Определение группы крови по системе АВ0 | Переливание крови и кровезаменителей
Систему антигенов АВ0 составляют три антигена и два естественных антитела — агглютинины α и β. Антигены или агглютиногены А, В, 0 (иногда его называют антигеном Н) содержатся в основном в эритроцитах, а также в лейкоцитах, тромбоцитах и клетках тканей. Кроме того, у большинства людей эти антигены в водорастворимой форме находятся в плазме крови, слюне, желудочном соке, моче и других жидкостях организма.
Естественные антитела являются строго специфичными — анти-А и анти-В. Агглютинин а соединяется только с антигеном А, а агглютинин β — только с антигеном В. В крови людей группы 0 (I) содержатся оба агглютинина α и β, в крови группы А (II) имеется агглютинин β, в крови людей группы В (III) содержится агглютинин α, кровь группы АВ (IV) естественных агглютининов не содержит.
Определение группы крови человека основано на реакции агглютинации, т. е. соединения строго специфичного агглютинина а с антигеном (агглютиногеном) А и агглютинина β с антигеном В. Для этой цели обычно применяется простая реакция с двумя разными сериями стандартных сывороток групп 0 (I), А (II) и В (III).
Стандартные гемагглютинирующие сыворотки готовятся специальными лабораториями, входящими в состав системы службы крови. Комплект выпускаемых стандартных сывороток состоит из двух различных серий сывороток групп 0 (I), А (II), В (III), АВ (IV). Сыворотки должны храниться в холодильнике при температуре 4—6° или при комнатной температуре в сухом темном месте. Срок годности жидких стандартных сывороток —4 мес. Ампулы или флаконы со стандартными сыворотками должны сохраняться в закрытом виде в холодильнике.
Перед определением группы крови больной необходимо проверить пригодность стандартных сывороток. Не следует пользоваться загрязненными (мутными) сыворотками, хранившимися в открытом виде, не имеющими этикетки с указанием титра, номера серии, срока годности.
В углубления специальной тарелки (рис. 45), в соответствии с маркировкой, глазной пипеткой наносятся по две капли стандартной сыворотки каждой из групп. Если специальной тарелки нет, то производится маркировка любой приспособленной для этой цели тарелки так, как показано на рис. 45. Затем к стандартной сыворотке добавляется маленькая капля взятой из пальца больной крови или исследуемых эритроцитов, взятых длинной пипеткой со дна пробирки. Смешивать исследуемую кровь со стандартными сыворотками можно путем осторожного покачивания тарелки, либо перемешивания углом предметного стекла, используя разные углы стекла для разных сывороток.
45. Тарелка для определения группы крови.
Результат читается через 5 мин. Перед оценкой реакции, в те лунки, где видна агглютинация, нужно добавить по одной капле физиологического раствора.
Если исследуемая кровь относится к группе 0 (I), то ни в одной из лунок агглютинации не будет — кровь первой группы не содержит ни А- ни В-антигенов.
Кровь группы А (II) даст феномен агглютинации с сыворотками первой и третьей групп, так как эти сыворотки содержат агглютинин α.
Если при оценке результата реакции отмечается агглютинация с сыворотками первой и второй групп, а с сывороткой третьей группы агглютинации нет, то исследуемая кровь принадлежит к группе В (III). Следовательно, в данном случае агглютиноген В соединился с агглютинином β, содержащимся в стандартной сыворотке I и II групп.
Поскольку кровь группы АВ (IV) содержит оба антигена, то она дает агглютинацию со всеми тремя сыворотками, содержащими α- или β-антитела (рис. 46).
46. Результаты определения группы крови простой реакцией.
www.medical-enc.ru
Группы крови. Система ав0. Факторы, определяющие групповую принадлежность крови. Методики определения групп крови.
Было установлено, что мембрана эритроцитов человека является носителем более 300 антигенов, обладающих способностью вызывать против себя образование иммунных антител. Если соответствующие антитела попадают в кровь, развивается реакция взаимодействия между эритроцитарными антигенами и сывороточными антителами и происходит агглютинация (склеивание) эритроцитов.
Система AB0
В системе AB0 в соответствии с наличием на поверхности на поверхности эритроцитов агглютиногенов (антигенов) А и В выделено 4 группы крови, обозначаемых римскими цифрами I, II, III и IV. В плазме крови к агглютиногенам А и В могут содержаться антитела —
Серологический состав групп крови системы АВ0
Группы | Эритроциты | Плазма или сыворотка |
крови | Агглютиногены | |
I (0) | 0 | a , b |
II (A) | A | b |
III (B) | B | a |
IV (AB) | AB |
При переливании крови необходимо предотвратить ситуацию, когда в крови реципиента одновременно будут находиться и антигены, и антитела именно к этому антигену, т.е. возникнет ситуация несовместимости. Агглютинины являются g-глобулинами и имеют 2 центра связывания, что обеспечивает возможность образования мостика между двумя эритроцитами и, таким образом, вызывают склеивание (агглютинацию) эритроцитов, содержащих на мембране соответствующие агглютиногены. Агглютинация эритроцитов наблюдается лишь в том случае, если встречаются одноименные агглютиноген и агглютинин: А и α, В и β.
