированы ДНК или белки.На практике для этой цели используются гены «домашнего хозяйства», поскольку они широко распространены среди разных организмов и потому что их существенная функция сделала их относительно сохранными на протяжении всей эволюции, позволяя легко выравнивать последовательности. Наиболее широко используемый из этих генов на сегодняшний день это малая субъединица (16 S ) рибосомной РНК ген 5 . Около 1500 пар оснований в длину, этого достаточно, чтобы быть информативным, и коротким. достаточно, чтобы упростить последовательность действий, особенно после появления автоматизированных Секвенаторы ДНК.Филогенетические деревья строятся путем первого выравнивания последовательностей. одного и того же гена от разных организмов. Тогда генетическая дистанция между пары организмов в наборе данных рассчитываются для получения матрицы сходства. Затем эта матрица анализируется, например, с помощью метод объединения соседей для построения филогенетического дерева или дендрограмма 6 .

После того, как такое дерево было построено, личность неизвестного организма можно определить, просто добавив последовательность его гена к дереву или поиск сходства с другими последовательностями того же гена в база данных.Для 16 S рРНК в настоящее время существует несколько баз данных, содержащих около 12 000 последовательностей в всего 7 , 8 .

ХАРАКТЕРИСТИКА СМЕШАННЫХ БАКТЕРИАЛЬНЫХ СООБЩЕСТВ

Смешанные бактериальные сообщества можно охарактеризовать добавлением полимеразной цепи реакции (ПЦР) и клонирования в соответствии с описанной выше процедурой. ДНК сначала извлекается непосредственно из биомассы исходного образца без культура бактерий, содержащихся в нем. Тогда ген, кодирующий 16 S рДНК амплифицирована с помощью ПЦР с праймерами, специфичными для консервативных области гена (т.е. регионы, в которых присутствует> 95% бактериального вид 9 ). Это будет в результате получается смесь всех 16 молекул рДНК S из организмов в исходном образце. Затем их клонируют в плазмидный вектор, который используется для трансформации хозяина Escherichia coli , тем самым создание библиотеки из 16 рДНК S из образца. Клонированные гены затем могут быть индивидуально упорядочены и отправлены для идентификации в упомянутые выше базы данных, обычно через Интернет.Таким образом, можно определить состав микрофлоры в образце. Если это процедура дополняется традиционной культурой, затем 16 S рРНК гены, секвенированные из культивируемых организмов, можно «вычесть» от общей микрофлоры, отображаемой молекулярным анализом, чтобы выявить некультивируемая часть. Этот метод или его вариант впервые был использован для описать микрофлору природных объектов, таких как горячие источники и глубокие морская вода 10 , 11 .

МОЛЕКУЛЯРНЫЙ АНАЛИЗ МИКРОФЛОРЫ РТА

Молекулярный анализ микрофлоры полости рта на сегодняшний день сосредоточен на бактерии, связанные с зубочелюстными абсцессами и пародонтитом. Dymock и др. . 12 провели молекулярный анализ аспирированного гноя с трех зубочелюстных абсцессов и обнаружено пять групп некультивируемых и, следовательно, ранее не охарактеризованные, организмы, которые преобладали в пробах. Два из них представляли совершенно новые эубактериальные линии.Кроме того, было обнаружено, что количество двух культивируемых видов: Fusobacterium nucleatum, и Porphyromonas endodontalis , были сильно недооценены в образцы. Эти наблюдения предполагают, что некоторые культивируемые виды включают: невозделываемые биотипы.

Значительное количество новых таксонов также было идентифицировано в молекулярных исследования гингивит 13 и пародонтит 14 . Это примечательно, что большинство новых линий передачи, выделенных из устных инфекции сосредоточены в двух подразделениях филогенетической дерево — цитофаги и грамположительные бактерии с низким содержанием G + C.

Во всех исследованиях микрофлоры полости рта, описанных выше, использовались универсальные праймеры для ПЦР для начальной амплификации рДНК 16 S , чтобы максимальное извлечение организмов из образца. Техника также может быть адаптированы для использования групп-специфичных праймеров для специфического поиска некультивируемых и неохарактеризованные организмы в определенных областях филогенетического дерева. Spratt et al. al . 15 спроектировано праймеры для перорального асахаролитика Eubacterium ветви низкого G + C Грамположительные и идентифицировали две группы новых организмов в этой ветви. из одного образца запущенного пародонтита.Подобные исследования сейчас ведутся для исследования микрофлоры, связанной с эндодонтическими инфекциями, дентинными кариес и начальные стадии образования налета.

ПОЧЕМУ НЕКОТОРЫЕ БАКТЕРИИ НЕКУЛЬТИРУЕМЫ?

Как обсуждалось выше, уже более ста лет известно, что in vitro условия культивирования могут не допускать рост всех бактерий в образце. Некоторые из возможных причин заключаются в том, что необходимое питательное вещество не присутствует в культуральной среде, что сама питательная среда токсична, или что другие бактерии в образце производят вещества, ингибирующие мишень организм.Кроме того, мы знаем, что бактерии могут зависеть друг от друга в рост. В частности, оральные бактерии эволюционировали за миллионы лет в течение нескольких миллионов лет. смешанное сообщество в биопленке. За это время некоторые могли приобрести мутации. в основных синтетических путях, но способны получать необходимые вещества от других бактерий в биопленке. Конечно, бактерия, зависящая от другой не сможет самостоятельно выращивать in vitro . Один пример из них Bacteroides forsythus , грамотрицательный анаэроб, замешанный при пародонтите, который требует абсолютной потребности в N-ацетилмурамином кислота 16 , одна из основные компоненты пептидогликана.Этот организм очень плохо растет в чистом виде. культура, но хорошо растет как при совместном культивировании с другими организмами, так и в среде с добавлением N-ацетилмурамовой кислоты.

Другой причиной отсутствия культивирования in vitro может быть нарушение бактериальных цитокиновых сетей. Бактериальный цитокины 17 являются считается медиаторами бактериально-бактериальной передачи сигналов и может быть особенно важно для координации роста составляющих организмов в бактериальные биопленки, такие как зубной налет.Мукамолова и др. al . 18 имеют сообщили о существовании фактора, способствующего реанимации (RpF) в Micrococcus luteus , который стимулирует рост других грамположительных бактерии в пикомолярных концентрациях. Тогда возможно, что бактериальный рост контролируется сетью таких цитокинов, которые могут отвечать для изменения состава зубного налета в ответ на факторы окружающей среды. Очевидно, что разделение бактерий на твердых средах нарушило бы такое сетей и может объяснить, почему некоторые организмы невозможно культивировать.

ВЫВОДЫ

Метод ПЦР-клонирования-секвенирования, описанный в этом обзоре, теперь позволяет по существу полное описание сложных бактериальных сообществ. Первоначально разработанные для анализа экологических экосистем, они теперь применяется к микрофлоре человека, особенно к флоре, связанной с при оральных инфекциях. Эти исследования подтвердили, что оценки бактериальная некультивируемость, сделанная на основе комбинированных микроскопических / культуральных исследований. в сущности правильно, и что 50% флоры полости рта не подлежат культивированию.Эта группа с большой вероятностью будет включать в себя новые патогены, поэтому мы вполне можем войти в новую золотая эра микробиологии, когда ассоциации между конкретными организмами и инфекционные заболевания могут быть назначены с большей уверенностью, чем когда-либо прежде. Мы также все больше осознаем, в какой степени патогенные бактерии при смешанных инфекциях общаются друг с другом и со своими млекопитающими хозяин. Организмы нормальной флоры человека эволюционировали как биопленка и могут быть зависят друг от друга в питании, работая вместе в консорциумах, чтобы вызвать заболевание у восприимчивых хозяев. In-vitro исследование таких организмы должны учитывать эту взаимозависимость.

Ссылки

1. Foster WD. История медицинской бактериологии и Иммунология. Лондон: Heinemann, 1970

2. Коллард П. Развитие микробиологии. Кембридж: Издательство Кембриджского университета, 1976

3. Уилсон MJ, Weightman AJ, Wade WG. Приложения молекулярной экологии в характеристике некультивируемых микроорганизмов, связанных с человеческими болезнь. Rev Med Microbiol 1997; 8: 91-101 [Google Scholar] 4.Цукеркандл Э., Полинг Л. Молекулы как документы эволюционного история. Джей Теорет Биол 1965; 8: 357-66 [PubMed] [Google Scholar] 7. Neefs JM, Van de Peer Y, De Rijk P, Chapelle S, De Wachter R. Компиляция структур малых рибосомных субъединиц РНК. Нуклеиновая Acids Res 1993; 21: 3025-49 [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [Google Scholar]

9. Lane DJ. 16 S /23 S секвенирование рРНК. В: Stackebrandt E, Goodfellow M, ред. Методы нуклеиновой кислоты в Бактериальная систематика. Чичестер: Wiley, 1991: 115-75

10.Джованнони SJ, Britschgi TB, Mayer Ch, Field KG. Генетическое разнообразие в бактериопланктоне Саргассова моря. Природа 1990; 345: 60-3 [PubMed] [Google Scholar] 11. Уорд Д.М., Веллер Р., Бейтсон М.М. 16 S последовательностей рРНК раскрывают многочисленные некультивируемые микроорганизмы в естественном сообществе. Природа 1990; 345: 63-5 [PubMed] [Google Scholar] 12. Даймок Д., Вейтман А.Дж., Скалли С., Уэйд В.Г. Молекулярный анализ микрофлора, связанная с зубочелюстными абсцессами. J Clin Microbiol 1996; 34: 537-42 [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [Google Scholar] 14.Сакамото М., Умеда М., Исикава И., Бенно Ю. Сравнение устного бактериальная флора в слюне здорового человека и два пародонтита пациентов с помощью анализа последовательности 165 S библиотек рДНК. Микробиол Иммунол 2000; 44: 643-52 [PubMed] [Google Scholar] 15. Спратт Д.А., Уэйтман А.Дж., Уэйд В.Г. Разнообразие пероральных асахаролитиков Виды Eubacterium при пародонтите — определение новых филотипов представляющие невозделываемые таксоны. Пероральный микробиол иммунол 1999; 14: 56-9 [PubMed] [Google Scholar] 17.Kell DB, Young M. Бактериальный покой и культивирование: роль аутокринные факторы роста. Curr Opin Microbiol 2000; 3: 238-43 [PubMed] [Google Scholar]

Frontiers | Важность бактериальной культуры для пищевой микробиологии в эпоху геномики

Введение

Геномика, изучение кодирования, структуры и функции генетической информации, можно считать признанной дисциплиной с первой публикацией одноименного журнала в 1987 году (McKusick and Ruddle, 1987).Первоначальные попытки секвенировать полный геном организмов потребовали героических вложений изобретательности и ресурсов. Первая последовательность прокариот, Haemophilus influenzae , была опубликована в 1995 г. (Fleischmann et al., 1995), а первая последовательность эукариот, Saccharomyces cerevisiae , в 1996 г. (Goffeau et al., 1996). Первый геном человека был завершен в 2004 году после многонациональных усилий, стоимость которых оценивалась в 3 миллиарда долларов (Schmutz et al., 2004). Эти инвестиции окупились благодаря методам и инструментам, которые резко сократили время и стоимость секвенирования, а также время и знания, необходимые для анализа.Для бактериологов геномный анализ становится рутинным инструментом, при этом секвенирование всего генома (WGS) доступно по доступной цене, в считанные дни и с анализом, поддерживаемым онлайн-платформами (Jackson et al., 2016; Kwong et al., 2016; Lindsey et al., 2016; Lindsey et al. al., 2016; Whiteside et al., 2016; Yoshida et al., 2016).

Основанием бактериологии как экспериментальной науки стало развитие в XIX веке методов культивирования с использованием твердых или жидких сред. Культура позволила обнаружить и изолировать жизнеспособные бактерии, облегчила наблюдение за метаболической активностью и предоставила биомассу для дальнейшего анализа.По мере того, как геномный анализ бактерий становится доступным в качестве рутинного инструмента, возникает риск возникновения восприятия, что геномный анализ бактерий превосходит или может заменить методы культивирования бактерий из-за скорости анализа и количества получаемых данных. Цель этой статьи — обсудить вопросы, которые микробиологи пищевых продуктов обычно рассматривают в отношении бактерий, и изучить применение культурных и геномных подходов к ответам на них. В пищевой микробиологии бактерии как инфекционные патогены и продуценты токсинов являются проблемой безопасности.Бактерии также представляют собой экономическую проблему, поскольку их метаболическая активность может повысить экономическую ценность пищевых продуктов или отрицательно повлиять на нее, изменяя сенсорные качества или питательную ценность.

Рассмотрение сильных и слабых сторон методов анализа бактерий, основанных на культуре и геноме, показывает, что они позволяют по-разному взглянуть на природу и поведение бактерий, причем первые раскрывают фенотипические характеристики и поведение, а более поздние — генотипическую информацию. Ни один из типов информации не превосходит другой, их следует рассматривать как специализированные и дополнительные инструменты, которые подходят для ответа на различные экспериментальные вопросы.

Обнаружение и подсчет бактерий в пищевых продуктах

Наиболее часто используемые формы бактериологического анализа в пищевой микробиологии — это обнаружение и подсчет. Необходимо определить присутствие конкретных бактерий и их концентрацию для оценки и контроля угроз безопасности, возможности порчи или для обеспечения правильных характеристик продукта. Бактерии, представляющие интерес для микробиологии пищевых продуктов, можно разделить на возбудителей инфекций, вызывающих отравление пищевыми продуктами, порчу и вспомогательные средства обработки (Таблица 1).Метаболическая активность бактерии может рассматриваться как вызывающая порчу или как технологическая добавка, в зависимости от желательности изменений, которые возникают в результате.

ТАБЛИЦА 1. Примеры бактерий, представляющих интерес для пищевой микробиологии.

Выявление определенных типов бактерий может быть достигнуто путем культурального выделения или с помощью таких индикаторов, как биомолекулы, специфичные для организма (например, последовательности нуклеиновых кислот, антигены, токсины) или продукты метаболизма (например,ж., газ, кислота, субстраты с хромогенными продуктами) (Gill et al., 2014). Для подсчета концентрация клеток может быть оценена путем разделения образца на твердой поверхности (например, агаровой среды, мембраны), между жидкими аликвотами (например, наиболее вероятное количество) или с помощью прямых или косвенных измерений биомассы (например, оптической плотности, Limulus анализ лизата амебоцитов).

Платформы диагностики инфекционных агентов, не зависящие от культуры, были успешно коммерциализированы в секторе здравоохранения (Caliendo et al., 2013; Зумла и др., 2014; Langley et al., 2015), а потенциал скорости и автоматизации стимулировал интерес к применению аналогичных систем для анализа пищевых продуктов (Anonymous, 2016a, b; Wang and Salazar, 2016). Платформы, разработанные для здравоохранения, не могут быть легко адаптированы для использования в пищевой микробиологии, поскольку анализ значительно сложнее. Образцы пищевых микробиологических образцов значительно более разнообразны по типу, неоднородны по составу, а концентрация целевых бактерий может быть намного ниже.Также, за исключением стула, биологические жидкости и образцы тканей обычно могут содержать незначительное количество микробиоты.