Агглютинация эритроцитов
У новорожденных в крови отсутствуют антитела системы АВ0 и образование их к антигенам, которых у него нет, происходит в течение первого года жизни. Антитела не вырабатываются против «своего», т. е. присутствующего в эритроците данного человека антигена — А и В. Однако антигены А и В широко распространены в животном мире, поэтому, после рождения человека в его организме начинается формирование антител против антигенов А и В, поступающих с пищей, бактериями.
Существуют
разновидности агглютиногена А: А
У лиц с I(0) группой крови на поверхности мембран эритроцитов имеется антиген Н, который доступен для взаимодействия с анти-Н-антителами, довольно часто встречающимися в плазме крови II(A) и IV(АВ) групп и несколько реже III(В) группы. В этих случаях переливание крови I(0) группы лицам, имеющим другие группы крови, может привести к гемотрансфузионным осложнениям. Наличие Н-антигена на поверхности мембран эритроцитов послужило основанием обозначать систему АВО как АВН.
Существуют следующие методики определения групп крови по системе АВ0:
— с использованием изогемагглютинирующих (стандартных) сывороток;
— перекрестным методом, т.е. одновременно при помощи стандартных сывороток и стандартных эритроцитов;
— с использованием моноклональных антител.
Определение группы крови с использованием изогемагглютинирующих (стандартных) сывороток. Группы крови определяют путем постановки реакции агглютинации крови реципиента (человека, которому переливают кровь) со стандартными сыворотками I–IV групп крови, полученных от доноров.
Стандартные сыворотки содержат только агглютинины соответствующих групп крови и имеют стандартную окраску: сыворотка 0(I) группы не окрашена, А(II) группы — синяя, B(III) группы — розовая, AB(IV) — желтая.
Определение группы крови проводят в помещении с хорошим освещением при температуре +15–+25°С. При температуре выше 25 °С реакция агглютинации замедляется, а при температуре ниже 15 °С возможна холодовая агглютинация.
На пластинку наносят по одной большой капле (0,1 мл) стандартных сывороток соответствующих групп 2 серий. Рядом с каждой каплей сыворотки наносят маленькую каплю (0,01 мл) исследуемой крови, соблюдая соотношение 10:1. Капля вносимой в сыворотку крови должна быть меньше объема капли сыворотки, чтобы не снизить титра содержащихся в них агглютининов. Смешивают каплю сыворотки с каплей крови индивидуальной чистой стеклянной палочкой, затем, периодически покачивая пластинку, наблюдают за ходом реакции в течение 5 мин.
Агглютинация начинается в течение первых 10–30 с, однако наблюдение следует вести до 5 мин ввиду возможности более поздней агглютинации с эритроцитами, содержащими слабые разновидности антигенов А или В. Через 3 мин в капли смеси сыворотки с эритроцитами, в которых наступила агглютинация, добавляют по одной капле (0,05 мл) изотонического раствора хлорида натрия и продолжают наблюдение при периодическом покачивании пластинки до истечения 5 мин.
Совместимость различных групп крови
Определение групп крови
Определение группы крови системы AB0
с помощью моноклональных антител
Определение группы крови перекрестным способом проводится одновременно при помощи изогемагглютинирующих сывороток и стандартных эритроцитов. При этом способе определяют наличие или отсутствие агглютиногенов и, кроме того, при помощи стандартных эритроцитов устанавливают наличие или отсутствие групповых агглютининов.
Для определения групповой принадлежности крови применяют также стандартные реагенты — моноклональные антитела (цоликлоны) (анти-А и анти-В), реагент содержит краситель (розовый— для антител анти-А, синий— для антител анти-В). Моноклональные анти-А, анти-В, анти-АВ антитела являются продуктом жизнедеятельности специфических мышиных гибридом и принадлежат к иммуноглобулинам класса М.
Определение групп крови антителами анти-А и анти-В имеет ряд преимуществ по сравнению с определением изогемагглютинирующими сыворотками: обеспечиваются более высокие качество агглютинации, достоверность и надежность результатов, заметно упрощается процедура определения и сокращаются сроки реакции (наступает уже в первые 1–2 с).
Результаты реакции при определении групп крови различными методами представлены в таблице
Определение групп крови
Группа ИК по антигену | А. Результаты реакции со стандартными сыворотками | |||
αβ(I) | β(II) | α(III) | (IV) | |
I | – | – | – | – |
II | + | – | + | – |
III | + | + | – | – |
IV | + | + | + | – |
Группа ИК по антителу | Б. Результаты реакции со стандартными эритроцитами | |||
0(I) | А(II) | В(III) | АВ(IV) | |
αβ(I) | – | + | + | + |
β(II) | – | – | + | + |
α(III) | – | + | – | + |
нет (IV) | – | – | – | – |
Группа ИК по антигену | В.Результаты реакции с моноклональными антителами | |||
анти-А | анти-В | |||
0(I) | – | – | ||
А(II) | + | – | ||
В(III) | – | + | ||
АВ(IV) | + | + | ||
Примечание: ИК — исследуемая кровь; А — стандартные изогемагглютинирующие сыворотки; Б — стандартные эритроциты; В — моноклональные антитела; «+» — наличие реакции агглютинации, «–» — отсутствие реакции агглютинации.
Наряду с агглютининами в плазме крови содержатся гемолизины (обозначаемые аналогично агглютининам a и b). Они при встрече с одноименным агглютиногеном вызывают гемолиз эритроцитов. Их действие проявляется при температуре 37–40°С и уже через 30–40°С наступает гемолиз эритроцитов (при определении групповой принадлежности крови со стандартными сыворотками агглютинация эритроцитов не сопровождается гемолизом, так как процесс протекает при комнатной температуре).