Присутствие нецелевой микробиоты представляет собой особую проблему при тестировании на патогены, поскольку близкородственные непатогены могут давать ложноположительные результаты, что может иметь серьезные последствия для производителей. Например, Министерство сельского хозяйства США (USDA, 2016) требует тестирования компонентов сырого говяжьего фарша на наличие шига-токсина E. coli (STEC), обладающего тремя признаками: генами вирулентности stx и eae и шесть O-типов, которые считаются повышенным риском.Штаммы E. coli , обладающие одним или двумя из этих признаков, считаются представителями низкого риска и не требуют такой же регуляторной реакции. Однако эти три признака не связаны генетически и могут присутствовать в образце у нескольких разных организмов (Delannoy et al., 2016).

Геномные технологии считаются привлекательными для независимого от культуры обнаружения, поскольку надежность может быть обеспечена за счет параллельного обнаружения нескольких генов или продуктов их транскрипции. Хотя в настоящее время это невозможно, в принципе, WGS с использованием достаточно длинных считываний может обнаруживать и подтверждать присутствие полного генома множества организмов-мишеней в сложной смеси ДНК.Однако, несмотря на ускоряющийся прогресс, геномные технологии не подходят для решения двух фундаментальных проблем обнаружения и подсчета; чувствительность и определение жизнеспособности.

Чувствительность культуральных методов обнаружения бактерий

Чувствительность или предел обнаружения (LOD) методов анализа бактериальных клеток — это минимальная концентрация клеток, которая может быть обнаружена. Анализ на присутствие бактерий, вызывающих отравление, порчу пищевых продуктов или используемых в качестве вспомогательных веществ, обычно не требует пределов обнаружения ниже 100 КОЕ / г или мл.Бактерии порчи и переработки не влияют на качество продукта до тех пор, пока их концентрация не превысит значительную, например порча красного мяса псевдомонад становится очевидной выше 6 log КОЕ / см 2 (Gill and Newton, 1980). Бактериям, вызывающим интоксикацию, необходимо достичь относительно высоких концентраций в продуктах питания, прежде чем произойдет значительное производство токсинов. Для C. botulinum порог составляет 3 log КОЕ / г (Austin et al., 1998), а для B. cereus и S.Концентрация клеток aureus должна превышать 5 log КОЕ / г (FDA, 2012). Однако некоторые инфекционные агенты имеют инфекционные дозы в диапазоне от 10 до 100 клеток (Todd et al., 2008), а концентрация патогенных клеток в продуктах, связанных со вспышкой, может быть ниже 1 клетки на 25 г (Gill and Oudit, 2015). ; Gill, Huszczynski, 2016). Таким образом, тестирование пищевых продуктов на соответствие нормативным требованиям на наличие инфекционных бактериальных патогенов требует LOD, приближающегося к 1 клетке на аналитическую единицу, с аналитическими единицами от 10 г до 325 г в зависимости от конкретного патогена и продукта питания (FDA, 2016; Health Canada, 2016; USDA, 2016) .

Без обогащения никакие существующие технологии не могут приблизиться к этой чувствительности (Wang and Salazar, 2016). Независимо от того, основан ли анализ на обнаружении клеток или биомолекул, объект анализа необходимо отделить от окружающей сложной органической матрицы без потери объекта из-за привязки к аналитическому устройству. Относительно большие размеры аналитической единицы (от 10 г до 325 г) делают непрактичным анализ чего-либо, кроме меньшей аликвоты аналитической единицы (от 0,1 до 1 мл), и многие пищевые продукты состоят из твердых веществ, гелей и суспензий с последующим неоднородным распределением. бактериальных клеток.Метод анализа, который зависит от вероятности присутствия мишени в аликвоте аналитического образца, по своей сути ненадежен.

Обогащение культур решает проблему высокочувствительного обнаружения бактерий путем амплификации аналитической мишени для повышения концентрации и ее гомогенного распределения в водной суспензии. Это гарантирует, что обнаружение больше не является вероятностным процессом, и значительно упрощается работа с пробами. Единственное ограничение заключается в том, что минимальное время, необходимое для анализа пробы, определяется периодом обогащения.Это будет определяться временем, необходимым клеткам для начала репликации (восстановление повреждения и фаза задержки выхода), и временем, необходимым для достижения LOD метода анализа (скорость роста). Период обогащения можно сократить с помощью процесса концентрирования, как только аналитическая мишень будет гомогенно распределена в суспензии. Однако время и ресурсы, необходимые для концентрации, могут сделать это менее эффективным, чем продление периода обогащения.

Определение жизнеспособности бактерий

Для бактериологического анализа пищевых продуктов крайне желательно, чтобы метод анализа не смешивал жизнеспособные клетки (клетки, способные к репликации) с нежизнеспособными клетками или клеточными остатками.Продукты питания часто проходят этапы обработки, которые влияют на выживаемость бактерий: полученная популяция клеток может включать жизнеспособные клетки, клетки, которые могут реплицироваться после восстановления (обратимо поврежденные), и клетки, которые не могут реплицироваться, но сохраняют метаболическую активность (необратимо повреждены) (Wu, 2008). Клетки инфекционных агентов, которые не могут размножаться, не представляют угрозы для здоровья. Нереплицирующиеся продуценты токсинов представляют угрозу только в том случае, если их концентрация уже достаточно высока, чтобы представлять риск. Точно так же наличие нереплицирующихся клеток порчи и перерабатывающих бактерий не имеет никакого отношения к качеству пищевых продуктов.

Аналитические методы, которые обнаруживают присутствие биомолекул, таких как ДНК, РНК или белки, не могут определить, представляют ли эти биомолекулы жизнеспособные клетки или нет. Репликация клеток — сложный процесс, в котором множественные регуляторные механизмы должны координировать синтез и локализацию огромного множества структурных и функциональных молекул (Reyes-Lamothe et al., 2012; Murray and Koh, 2014; Murray, 2016). Неспособность клетки выполнять какую-либо важную функцию может остановить рост и деление клеток.Подтверждение наличия какого-либо одного существенного клеточного компонента не исключает других недостатков, которые могут ингибировать репликацию клеток. Таким образом, жизнеспособность может быть определена только двумя методами: определением присутствия и функциональности всех необходимых молекул или просто ожиданием выхода клетки из лаг-фазы и возможностью репликации.

Оценка жизнеспособности может быть дополнительно затруднена из-за способности вегетативных бактериальных клеток, включая некоторые патогены пищевого происхождения, перейти в другое физиологическое состояние, жизнеспособное, но не культивируемое (VBNC).Состояние VBNC может быть вызвано множеством физико-химических стрессов, когда клетки прекращают репликацию, но продолжают метаболическую активность (Pinto et al., 2015). Экспериментально отличить состояния VNBC от повреждения экспериментально сложно, но поскольку по определению клетки VNBC могут возобновить репликацию после воздействия соответствующего стимула реанимации (Pinto et al., 2015), определение правильного стимула для реанимации, а не отказ от культивирования, представляется более продуктивной реакцией.

Характерные бактерии

Бактериальные изоляты характеризуются для подтверждения идентичности, установления взаимосвязей между изолятами и понимания поведения (фенотипа) бактерии. Хотя доступны различные культурные и молекулярные методы характеристики, их заменяет геномный анализ. Геномика может иметь явное превосходство над другими подходами к идентификации и подтипам изолятов, но ее применение для прогнозирования фенотипа гораздо менее надежно.

Идентификация и выделение подтипов

Геномный анализ для идентификации изолятов до уровня рода или вида по последовательности 16S рРНК и обнаружение специфических генных маркеров методами, основанными на полимеразной цепной реакции, более надежен и имеет большую дискриминацию, чем фенотипические методы, особенно для идентификации ниже уровня вида (Pace, 2009; Йилмаз и др., 2014). WGS-анализ заменяет другие подходы, так как, если требуется сложный вычислительный анализ, единый лабораторный процесс может предоставить информацию о наличии нескольких генных маркеров и филогенетических отношениях. Кроме того, данные о последовательностях могут быть ретроспективно проанализированы на предмет дополнительных маркеров или потенциальных взаимосвязей (Franz et al., 2016; Ronholm et al., 2016).