Распространенность людей с группами крови: I(0) — 40–50% , II(А) — 30–40% , III(В) — 10–20%, IV(АВ) — 5%.
География: 40 % людей Центральной Европы имеют группу крови II(А), 90% Северной Америки — I (0), более 20% Центральной Азии — III(В). I (0) группа крови имеется у всех народов, II(А) — преобладает у жителей Европы, Ближнего Востока, Китая, Японии. Людей с III(В) группой крови меньше всех, с IV(АВ) — преобладают жители Индии, Центральной Азии, долины Нила. III(В) группы крови нет у аборигенов Америки и Австралии, II(А) — нет у Южно-африканских народов. 100% индейцев Южной Америки имеют I(0) группу крови.
В практике переливания крови (гемотрансфузия) и её компонентов обязательная проверка на совместимость по антигенам систем AB0 (4 группы) и Rh (2 группы), итого по 8 группам. Остальные системы (они известны как редкие) к несовместимости по группам крови приводят значительно реже, но также должны учитываться при гемотрансфузиях и при тестировании возможности развития гемолитической болезни новорождённого. Согласно данным Международного общества переливания крови (The International Society of Blood Transfusion ) к редким системам групп крови относят; Cartwright, Chido/Rodgers, Colton, Cost, Cromer, Diego, Dombrock, Duffy, Er, Gerbich, GIL, GLOB (Globoside), Hh, Ii, Indian, JMH (John Milton Hagen), Kell, Kidd, Knops, Kx, Landsteiner–Wiener, Lewis, Lutheran, MNS, OK, P, Raph, Rh, Scianna, Wright, Xg, Yt.
Антигенные свойства большинства этих антигенов выражены слабо, однако, эти системы имеют значение при частых переливаниях крови, приводящих к накоплению этих антигенов и проявлению их действия. Поэтому повторно переливать кровь одного и того же донора не рекомендуется.
studfile.net
Групповые системы эритроцитов. Групповая система ав0 и групповая система резус. Методы определения групп крови по системам ав0 и резус.
В зависимости от наличия в эритроцитах агглютиногенов А и В, а в сыворотке соответствующих им агглютининов α и β, все люди разделены на четыре группы:
Группа О (I) — в эритроцитах агглютиногенов нет, в сыворотке агглютинины α и β.
Группа А (II) — в эритроцитах агглютиноген А, в сыворотке агглютинин β.
Группа В (III) — в эритроцитах агглютиноген В, в сыворотке агглютинин α.
Группа АВ (IV) — в эритроцитах агглютиногены А и В, агглютининов в сыворотке нет.
В последнее время в системе АВ0 обнаружены разновидности классических антигенов А и В, а также другие антигены.
В основе определения групповой принадлежности крови лежит реакция прямой гемагглютинации при комнатной температуре, развивающаяся при встрече одноименных агглютининов и агглютиногенов.
Для определения группы крови по системе АВ0 существуют 3 способа:
1. с применением стандартных сывороток, содержащих естественные агглютинины в достаточном титре, позволяющих установить, какие агглютиногены содержатся в эритроцитах испытуемой крови;
2. с применением гибридомных препаратов, содержащих иммунные антитела анти-А, анти-В и анти-АВ, также позволяющих обнаружить агглютиногены А и В в эритроцитах испытуемой крови;
3. с помощью стандартных сывороток и стандартных эритроцитов (перекрестный способ). В этом случае одновременно определяются как агглютиногены, так и агглютинины крови, что позволяет дать наиболее полную групповую характеристику испытуемой крови.
При использовании первого и третьего способов берут 2 серии сывороток (контроль сыворотки) во избежание получения ошибочных результатов.
Определение групповой принадлежности крови с помощью стандартных сывороток.
На тарелку, пластинку, планшет с белой смачивающейся поверхностью под написанные стеклографом обозначения первых 3 групп крови наносят большие капли стандартных гемагглютинирующих сывороток первых 3-х групп в 2-х сериях. Каждая сыворотка берется отдельной пипеткой. Всего, таким образом, получается 6 капель сывороток (по 3 капли в 2 рядах).
Рядом с каплями сывороток помещают по маленькой капле испытуемой крови (капля крови должна быть в 5-10 раз меньше капли сыворотки).
Чистой сухой стеклянной палочкой смешивают капли крови с сывороткой, чтобы смесь окрасилась в равномерный красный цвет. Для каждой капли используют отдельную стеклянную палочку. Можно для смешивания использовать и уголки предметного стекла.
После смешивания капель пластинку покачивают 2-3 минуты, затем оставляют на 2 мин. в покое и снова покачивают, наблюдая за ходом реакции. Время реакции должно быть не менее 5 минут.
По истечении 3 минут в капли, добавляют по маленькой капле изотонического раствора хлорида натрия при медленном покачивании пластинки (тарелки, планшета).
Учитывают полученные результаты через 5 минут.
Трактовка результатов.
Реакция гемагглютинации может быть положительной и отрицательной.
При положительной реакции после смешивания испытуемой крови с сывороткой образуются мелкие хлопья агглютинатов, которые, сливаясь между собой, образуют большие хлопья, видимые невооруженным глазом. При этом сыворотка становится бесцветной или почти бесцветной.