Установление филогенетических взаимосвязей для бактериальных изолятов ниже уровня вида может связать изоляты из клинических, пищевых и экологических образцов для идентификации вспышек и отслеживания источников (Fu and Li, 2014).Анализ одиночного полинуклеотидного полиморфизма (SNP) данных WGS может обеспечить беспрецедентное различие между изолятами (Holt et al., 2008; Chin et al., 2011). В настоящее время разрабатываются методы прогнозирования установленных генетических подтипов на основе данных WGS, такие как гель-электрофорез в импульсном поле, мультилокусное типирование последовательностей и тандемный анализ множественных локусов переменных чисел, но точность может быть снижена из-за короткой длины считывания (Kwong et al., 2016; Йошида и др., 2016). Независимо от того, производится ли подтип изолятов по SNP или альтернативам, единственным ограничением для соответствующих изолятов является полнота доступных WGS и сопутствующих метаданных.Например, данные WGS использовались для определения географического происхождения изолятов (Weedmark et al., 2015; Hoffmann et al., 2016).

Следует отметить, что применение данных WGS для идентификации изолятов, подтипов и отслеживания источников в контексте принятия решений в области общественного здравоохранения, регулирования и коммерции появилось совсем недавно, и стандарты для анализа и интерпретации еще не установлены. Сообщаемые результаты зависят от используемой платформы секвенирования (длина считываний, частота ошибок, охват генома) и конвейера анализа данных (Pettengill et al., 2014; Wang et al., 2015). На интерпретацию данных может существенно повлиять выбор, такой как алгоритмы идентификации нуклеотидов, метод сборки ( de novo или справочная информация) и то, будет ли сравниваться общий или основной геном изолятов. Признается необходимость решения этих проблем путем установления аналитических стандартов, но будет переходный период до достижения консенсуса по стандартам (Franz et al., 2016; Ronholm et al., 2016).

Прогнозирование бактериального фенотипа

Дополнительный характер геномных и фенотипических данных очевиден при попытке понять и предсказать поведение бактерий.Микробиологов, занимающихся пищевыми продуктами, интересует широкий спектр видов поведения бактерий. К ним относятся потенциал выживания и репликации во время производства и распределения пищевых продуктов, вероятность порчи и потенциальная опасность патогенов. Геномный анализ позволяет исследователям быстро обнаруживать известные гены, предполагаемые гены и другие определенные особенности генома. Однако связать генотип с фенотипом с точностью очень сложно. Многие фенотипические характеристики являются продуктом множества генов и их регуляторных систем.Текущие знания о каких-либо биологических регуляторных системах, кроме горстки, далеки от совершенства. Один и тот же фенотип может быть результатом нескольких механизмов с разными генотипами (Wilson, 2014). Фенотип также может зависеть от взаимодействия с другими организмами (Sanchez-Vizuete et al., 2015; Chanos and Mygind, 2016). Генетически гомогенные клетки могут быть фенотипически гетерогенными, как это наблюдается в клетках-персистерах и биопленках (Grote et al., 2015; Van Acker and Coenye, 2016; Verstraeten et al., 2016).Было установлено, что эпигенетическое наследование, метилирование ДНК (Adhikari and Curtis, 2016) и малые РНК (Houri-Zeevi and Rechavi, 2016) играют роль в определении бактериального фенотипа, но механизмы до конца не изучены. Значение других потенциальных эпигенетических механизмов, таких как прионы (Pallarès et al., 2015), самоподдерживающиеся метаболические петли и структурные шаблоны мембран у бактерий, неизвестно (Jablonka and Lamb, 2005).

Проблемы и возможности, возникающие при прогнозировании фенотипа на основе генотипа, иллюстрируются прогнозом устойчивости к противомикробным препаратам (УПП) на основе данных WGS.Многие аналитические платформы WGS предоставляют данные о генах, связанных с AMR, но полезность этой информации сомнительна. Обзор потенциала прогнозирования УПП, проведенный WGS в 2016 г. для Европейского комитета по тестированию чувствительности к противомикробным препаратам, пришел к выводу, что для целей информирования клинических решений «опубликованные данные об использовании WGS в качестве инструмента для точного определения чувствительности к противомикробным препаратам в настоящее время либо недостаточны. или не существует »(Ellington et al., 2016). Хотя точность прогноза может быть ограничена, возможность быстрого скрининга больших популяций штаммов на предмет потенциального фенотипа по-прежнему полезна.Ноулз и др. (2016) использовали данные WGS, чтобы определить, обладает ли конкретный штамм STEC генами AMR, которые были относительно редкими среди E. coli , и определили наличие генов устойчивости к триметоприму. Устойчивость к триметоприму была подтверждена экспериментально, и было продемонстрировано, что добавление триметоприма в бульон для обогащения способствует выделению (Knowles et al., 2016). При расследовании вспышек этот подход можно использовать для анализа пищевых продуктов на штаммы, ранее изолированные от пациентов.

Цель обсуждения ограничений геномики не состоит в том, чтобы подразумевать, что применение геномики для ответа на эти вопросы неуместно. В сочетании с фенотипическими данными и исследованиями физиологических механизмов геномные данные являются мощным инструментом для улучшения нашего понимания, но необходимо признать проблемы, связанные с установлением связи геномных данных с фенотипом. Принятие решений, связанных с безопасностью пищевых продуктов или обработкой пищевых продуктов, не должно приниматься исключительно на основе геномных данных, а должно подкрепляться фенотипическими данными, которые, в свою очередь, требуют культивирования.Основываясь на фенотипических данных, геномные данные могут улучшить методы культивирования (Knowles et al., 2016) или разработать метод культивирования ранее не культивируемых организмов (Renesto et al., 2003). По мере расширения базы данных данных WGS геномный анализ может использоваться для быстрого скрининга больших популяций на наличие штаммов, потенциально обладающих желаемыми фенотипами, или для отбора экспериментальных штаммов, которые являются репрезентативными для большей популяции.

Заключение

Геномные технологии — это инструменты с огромным потенциалом для улучшения нашего понимания бактерий и решения практических проблем в микробиологии пищевых продуктов, но, как и любые другие инструменты, преимущества и затраты зависят от того, как мы решаем их использовать.Медицинская микробиология сталкивается с рядом ненужных проблем из-за тенденции отказа от культурной изоляции для диагностического тестирования, не зависящего от культуры. На клиническом уровне это представляет трудности при различении жизнеспособных организмов от нежизнеспособных и при интерпретации данных при наличии нескольких организмов. На уровне общественного здравоохранения это приводит к невозможности сбора эпидемиологических данных, таких как подтип и УПП, и запрещает дальнейшую характеристику и исследования (Janda and Abbott, 2014; Huang et al., 2016). Пищевые микробиологи должны извлечь уроки из этого примера и подумать о том, как получить максимальную пользу, не теряя при этом преимуществ альтернативных технологий. Геномный анализ становится стандартным методом идентификации и филогенетики бактерий, но культивирование по-прежнему необходимо для достижения требуемой чувствительности обнаружения и подсчета, а также для определения жизнеспособности. Не менее важно, чтобы культура была предоставлена ​​для получения изолятов, с которыми можно проводить эксперименты для проверки гипотез, созданных на основе геномных данных.Когда фенотип предсказывается на основе геномных данных, мы создаем модель биологической системы, и большая ценность таких моделей, как отмечает Джереми Гунавардена (2014), состоит в том, чтобы выявить ограничения нашего понимания.

Авторские взносы

Автор подтверждает, что является единственным соавтором данной работы, и одобрил ее к публикации.

Финансирование

Исследование автора поддержано Министерством здравоохранения Канады.

Заявление о конфликте интересов

Автор заявляет, что исследование проводилось в отсутствие каких-либо коммерческих или финансовых отношений, которые могут быть истолкованы как потенциальный конфликт интересов.

Список литературы

Остин, Дж. У., Доддс, К. Л., Бланчфилд, Б., и Фарбер, Дж. М. (1998). Рост и выработка токсинов с помощью Clostridium botulinum на инокулированных свежесрезанных упакованных овощах. J. Food Prot. 61, 324–328. DOI: 10.4315 / 0362-028X-61.3.324

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Калиендо, А.М., Гилберт, Д.Н., Джиноккио, К.С., Хансон, К.Е., Мэй, Л., Куинн, Т.С., и др. (2013). Лучшие анализы, лучший уход: улучшенная диагностика инфекционных заболеваний. Clin. Заразить. Дис. 57, S139 – S170. DOI: 10.1093 / cid / cit578

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Чанос, П., Мигинд, Т. (2016). Производство бактериоцина, индуцируемое совместным культивированием, в молочнокислых бактериях. Прил. Microbiol. Biotechnol. 100, 4297–4308. DOI: 10.1007 / s00253-016-7486-8

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Чин, К. С., Соренсон, Дж., Харрис, Дж. Б., Робинс, В. П., Чарльз, Р.С., Жан-Шарль, Р. Р. и др. (2011). Происхождение штамма вспышки холеры на Гаити. N. Engl. J. Med. 364, 33–42. DOI: 10.1056 / NEJMoa1012928

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Delannoy, S., Chaves, B.D., Ison, S.A., Webb, H.E., Beutin, L., Delaval, J., et al. (2016). Возвращение к подходу к тестированию STEC: использование espK и espV для повышения надежности обнаружения энтерогеморрагической Escherichia coli (EHEC) в говядине. Фронт.Microbiol. 7: 1. DOI: 10.3389 / fmicb.2016.00001

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Эллингтон, М. Дж., Экелунд, О., Ареструп, Ф. М., Кантон, Р., Думит, М., Гиск, К., и др. (2016). Роль полногеномного секвенирования (WGS) в тестировании бактериальной чувствительности к противомикробным препаратам: отчет подкомитета EUCAST. Clin. Microbiol. Заразить. 23, 2–22. DOI: 10.1016 / j.cmi.2016.11.012

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Флейшманн, Р.Д., Адамс, М. Д., Уайт, О., Клейтон, Р. А., Киркнесс, Э. Ф., Керлавадж, А. Р. и др. (1995). Полногеномное случайное секвенирование и сборка Haemophilus influenzae Rd. Наука 269, 496–512. DOI: 10.1126 / science.7542800

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Франц, Э., Гра, Л. М., и Даллман, Т. (2016). Значение полногеномного секвенирования для надзора, установления источника и оценки микробного риска патогенов пищевого происхождения. Curr. Opin. Food Sci. 8, 74–79. DOI: 10.1016 / j.cofs.2016.04.004

CrossRef Полный текст | Google Scholar

Fu, L.-L., and Li, J.-R. (2014). Отслеживание источников микробов: инструмент для выявления источников микробного загрязнения в пищевой цепи. Crit. Rev. Food Sci. Nutr. 54, 699–707. DOI: 10.1080 / 10408398.2011.605231

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Гилл А. и Оудит Д. (2015). Подсчет Escherichia coli O157 в связанном со вспышкой сыре Гауда, приготовленном из сырого молока. J. Food Prot. 78, 1733–1737. DOI: 10.4315 / 0362-028X.JFP-15-036

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Гилл, А. О., Грир, Г. Г., Натресс, Ф. М. (2014). «Микробиологический анализ: стандартные методы», в Encyclopedia of Meat Sciences , Vol. 2, 2-е изд., Ред. С. Дивайн и М. Дикеман (Оксфорд: Elsevier), 306–316.

Гилл, К. О., и Ньютон, К. Г. (1980). Развитие бактериальной порчи на поверхности жировой ткани свежего мяса. Прил. Environ. Microbiol. 39, 1076–1077.

PubMed Аннотация | Google Scholar

Goffeau, A., Barrell, B.G., Bussey, H., Davis, R.W, Dujon, B., Feldmann, H., et al. (1996). Жизнь с 6000 генами. Наука 274, 563–567. DOI: 10.1126 / science.274.5287.546

CrossRef Полный текст | Google Scholar

Гроте, Дж., Крысчак, Д., Стрейт, У. Р. (2015). Фенотипическая гетерогенность — явление, которое может объяснить, почему определение кворума не всегда приводит к действительно однородному поведению клеток. Прил. Environ. Microbiol. 81, 5280–5289. DOI: 10.1128 / AEM.00900-15

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Хоффманн, М., Луо, Ю., Понедельник, С. Р., Гонсалес-Эскалона, Н., Оттесен, А. Р., Муруванда, Т. и др. (2016). Отслеживание происхождения штамма Salmonella Bareilly, вызвавшего вспышку пищевого происхождения в США. J. Infect. Дис. 213, 502–508. DOI: 10.1093 / infdis / jiv297

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Холт, К.E., Parkhill, J., Mazzoni, C.J., Roumagnac, P., Weill, F.X., Goodhead, I., et al. (2008). Высокопроизводительное секвенирование позволяет получить представление об изменениях и эволюции генома Salmonella Typhi. Nat. Genet. 40, 987–993. DOI: 10,1038 / нг.195

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Хуанг, Дж. Й., Хенао, О. Л., Гриффин, П. М., Вуджиа, Д. Дж., Кронквист, А. Б., Херд, С., и др. (2016). Инфекция патогенами, обычно передаваемыми через пищевые продукты, и влияние все более широкого использования диагностических тестов, не зависящих от культуры, на эпиднадзор — сеть активного эпиднадзора за болезнями пищевого происхождения, 10 U.С. Сайтов, 2012-2015 гг. Morb. Смертный. Wkly. Rep. 65, 368–371. DOI: 10.15585 / mmwr.mm6514a2

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Яблонька Э., Лэмб М. Дж. (2005). Эволюция в четырех измерениях: генетические, эпигенетические, поведенческие и символические вариации в истории жизни. Кембридж, Массачусетс: MIT Press.

Google Scholar

Джексон, Б. Р., Тарр, К., Стрейн, Э., Джексон, К. А., Конрад, А., Карлтон, Х. и др.(2016). Внедрение общенационального секвенирования всего генома в реальном времени для улучшения выявления и расследования вспышек листериоза. Clin. Заразить. Дис. 63, 380–386. DOI: 10.1093 / cid / ciw242

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Янда, Дж. М., и Эбботт, С. А. (2014). Культурно-независимое диагностическое тестирование: открыли ли мы ящик Пандоры навсегда? Диагн. Microbiol. Заразить. Дис. 80, 171–176. DOI: 10.1016 / j.diagmicrobio.2014.08.001

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Ноулз, М., Стинсон, С., Ламберт, Д., Каррильо, К., Козиол, А., Готье, М. и др. (2016). Геномные инструменты для индивидуального восстановления и обнаружения токсигенного шига шига , Escherichia coli . J. Food Prot. 79, 2066–2077. DOI: 10.4315 / 0362-028X.JFP-16-220

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Квонг, Дж., Меркулия, К., Томита, Т., Истон, М., Ли, Х. Ю., Булах, Д. М. и др. (2016). Перспективное полногеномное секвенирование усиливает национальный надзор за Listeria monocytogenes . J. Clin. Microbiol. 54, 333–342. DOI: 10.1128 / JCM.02344-15

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Лэнгли, Г., Бессер, Дж., Ивамото, М., Лесса, Ф. К., Кронквист, А., Скофф, Т. Х. и др. (2015). Влияние не зависящих от посевов диагностических тестов на надзор в рамках программы будущих инфекций Emerg. Заразить. Дис. 21, 1582–1588. DOI: 10.3201 / eid2109.150570