В случаях отрицательной реакции смесь сыворотки и крови остается равномерно окрашенной в красный цвет в течение всего времени наблюдения, а агглютинаты в ней не обнаруживаются.
Обязательным условием правильной трактовки исследования является совпадение результатов реакции с сыворотками одной и той же группы разных серий.
При проведении описанного исследования возможны 4 варианта сочетаний положительных и отрицательных результатов:
Во всех каплях смесь эритроцитов испытуемой крови и стандартных сывороток окрашена в однородный красный цвет и нигде агглютинация не определяется, т.е. реакция агглютинации оказывается отрицательной во всех 6 каплях. Это свидетельствует об отсутствии в эритроцитах испытуемой крови агглютиногенов α и β, т.е. – о принадлежности ее к О (I) группе.
Если реакция агглютинации развилась при смешивании испытуемой крови с сыворотками О (I) и В (III) групп, — значит, в эритроцитах испытуемой крови содержится агглютиноген α, т.е. она принадлежит к группе А (II).
В случаях агглютинации эритроцитов испытуемой крови стандартными сыворотками О(I) и А (II) групп можно утверждать о том, что на оболочке эритроцитов имеется агглютиноген β, т.е. кровь относится к В(III) группе.
Если агглютинация произошла во всех каплях, — это может свидетельствовать о наличии в эритроцитах испытуемой крови агглютиногенов α и β, но утверждать это можно только исключив неспецифическую агглютинацию, для чего в таких случаях проводится обязательное контрольное исследование с сывороткой IV группы. Если при этом реакция агглютинации не развивается, можно с уверенностью отрицать неспецифическую агглютинацию в предшествовавшем опыте и отнести испытуемую кровь к АВ (IV) группе.
Определение групповой принадлежности крови с помощью цоликлонов.
Применение цоликлонов так же, как и использование поликлональных сывороток, позволяет определить групповую принадлежность крови по системе АВ0, благодаря обнаружению агглютиногенов эритроцитов в реакции прямой гемагглютинации.
Цоликлоны анти-А, анти-В и анти-АВ представляют собой моноклональные антитела класса М, продуцируемые мышиными гибридомами.
1) На плоскость наносятся отдельными пипетками большие капли цоликлонов анти-А, анти-В и анти-АВ под соответствующими надписями.
2) Рядом с каплями реагентов наносят в 10 раз меньшие капли исследуемой крови (по одной капле крови рядом с каждой каплей реагента).
3) Кровь смешивается с реагентами отдельными стеклянными палочками.
4) Пластина или планшет покачиваются в течение 3 минут.
5) Учитывают реакцию.
Трактовка результатов.
Возможно получение 4 вариантов результатов исследования:
1) Если реакция агглютинации не развилась с цоликлонами анти-А, анти-В и анти-АВ, — то исследуемую кровь следует отнести к 0 (I) группе, так как ее эритроциты не содержат агглютиногенов А и В.
2) Если реакция агглютинации отмечена после смешивания капли исследуемой крови с реагентами анти-А и анти-АВ, — значит, эритроциты содержат агглютиноген А, а исследуемая кровь должна быть отнесена к группе А(II). При этом агглютинация с цоликлоном анти-В отсутствует.
3) Если наблюдается реакция агглютинации с цоликлонами анти-В и анти-АВ, но отсутствует с цоликлоном анти-А, — исследуемая кровь относится к В(III) группе, так как ее эритроциты содержат агглютиноген В.
4) Если наблюдается положительная реакция агглютинации во всех 3 каплях, где смешаны реагенты с каплями испытуемой крови, — эритроциты исследуемой крови содержат агглютиногены А и В, а значит, кровь относится к АВ (IV) группе. Но для обоснованного утверждения этого факта необходимо исключить спонтанную неспецифическую реакцию. Для этого следует произвести смешивание капли исследуемой крови с каплей изотонического раствора хлорида натрия на плоскости. При отсутствии агглютинации в контрольном исследовании исследуемая кровь с уверенностью может быть отнесена к АВ (IV) группе.
Определение групповой принадлежности крови перекрестным способом.
Этот метод определения групповой принадлежности крови предполагает одновременное определение как агглютиногенов в эритроцитах исследуемой крови, так и агглютининов, содержащихся в ее плазме или сыворотке. В качестве диагностикумов используют как стандартные гамагглютинирующие сыворотки, так и стандартные эритроциты с известной групповой принадлежностью.
1) Под предварительно сделанными обозначениями на пластинке с белой смачивающейся поверхностью наносят большие капли стандартных гемагглютинирующих сывороток первых 3 групп в двух сериях. Капли сывороток должны быть объемом не меньше 0,1 мл. Таким образом, получаются 6 капель, располагающихся в 2 ряда.
2) На нижнюю часть пластинки, также под соответствующими обозначениями, наносят маленькие капли (0,01 мл) взвеси стандартных эритроцитов первых 3 групп.
3) Из пробирки, содержащей центрифугированную испытуемую кровь, пипеткой извлекают сыворотку (плазму) и смешивают большие капли плазмы (сыворотки) объемом 0,1 мл со стандартными эритроцитами.
Теми же пипетками наносят маленькие (0,01 мл) капли осадка эритроцитов испытуемой крови рядом с каплями стандартных гемагглютинирующих сывороток.
4) Капли, в которых смешаны эритроциты испытуемой крови со стандартными сыворотками, и плазма испытуемой крови со стандартными эритроцитами, перемешивают раздельными стеклянными палочками, пластинку покачивают, затем оставляют в покое 1-2 минуты и снова покачивают. Наблюдение за развивающейся реакцией проводят не менее 5 минут.