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Линдси, Р.Л., Пузеле, Х., Чен, Дж. К., Строкбайн, Н. А., и Карлтон, Х. А. (2016). Внедрение полногеномного секвенирования (WGS) для идентификации и характеристики продуцирующего шига-токсин Escherichia coli (STEC) в США. Фронт. Microbiol. 7: 766. DOI: 10.3389 / fmicb.2016.00766

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

McKusick, В. А., и Раддл, Ф. Х. (1987). Новая дисциплина, новое имя, новый журнал. Геномика 1, 1–2.DOI: 10.1016 / 0888-7543 (87) -X

CrossRef Полный текст | Google Scholar

Мюррей, Х., Кох, А. (2014). Множественные регуляторные системы координируют репликацию ДНК с ростом клеток в Bacillus subtilis . PLoS Genet. 10: e1004731. DOI: 10.1371 / journal.pgen.1004731

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Палларес И., Иглесиас В. и Вентура С. (2015). Фактор терминации Rho Clostridium botulinum содержит прионоподобный домен с сильно амилоидогенным ядром. Фронт. Microbiol. 6: 1516. DOI: 10.3389 / fmicb.2015.01516

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Петтенгилл, Дж. Б., Луо, Ю., Дэвис, С., Чен, Ю., Гонсалес-Эскалона, Н., Оттесен, А., и др. (2014). Оценка альтернативных методов построения филогении на основе данных о последовательности всего генома: тематическое исследование с Salmonella . PeerJ 2: e620. DOI: 10.7717 / peerj.620

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Пинто, Д., Сантос, М.А., и Чамбел, Л. (2015). Тридцать лет жизнеспособных, но некультивируемых государственных исследований: нерешенные молекулярные механизмы. Crit. Rev. Microbiol. 41, 61–76. DOI: 10.3109 / 1040841X.2013.794127

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Ренесто П., Крапуле Н., Огата Х., Ла Скола Б., Вестрис Г., Клавери Дж. М. и др. (2003). Геномный дизайн бесклеточной культуральной среды для Tropheryma whipplei . Ланцет 362, 447–449.DOI: 10.1016 / S0140-6736 (03) 14071-8

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Рейес-Ламот Р., Николас Э. и Шерратт Д. Дж. (2012). Репликация и сегрегация хромосом у бактерий. Annu. Преподобный Жене. 46, 121–143. DOI: 10.1146 / annurev-genet-110711-155421

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Ронхольм, Дж., Нашери, Н., Петронелла, Н., и Паготто, Ф. (2016). Навигация по микробиологической безопасности пищевых продуктов в эпоху полногеномного секвенирования. Clin. Microbiol. Ред. 29, 837–857. DOI: 10.1128 / CMR.00056-16

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Санчес-Визуэте, П., Оргаз, Б., Аймерих, С., Ле Кок, Д., и Бриандет, Р. (2015). Защита патогенов от действия дезинфицирующих средств в многовидовых биопленках. Фронт. Microbiol. 6: 705. DOI: 10.3389 / fmicb.2015.00705

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Шмутц Дж., Уиллер Дж., Grimwood, J., Dickson, M., Yang, J., Caoile, C., et al. (2004). Оценка качества последовательности генома человека. Природа 429, 365–368. DOI: 10.1038 / nature02390

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Тодд, Э. С. Д., Грейг, Дж. Д., Бартлесон, К. А., и Майклс, Б. С. (2008). Вспышки, при которых работники пищевой промышленности были причастны к распространению болезней пищевого происхождения. Часть 4. Инфекционные дозы и носительство возбудителя. J. Food Prot. 71, 2339–2373.DOI: 10.4315 / 0362-028X-71.11.2339

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Ван Акер, Х., и Коэне, Т. (2016). Роль оттока и физиологической адаптации в толерантности и устойчивости биопленок. J. Biol. Chem. 291, 12565–12572. DOI: 10.1074 / jbc.R115.707257

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Verstraeten, N., Knapen, W., Fauvart, M., and Michiels, J. (2016). Исторический взгляд на устойчивость бактерий. Methods Mol. Биол. 1333, 3–13. DOI: 10.1007 / 978-1-4939-2854-5_1

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Ван, К., Холмс, Н., Мартинес, Э., Ховард, П., Хилл-Которн, Г., Синченко, В. (2015). Дело не только в однонуклеотидных полиморфизмах: сравнение мобильных генетических элементов и делеций в геномах Listeria monocytogenes связывает случаи госпитального листериоза с источником окружающей среды. J. Clin. Microbiol. 53, 3492–3500. DOI: 10.1128 / JCM.00202-15

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Ван Ю., Салазар Дж. К. (2016). Независимые от культуры методы экспресс-обнаружения бактериальных патогенов и токсинов в пищевых матрицах. Компр. Rev. Food Sci. Food Saf. 15, 183–205. DOI: 10.1111 / 1541-4337.12175

CrossRef Полный текст | Google Scholar

Уидмарк, К. А., Мабон, П., Хайден, К. Л., Ламберт, Д., Ван Домселаар, Г., Остин, Дж.W., et al. (2015). Clostridium botulinum изолят группы II филогеномного профиля с использованием данных последовательности всего генома. Прил. Environ. Microbiol. 81, 5938–5948. DOI: 10.1128 / AEM.01155-15

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Whiteside, M.D., Laing, C. R., Manji, A., Kruczkiewicz, P., Taboada, E. N., and Gannon, V. P. (2016). SuperPhy: прогнозирующая геномика бактериального патогена Escherichia coli . BMC Microbiol. 16:65. DOI: 10.1186 / s12866-016-0680-0

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Йилмаз П., Парфри Л. В., Ярза П., Геркен Дж., Прюсс Э., Кваст К. и др. (2014). Таксономические рамки SILVA и «проекта живого дерева всех видов (LTP)». Nucleic Acids Res. 42, D643 – D648. DOI: 10.1093 / nar / gkt1209

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Yoshida, C., Kruczkiewicz, P., Laing, C.R., Lingohr, E.J., Gannon, V.P.J., Nash, J.H.E. и др. (2016). Ресурс Salmonella in silico по типированию (SISTR): открытый веб-инструмент для быстрого типирования и подтипирования черновых сборок генома Salmonella . PLoS ONE 11: e0147101. DOI: 10.1371 / journal.pone.0147101

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Zumla, A., Al-Tawfiq, J. A., Enne, V. I., Kidd, M., Drosten, C., Breuer, J., et al. (2014). Диагностические тесты для экспресс-диагностики вирусных и бактериальных инфекций дыхательных путей — потребности, достижения и перспективы на будущее. Lancet Infect. Дис. 14, 1123–1135. DOI: 10.1016 / S1473-099 (14) 70827-8

CrossRef Полный текст | Google Scholar

Бактериальные культуры — обзор

4.8.3 Получение бактериальных штаммов

Бактериальные культуры могут быть получены в лиофилизированных (лиофилизированных), замороженных или жидких суспензионных формах или на полутвердой агаризованной среде. Вскоре после получения бактерии следует выращивать на основных планшетах с минимальным содержанием глюкозы, содержащих соответствующие антибиотики (для штаммов, содержащих плазмиды).Этот и описанные ниже процедуры выделения обеспечивают здоровый рост бактерий на чашках MGA, присутствие соответствующей плазмиды и чистоту культур. Лиофилизированные культуры должны быть восстановлены в питательном бульоне, а затем нанесены штрихами на мастер-планшеты (с минимальным содержанием глюкозы), то есть MGM, MGMA или MGMAT в зависимости от содержания плазмиды в штамме — см. Раздел 4.6. В закрытом виде замороженные и лиофилизированные культуры могут храниться до 2 лет при хранении при температуре ≤ −70 ° C и 4 ° C соответственно.Когда это удобно, замороженные суспензии следует быстро разморозить (например, осторожно встряхивая на водяной бане при 37 ° C), а затем немедленно нанести штрихами на соответствующие мастер-планшеты (MGM, MGMA или MGMAT). При получении жидкие культуры должны быть нанесены штрихами. Культуры на агаре можно хранить в холодильнике несколько недель или даже месяцев, если питательная среда не высыхает; однако ожидается, что жизнеспособность / восстановление организмов, хранящихся при 4 ° C, будет относительно быстро снижаться, и могут накапливаться мутации. Бактерии, полученные в виде колоний на полутвердой среде (т.д., в виде полос, уколов или откосов / уклонов) должны быть заштрихованы как можно скорее; исходный материал можно хранить в холодильнике до тех пор, пока не будут накоплены соответствующие запасы штаммов. Полоски для выделения и очистки бактерий перед определением характеристик могут быть подготовлены с использованием распечатки шаблона штрихов, показанного на Рисунке 4.2, в качестве руководства.