5) По истечении 3 минут во все капли, добавляют по капле физраствора, снова покачивают пластинку для лучшего смешивания реагентов и учитывают результаты через 5 минут.
Трактовка результатов.
Трактовка результатов предполагает сравнение результатов взаимодействия стандартных эритроцитов с плазмой испытуемой крови и стандартных гемагглютинирующих сывороток с эритроцитами крови, групповая принадлежность которой должна быть установлена. Возможны 4 комбинации:
1) При взаимодействии со стандартными сыворотками эритроцитов испытуемой крови агглютинация не развилась ни в одной из проб. Это свидетельствует об отсутствии в эритроцитах агглютиногенов А и В. При смешивании стандартных эритроцитов с плазмой испытуемой крови агглютинации нет только с эритроцитами 0(I) группы, а есть — с эритроцитами А(II) и В(III) групп. Последнее подтверждает принадлежность испытуемой крови к 0(I) группе, т.к. указывает на наличие в ее сыворотке агглютининов альфа и бета.
2) При взаимодействии эритроцитов испытуемой крови со стандартными сыворотками произошла агглютинация с сыворотками 0(I) и В(III) групп при отсутствии иммунного склеивания эритроцитов в капле сыворотки А(II) группы. Это свидетельствует о наличии в эритроцитах испытуемой крови агглютиногена А. Сыворотка (плазма) испытуемой крови дает агглютинацию со стандартными эритроцитами В(III) группы, а с эритроцитами 0(I) и А(II) — нет. Это подтверждает принадлежность испытуемой крови к А(II) группе, т.к. свидетельствует о наличии в сыворотке агглютинина бета.
3) При положительной реакции агглютинации со стандартными сыворотками 0(I) и А(II) групп констатируется наличие в эритроцитах испытуемой крови агглютиногена В, т.е. утверждается ее принадлежность к В(III) группе. При смешивании сыворотки (плазмы) испытуемой крови со стандартными эритроцитами реакция агглютинации оказывается отрицательной с эритроцитами 0(I) и В(III) групп, но положительной с эритроцитами А(II) группы. Таким образом обнаруживается наличие в сыворотке испытуемой крови агглютинина альфа, что подтверждает принадлежность испытуемой крови к В(III) группе.
4) При смешивании эритроцитов испытуемой крови со стандартными сыворотками получают реакцию агглютинации во всех 6 каплях, где происходило смешивание исследуемых эритроцитов с сыворотками первых 3 групп в 2 сериях. При контрольном исследовании с сывороткой АВ(IV) группы реакция агглютинации оказывается отрицательной, что позволяет говорить о принадлежности испытуемой крови к АВ(IV) группе. Исследование результатов взаимодействия сыворотки (плазмы) исследуемой крови со стандартными эритроцитами во всех случаях покажет отсутствие агглютинации, что свидетельствует об отсутствии естественных агглютининов против агглютиногенов А и В в плазме испытуемой крови, т.е. подтвердит ее принадлежность к АВ (IV) группе.
Определение резус-принадлежности крови
В настоящее время существует несколько способов определения резус-принадлежности крови (констатации наличия или отсутствия Rh0D антигена в эритроцитах. Следует отметить, что наибольшую роль в трансфузиологии играет резус-фактор D (Rh0 D), поэтому обычно применяемые пробы на резус-принадлежность выявляют именно эту разновидность резус-антигена.
Определение резус-принадлежности с помощью цоликлона анти-Д-Супер.
Действующим началом этого препарата являются моноклональные полные антирезусные антитела, относящиеся к классу Ig M.
1. Определение резус-принадлежности на плоскости.
На пластинку со смачивающейся поверхностью наносят 1 каплю Цоликлона Анти-D-Cynep.
Рядом помещается в 5-10 раз меньшая по объему капля испытуемой крови или взвеси эритроцитов.
Кровь (взвесь эритроцитов) смешивают с реагентом.
Через 20-30 секунд после смешивания пластинку слегка покачивают в течение 3 минут.
Учитывают результаты путем осмотра невооруженным глазом.
Трактовка результатов.
Появление агглютинации при смешивании испытуемой крови с реагентом свидетельствует о том, что эритроциты крови содержат антиген Rh0D, т.е. являются резус-положительными. При отсутствии агглютинации исследуемая кровь расценивается как резус-отрицательная.
Определение резус-фактора Rh0(D) реакцией конглютинации с применением желатина.
В 2 пробирки вносят по 1 капле взвеси исследуемых эритроцитов и по 2 капли 10% раствора желатина, подогретого до 46-48 градусов до разжижения.
В одну из пробирок добавляют 2 капли группоспецифической (т.е. относящейся к той же группе по системе АВО, что и исследуемые эритроциты) антирезусной человеческой сыворотки. В другую пробирку сыворотку не добавляют (она служит для контроля специфичности агглютинации)
Параллельно таким же образом в отдельных маркированных пробирках исследуют стандартные резус- положительные и резус-отрицательные эритроциты (их смешивают с антирезусной сывороткой и раствором желатина, как описано в предыдущих пунктах).
Содержимое пробирок перемешивают и пробирки помещают на водяную баню при температуре 46-48 градусов на 15 минут или в термостат при такой же температуре на 30 минут.