Рисунок 4.2. Шаблон полосы.

Поместите мастер-планшет на шаблон и затем загрузите небольшое количество бактериальной культуры / суспензии в стерильную пластиковую петлю; используйте это, чтобы подготовить полосы в разделе 1 (1A, затем 1B и т. д.), используйте новую петлю, чтобы подготовить полосы в разделе 2, а затем используйте другую сторону петли для полос в разделе 3; повторить с новой петлей для участков 4 и 5. В качестве альтернативы можно использовать проволочную петлю; петлю следует стерилизовать перед использованием и перед нанесением штрихов на каждую из секций 2–5. Проволочные петли можно стерилизовать сухим жаром с помощью газовой или спиртовой горелки или инфракрасным излучением с помощью Bacti-Cinerator, а затем охладить, прикоснувшись к поверхности агара. перед каждым использованием.

Процедура и источник каждого штамма должны быть зарегистрированы в журнале технического обслуживания; планшеты должны быть помечены штаммом, датой и номером исследования с перекрестными ссылками на бумажные записи.Планшеты с агаром с штрихами следует перевернуть, инкубировать в течение 48–72 ч при 37 ° C, а затем хранить при 4 ° C в пластиковых пакетах, чтобы среда не высыхала и не образовывалась чрезмерная конденсация. Отдельные изолированные колонии появятся в секциях чашки с меньшим номером в зависимости от количества бактерий, перенесенных в секцию 1, и типа используемой петли (проволочная или пластмассовая).

Возьмите 10 изолированных культур из каждого штамма и нанесите штрихами каждую на мастер-планшете с указанием штамма, даты, ссылки на исследование и серийного номера изолята (1–10).Инкубируйте эти мастер-планшеты при 37 ° C в течение 2-3 дней; затем, если они не используются немедленно, храните их в холодильнике еще до 2 дней.

Культура бактерий — наука в новостях

Бактерии распространены повсеместно. Они защищают и определяют нас, составляя более 90% клеток человеческого тела. Они обладают способностью выживать в самых экстремальных условиях окружающей среды, а химические реакции, которые они катализируют, содержат потенциал для жизненно важных технологических достижений, таких как чистая энергия.И все же они бросают вызов приручению; ученым удалось вырастить в лаборатории или «культивировать» менее 1% видов бактерий на Земле [1].

Остальные 99% некультивируемых видов бактерий не являются специфическими для данной среды. Они живут в море, в почве под нашими ногами, в кишечнике и во рту. Мы знаем, что они существуют, потому что область их ДНК, которая кодирует важную молекулу РНК, называемую 16S рРНК, является общей для разных видов. У каждого вида бактерий есть функциональная копия этой РНК, но, поскольку мутации ДНК накапливаются со временем, каждый вид создает свой собственный уникальный вариантный код для этой молекулы.Чем более близки виды бактерий, тем более похожей будет ДНК их 16S рРНК. ДНК для 16S рРНК достаточно похожа у разных видов, чтобы ученые могли ее найти и исследовать, но достаточно уникальна, чтобы различать разные виды. Возможно, удивительно, что некоторые из последовательностей ДНК для 16S рРНК некультивируемых бактерий чрезвычайно похожи на таковые у широко изученных культивируемых видов, что указывает на их близкое родство. Однако, несмотря на усилия сотен преданных своему делу микробиологов, мы мало знаем об этих «диких» видах, кроме того, что они существуют.

Культурный вызов

Основная процедура культивирования бактерий довольно проста. Возьмите образец — например, океанской воды, почвы или слюны — и разбавьте его водой. Затем нанесите каплю этого разведения на чашку Петри, полную питательных веществ. Каждая отдельная бактерия попадает в уникальное место на блюде. Он реплицируется и делится в этом месте, а его скопированные дочерние клетки реплицируются снова и снова, образуя видимую «колонию» из десятков тысяч генетически идентичных клеток размером с задний конец иглы.Изменяя питательные вещества в чашке и исследуя множество образцов, ученые выделили колонии нескольких тысяч различных видов бактерий.

Однако сотни тысяч (возможно, миллионы) видов просто не образуют колоний в лаборатории, что мешает их изучению для фундаментальной науки и технических и медицинских приложений. Подобно разочарованным учителям, многие ученые отказались от изучения этих 99% бактерий, посчитав их «некультивируемыми». Однако недавно ученые разработали методы изоляции до 40% различных видов в данной среде, что является значительным улучшением по сравнению с предыдущими урожаями.Например, одна исследовательская группа инкапсулирует образец морской воды в агаре (тот же желатиноподобный материал, который находится в чашках Петри), покрывает агар мембраной, которая обеспечивает диффузию морской воды, и возвращает агар с морской водой к его естественному состоянию. среда. Через несколько недель бактерии в этих «оболочках» агара образуют колонии, достаточно большие для изучения [2]. При выращивании бактерий в среде, более близкой к их естественной, нет необходимости пробовать все условия питательных веществ, чтобы найти правильный рецепт для каждого темпераментного вида.

Социальная культура

Какие компоненты и условия различаются между дикой природой и лабораторией? Хотя в некоторых случаях секретный ингредиент является питательным веществом, недавние исследования указывают на многие случаи, когда этим некультивируемым бактериям для выживания требуются другие виды бактерий, так же, как мы зависим от опытных фермеров, фармацевтов и строителей. В случае бактерий их соседи могут производить важные метаболические молекулы, выделять феромоноподобные молекулы, которые сигнализируют о росте, или удалять токсины из окружающей среды.Например, группа ученых из Северо-Восточного университета недавно обнаружила, что многие некультивируемые бактерии не могут улавливать железо сами по себе; они полагаются на своих бактериальных соседей, чтобы секретировать молекулы, улавливающие железо, называемые сидерофорами. Выращивая образцы вместе с бактериями, продуцирующими сидерофоры, группа выделила много новых, ранее «некультивируемых» видов.

Подобно тому, как многие из этих видов непригодны для жизни в лаборатории, можно ожидать, что зависимые бактерии непригодны в дикой природе; шансы на выживание могут быть уменьшены, если ваше выживание зависит от вас и вашего соседа! Как эти бактерии выдержали приливы времени и эволюционное давление? Этот вопрос остается без ответа, но одна из гипотез состоит в том, что присутствие хорошо известных соседей сигнализирует бактериям, что они находятся в подходящей среде для роста.Полагаясь на своих соседей, эти некультивируемые бактерии не растут и не адаптируются к среде, в которой они вряд ли будут процветать в долгосрочной перспективе [3].

Закрытие на культуру

Хотя технические достижения позволяют нам больше изучать огромное разнообразие природы, остается еще много вопросов, на которые нужно ответить. Почему так сложно культивировать оставшиеся 60% бактерий, которые не удается уловить с помощью этих новых методов? Как мы будем их культивировать? В частности, как мы можем культивировать еще некультивируемые бактерии, как комменсальные, так и патогенные, которые живут в нашем собственном организме? Ответы на эти вопросы должны привести к новым лекарствам и к дальнейшему пониманию нашего «микробного органа».

Практика культивирования бактерий независимо маскировала важность межвидовых взаимоотношений в веке. Сегодня изучение взаимодействия бактерий — это быстро развивающаяся научная область, и многие вопросы, на которые у нас нет ответа, находятся в пределах досягаемости.

Аспирантка Гарварда Тами Либерман

Список литературы

1. Schloss and Handelsman. Статус микробной переписи. Microbiol Mol Biol Rev (2004), т. 68 (4) с.686-91

2. Kaeberlein et al. Выделение «некультивируемых» микроорганизмов в чистой культуре в смоделированной естественной среде. Наука (2002) т. 296 (5570) с. 1127-9.

3. Donofrio et al. Сидерофоры соседних организмов способствуют росту некультивируемых бактерий. Химия и биология (2031) т. 17 (3) стр. 254-264

Интересные ссылки

Эта статья была вдохновлена ​​более техническим сообщением из блога Американского общества микробиологов, Small Things рассмотрение .http://schaechter.asmblog.org/schaechter/2010/07/the-uncultured-bacteria.html

New York Times, Car Zimmer, 12 июля, -е, , 2010. Как микробы защищают и определяют нас

См. Предыдущую статью SITN Flash: Наш микробный орган, 30 апреля 2010 г.

http://sitn.hms.harvard.edu/flash/2010/04/issue68/

Основные методы культивирования бактерий

Освоение основных методов культивирования бактерий является обязательным, если вы планируете карьеру в области микробиологии!

Выращивание бактерий может быть одним из самых простых занятий ученого.Кроме того, как вы, вероятно, обнаружили, сделать еще проще, если вы пытаетесь предотвратить рост бактерий там, где их не должно быть !!

Когда мы идем о культивировании бактерий, мы хотим создать среду для выборочного выращивания только желаемых видов бактерий . В этой статье вы узнаете, как можно культивировать конкретных видов бактерий эффективным способом .

Дамы и господа, это «приветственный коврик» в мире микробиологии.

Изучение того, как культивировать бактерии, — это первый шаг ко многим проектам, поэтому давайте приступим к закладке основы для вашей будущей Нобелевской премии!

Почему мы хотим культивировать один вид бактерий?

Культивирование бактерий проводится по множеству причин, в том числе:

  • для выделения одного вида
  • для выделения одного генетического клона определенного вида
  • для выделения смешанной культуры многих видов
  • для определения неизвестных видов
  • для помощи в клинической диагностике патогенов (или их отсутствия) в образцах пациентов

Цель состоит в том, чтобы культивировать только те виды бактерий, которые вам нужны! Это может быть сложно, особенно если вы работаете с экологическими или клиническими образцами.Многие виды бактерий обитают в окружающей нас среде (и в лаборатории тоже!) И в клинических материалах, таких как фекалии или мокрота. В борьбе с этой проблемой стерильность и асептика — одни из ваших самых важных союзников.

Стерилизуйте инструменты для бактериальных культур перед использованием!

Вы можете легко стерилизовать посуду, жидкости и агаровые среды с помощью ряда методов в лаборатории. Во время работы вы можете окунуть стеклянные или металлические инструменты для культивирования (например, петли для инокуляции или распределители клеток) в спирт и подержать их в пламени горелки Бунзена около 30 секунд, чтобы обеспечить полную стерильность перед использованием.Не забудьте дать 20-30 секунд остыть перед тем, как приступить к засеванию бактерий, чтобы не поджечь ваши драгоценные клоны!

В качестве альтернативы вы можете приобрести многие из обычно используемых инструментов для культивирования в предварительно стерилизованной одноразовой форме. Вы также можете приобрести ряд буферов и готовых предварительно стерилизованных сред.

Все эти методы и подходы направлены на уничтожение бродячих бактерий, которые могут запрыгнуть на вашу чашку с агаром и захватить вашу культуру, прежде чем они станут проблемой.

Техника поддержания чистоты и асептики скамейки

Еще одна важная вещь, о которой следует помнить, пытаясь добиться стерильности, — это рабочее место. Области, где вы культивируете бактерии, должны обрабатываться так же, как вы обрабатываете рабочее пространство ПЦР:

  • прозрачный
  • без помех
  • перед использованием протереть спиртовым спреем

Чтобы предотвратить буквально попадание бактерий в культуры, разумно работать с открытым пламенем (Бунзен) поблизости.Это создает «зонтик» тепла над вашим рабочим пространством и может убить любые распространенные бактерии, плавающие вокруг. Только не поджигай себя!

В качестве альтернативы вы можете выполнять эту работу в стерильном вытяжном шкафу, что устраняет необходимость в открытом пламени, но вам, возможно, придется бороться с любым, кто занимается культивированием тканей для этого пространства! Им не нравятся бактерии, окружающие их среду обитания, не зря, поскольку бактерии легко заражают культуру клеток млекопитающих.

Прочтите более раннюю статью на Biosize Bio для получения более подробной информации о том, как соблюдать правила асептики в лаборатории.

Использование антибиотиков для предотвращения нежелательного роста бактерий

Помимо практики асептики, еще одним распространенным способом избежать нежелательных бактерий является использование маркера селекции антибиотика, предоставленного вашему клону посредством плазмидной трансформации. Это позволит вам выращивать интересующие вас виды или клоны в присутствии одного из ряда различных антибиотиков, таких как ампициллин или канамицин, убивая при этом все остальное, что не может расщеплять эти соединения.Эта стратегия очень распространена, когда используются молекулярные методы, включающие мутагенез или векторы экспрессии белков.

Тарелки? Жидкие СМИ? Трубки? О боже!

Вы можете использовать несколько различных типов сред для выращивания бактерий, и все они могут быть дополнены этими антибиотиками в соответствии с требованиями плазмид или экспериментальных целей.

Для выделения одного клона или колонии или для идентификации неизвестного вида по морфологии, вероятно, лучшим выбором будет оценка роста на чашках с агаром.Это позволит выделить один генетический клон, который можно будет проанализировать под микроскопом или выделить для дальнейшего анализа.

Для увеличения бактериальных культур для ДНК (например, плазмиды) или выделения белка обычно используются жидкие среды. Культуры микролитров могут быть легко увеличены до более крупных культур по мере необходимости. Жидкую среду легко приготовить в больших количествах, а параметры роста, такие как присутствие антибиотиков, аэрация и температура, можно легко контролировать и регулировать по мере необходимости.

Наконец, если вас особенно интересуют бактерии, которые растут в условиях низкого содержания кислорода, используйте колючую трубку (пробирку, наполненную мягким агаром). Колющая трубка позволит вашей посевной петле проникнуть глубоко в среду, где свободный кислород минимален. Посев жидкой среды в пробирку и оставление ее стоять (без встряхивания!) Также может позволить вырастить колонии в условиях низкого содержания кислорода в жидких средах.

Условия роста бактерий — оптимальная температура

Условия, в которых выращиваются бактериальные культуры, действительно могут повлиять на ваш общий успех.Обычно бактерии выращивают при 37 ° C, потому что это близко имитирует температуру человеческого тела. Однако не все виды бактерий оптимально растут при 37 ° C, поэтому определение оптимальной температуры роста очень важно. Рекомендации по росту всегда даются при покупке культур в банках культур. Научная литература — еще одно отличное место, где можно узнать, как выращивать бактерии.

Неоптимальные температуры инкубации могут привести к снижению скорости роста или даже полной остановке, а уровни экспрессии белка могут резко измениться.Рост в жидкой культуре можно легко контролировать с помощью спектроскопии, измеряя поглощение света при 600 нм.

Leave a Reply

Добавить комментарий

Ваш адрес email не будет опубликован. Обязательные поля помечены *

2021 © Все права защищены.