По истечении указанного времени пробирки извлекают из термостата (водяной бани) и добавляют в каждую из них по 5-8 мл физраствора, с которым содержимое пробирок тщательно перемешивают.
Оценивают результаты просматриванием пробирок в проходящем свете невооруженным глазом или через лупу с 2-5-кратным увеличением.
Трактовка результатов.
При положительном результате (исследуемые эритроциты резус-положительны и дают реакцию агглютинации с антирезусными сыворотками) агглютинаты хорошо заметны на фоне почти обесцвеченной жидкости. При отрицательном результате жидкость в пробирке со взвесью испытуемых эритроцитов окрашена в равномерный красный или розовый цвет, а хлопья агглютинатов не выявляются. Результат учитывают как истинный при наличии агглютинации в параллельном опыте со стандартными резус-положительными эритроцитами и при отсутствии агглютинации в опыте со стандартными резус-отрицательными эритроцитами, а также — в пробирке, содержащей только исследуемые эритроциты и желатин (контроль специфичности реакции).
Положительный результат свидетельствует о том, что эритроциты испытуемой крови содержат резус-антиген (т.е.являются резус-положительными), а отрицательный — о том, что исследуемые эритроциты не содержат резус-антигена, т.е. являются резус-отрицательными.
Дополнение. Для исследования можно применять как нативную кровь, так и в смеси с консервантом, но в последнем случае консервант необходимо отмыть десятикратным объемом изотонического раствора хлорида натрия. Кроме того, в каждом случае определения резус-принадлежности этим способом следует использовать группоспецифические антирезусные сыворотки 2 серий (контроль сыворотки).
Определение резус-принадлежности с помощью универсального антирезусного реагента Rh0(D).
Универсальный антирезусный реагент представляет собой человеческую сыворотку, содержащую антирезусные антитела, но лишенную антител альфа и бета, — почему она и может быть использована для определения резус-принадлежности крови любой группы системы АВО. С целью обеспечения протекания реакции в нее добавляют 33% раствор полиглюкина или 20% раствор альбумина
В коническую пробирку помещают 1 каплю исследуемой крови или взвеси эритроцитов.
Добавляют 2 капли универсального антирезусного реагента и смешивают с исследуемой кровью.
Наклоняют пробирку с тем, чтобы содержимое ее растекалось по стенкам, и медленно вращают пробирку вокруг вертикальной оси для лучшего контакта эритроцитов и реагента в течение 5 минут.
По истечении 5 минут добавляют 2-3 мл изотонического раствора хлорида натрия и перемешивают (не взбалтывая) содержимое пробирки.
Учитывают результат, рассматривая содержимое пробирки в проходящем свете невооруженным глазом.
Трактовка результатов.
При наличии агглютинатов и просветлении жидкости в пробирке исследуемые эритроциты содержат Rh 0(D) антиген, а испытуемая кровь является резус-положительной. При отсутствии агглютинатов и розовой окраске жидкости, дающей при встряхивании пробирки перламутровый отлив, — исследуемая кровь является резус-отрицательной.
studfile.net
Методы как определить группы крови (стандартными сыворотками, цоликлонами)
В современной медицине группа крови характеризует набор расположенных на поверхности эритроцитов антигенов, которые определяют их специфичность.
Существует огромное количество таких антигенов (обычно применяется таблица групп крови с разнообразными антигенами), но повсеместно производится определение группы крови с использованием классификации по резус-фактору и системе АВ0.
Определение группы является обязательной процедурой при подготовке к любой операции. Такой анализ также необходим при поступлении на службу в некоторые контингенты, среди которых военные, работники внутренних органов и силовых структур. Данное мероприятие проводится из-за повышенного риска возникновения состояния, угрожающего жизни человека, в целях сокращения времени, требуемого для оказания помощи в виде переливания крови.
Состав крови различных групп крови
Суть системы АВ0 состоит в наличии структур антигенов на эритроцитах. В плазме нет соответствующих им типовых антител (гамма-глобулинов). Поэтому для исследования крови можно использовать реакцию «антиген + антитело».
Эритроциты склеиваются в момент встречи антигена и антитела. Подобная реакция носит название гемагглютинации. Реакция отображается в виде небольших хлопьев при проведении анализа. Исследование основано на получении изображения агглютинации с сыворотками.
Связываются антигены эритроцитов «А» с антителами «ά», а также «В» с «β» соответственно.
Выделяются следующие группы крови по составу:
- I (0) – ά, β — поверхность эритроцитов совсем не содержит антигенов,
- II (А) – β — на поверхности имеется антиген А и антитело β,
- III (В) – ά — поверхность содержит В с антителом типа ά,
- IV (АВ) – 00 — поверхность содержит оба антигена, однако не имеет антител.
Определение групп крови
Антигены есть у зародыша уже в состоянии эмбриона, а агглютинины (антитела) появляются на первом месяце жизни.
Методы определения
Стандартный метод
Существует множество техник, однако в лаборатории обычно используют определение с помощью стандартных сывороток.
Метод по стандартным сывороткам используется для определения типов антигенов АВ0. Состав стандартной изогемагглютинирующей сыворотки содержит набор антител к молекулам эритроцитов. В случае наличия антигена, который подвержен действию антител, формируется комплекс антиген-антитело, что запускает каскад реакций иммунитета.
Результатом данной реакции является агглютинация эритроцитов, на основании характера происходящей агглютинации можно определить принадлежность образца к какой-либо группе.
Для приготовления стандартной сыворотки используется донорская кровь и определенная система — посредством выделения плазмы, включающей антитела, и последующего ее разведения. Разведение выполняется с использованием изотонического раствора натрий хлорида.
Разведение производится так:
В пробирку, содержащую 1 миллилитр 0.9 %-го раствора пищевой соли, необходимо добавить 1 миллилитр плазмы. Раствор тщательно перемешать.- Затем пипеткой отбирают полученный раствор плазмы в объеме 1 миллилитр. Добавляют его в пробирку, которая содержит изотонический раствор. Так необходимо достигнуть разведения плазмы с соотношением 1 к 256. Применение других разведений несет риск возникновения диагностической ошибки.
В пробирку, содержащую 1 миллилитр 0.9 %-го раствора пищевой соли, необходимо добавить 1 миллилитр плазмы. Раствор тщательно перемешать.Непосредственно исследование проводится таким образом:
- На специальный планшет помещают по капле каждой сыворотки (общим объемом примерно 0.1 миллилитр) на участок, где имеется соответствующая пометка (применяются 2 образца, из них один – контрольный, второй предназначен для исследования).
- Затем рядом с каждой каплей сыворотки размещают исследуемый образец в объеме 0.01 миллилитра, после чего его по отдельности смешивают с каждым диагностикумом.
Правила расшифровки результатов
Спустя пять минут можно производить оценку результатов исследования. В больших каплях сыворотки происходит просветление, в одних наблюдается реакция агглютинации (образуются мелкие хлопья), в других – нет.
Видео: Определение группы крови и резус-фактора
Здесь возможны варианты:
- Если реакции агглютинации нет в обеих пробах с сыворотками II и III (+ контрольные 1 и IV) — определение первой группы,
- Если свертывание наблюдается во всех пробах, кроме II — определение второй,
- При отсутствии реакции агглютинации только в пробе с III группы — определение III,
- Если свертываемость наблюдается во всех пробах, в том числе в IV-контрольной — определение IV.
Когда сыворотки располагаются в правильном порядке и на тарелке стоят подписи, ориентироваться легко: группа соответствует местам с отсутствующей агглютинацией.
В некоторых случаях склеивание неясно различимо. Тогда анализ необходимо переделать, мелкую агглютинацию наблюдают под микроскопом.
Метод перекрестной реакции
Суть этой техники состоит в определении агглютиногенов при помощи стандартных сывороток или цоликлонов с параллельным определением агглютининов с помощью эталонных эритроцитов.
Техника анализа перекрестным методом практически не имеет отличий от исследования с помощью сывороток, но присутствуют некоторые дополнения.
На планшетку под сыворотками необходимо добавить по капле стандартных эритроцитов. Затем из пробирки с кровью пациента, прошедшую через центрифугу, пипеткой извлекают плазму, которую помещают к стандартным эритроцитам, находящиеся на дне – добавляют в стандартную сыворотку.
Так же, как и согласно технике стандартной методики, результаты исследования оценивают спустя несколько минут после начала реакции. В случае наличия реакции агглютинации можно говорить о наличии агглютининов АВ0, в случае реакции плазмы можно судить об агглютиногенах.
Результаты исследования крови с применением стандартных эритроцитов и сывороток:
| Наличие агглютинации при реакции со стандартными изогемагглютинирующими сыворотками | Наличие агглютинации при реакции со стандартными эритроцитами | Группы крови |
| 0(I) | A(II) | B(III) | AB(IV) | 0(I) | A(II) | B(III) | |
| – | – | – | — | – | + | + | 0(I) |
| + | – | + | — | – | – | + | A(II) |
| + | + | – | — | – | + | – | B(III) |
| + | + | + | – | – | – | – | AB(IV) |
+ агглютинация,
– агглютинация отсутствует,
реакцию не проводят.
Перекрестный метод получил распространение за счет того, что он предотвращает диагностические ошибки, возникающие при применении стандартных методик.
Определение группы крови цоликлонами
Цоликлоны — синтетические заменители сывороток, которые содержат в своем составе искусственные заменители агглютининов типов ά и β. Они называются эритротестами «Цоликлон анти-А» (имеют розовый цвет), а также «анти-В» (имеют синий цвет). Ожидаемая агглютинация наблюдается между агглютининами цоликлонов и эритроцитами крови.
Цоликлоны
Данная методика не требует двух серий, она является более надежной и точной. Проведение исследования и оценка его результатов происходят так же, как и в стандартном методе.
| Вид цоликлонов | Группа крови |
| Результат агглютинации | Анти-А | Анти-В | |
| — | — | 0(I) | |
| + | — | A(II) | |
| — | + | B(III) | |
| + | + | AB(IV) |
IV группа (АВ) обязательно подтверждается агглютинацией с цоликлоном «анти-АВ», а также отсутствием склеивания эритроцитов в изотоническом растворе натрия хлорида.
Экспресс-методика с помощью набора «Эритротест-группокарт»
Хотя общепринятые способы определения принадлежности крови к конкретной группе распространены повсеместно, в современной медицине происходит внедрение экспресс-методов, самым распространенным из которых является “Эритротест”.
При определении группы с применением методики “Эритротест группокарт” необходим комплект инструментов, включающий следующие приборы:
- Планшетка, имеющая с пять лунок, для произведения определения группы по ее резус-принадлежности и системе АВ0,
- Скарификатор, предназначенный для получения образца, необходимого для исследования,
- Стеклянные палочки для перемешивания образцов,
- Чистая пипетка для набора растворов.
Все перечисленные инструменты необходимо для безошибочного проведения диагностики.
Набор для анализа крови “Эритротест-группокарт” позволяет проводить исследование резус-фактора и определение группы крови в любых условиях, она особенно эффективна при отсутствии возможности использования общепринятых методов.
В лунках на планшетке расположены цоликлоны к антигенам (это цоликлоны анти-А, -В, -АВ) и к основному антигену, который обуславливает наследование резус-фактора (это цоликлон анти-D). Пятая лунка содержит контрольный реагент, который позволяет предотвратить возможные ошибки и грамотно определить принадлежность к группе крови.
Видео: Определения групп крови с помощью цоликлонов
Загрузка…kardiobit.ru
Групповые системы эритроцитов. Групповая система ав0 и групповая система резус. Методы определения групп крови по системам ав0 и резус.
В зависимости от наличия в эритроцитах агглютиногенов А и В, а в сыворотке соответствующих им агглютининов α и β, все люди разделены на четыре группы:
Группа О (I) — в эритроцитах агглютиногенов нет, в сыворотке агглютинины α и β.
Группа А (II) — в эритроцитах агглютиноген А, в сыворотке агглютинин β.
Группа В (III) — в эритроцитах агглютиноген В, в сыворотке агглютинин α.
Группа АВ (IV) — в эритроцитах агглютиногены А и В, агглютининов в сыворотке нет.
В последнее время в системе АВ0 обнаружены разновидности классических антигенов А и В, а также другие антигены.
В основе определения групповой принадлежности крови лежит реакция прямой гемагглютинации при комнатной температуре, развивающаяся при встрече одноименных агглютининов и агглютиногенов.
Для определения группы крови по системе АВ0 существуют 3 способа:
1. с применением стандартных сывороток, содержащих естественные агглютинины в достаточном титре, позволяющих установить, какие агглютиногены содержатся в эритроцитах испытуемой крови;
2. с применением гибридомных препаратов, содержащих иммунные антитела анти-А, анти-В и анти-АВ, также позволяющих обнаружить агглютиногены А и В в эритроцитах испытуемой крови;
3. с помощью стандартных сывороток и стандартных эритроцитов (перекрестный способ). В этом случае одновременно определяются как агглютиногены, так и агглютинины крови, что позволяет дать наиболее полную групповую характеристику испытуемой крови.
При использовании первого и третьего способов берут 2 серии сывороток (контроль сыворотки) во избежание получения ошибочных результатов.
Определение групповой принадлежности крови с помощью стандартных сывороток.
На тарелку, пластинку, планшет с белой смачивающейся поверхностью под написанные стеклографом обозначения первых 3 групп крови наносят большие капли стандартных гемагглютинирующих сывороток первых 3-х групп в 2-х сериях. Каждая сыворотка берется отдельной пипеткой. Всего, таким образом, получается 6 капель сывороток (по 3 капли в 2 рядах).
Рядом с каплями сывороток помещают по маленькой капле испытуемой крови (капля крови должна быть в 5-10 раз меньше капли сыворотки).
Чистой сухой стеклянной палочкой смешивают капли крови с сывороткой, чтобы смесь окрасилась в равномерный красный цвет. Для каждой капли используют отдельную стеклянную палочку. Можно для смешивания использовать и уголки предметного стекла.
После смешивания капель пластинку покачивают 2-3 минуты, затем оставляют на 2 мин. в покое и снова покачивают, наблюдая за ходом реакции. Время реакции должно быть не менее 5 минут.
По истечении 3 минут в капли, добавляют по маленькой капле изотонического раствора хлорида натрия при медленном покачивании пластинки (тарелки, планшета).
Учитывают полученные результаты через 5 минут.
Трактовка результатов.
Реакция гемагглютинации может быть положительной и отрицательной.
При положительной реакции после смешивания испытуемой крови с сывороткой образуются мелкие хлопья агглютинатов, которые, сливаясь между собой, образуют большие хлопья, видимые невооруженным глазом. При этом сыворотка становится бесцветной или почти бесцветной.
В случаях отрицательной реакции смесь сыворотки и крови остается равномерно окрашенной в красный цвет в течение всего времени наблюдения, а агглютинаты в ней не обнаруживаются.
Обязательным условием правильной трактовки исследования является совпадение результатов реакции с сыворотками одной и той же группы разных серий.
При проведении описанного исследования возможны 4 варианта сочетаний положительных и отрицательных результатов:
Во всех каплях смесь эритроцитов испытуемой крови и стандартных сывороток окрашена в однородный красный цвет и нигде агглютинация не определяется, т.е. реакция агглютинации оказывается отрицательной во всех 6 каплях. Это свидетельствует об отсутствии в эритроцитах испытуемой крови агглютиногенов α и β, т.е. – о принадлежности ее к О (I) группе.
Если реакция агглютинации развилась при смешивании испытуемой крови с сыворотками О (I) и В (III) групп, — значит, в эритроцитах испытуемой крови содержится агглютиноген α, т.е. она принадлежит к группе А (II).
В случаях агглютинации эритроцитов испытуемой крови стандартными сыворотками О(I) и А (II) групп можно утверждать о том, что на оболочке эритроцитов имеется агглютиноген β, т.е. кровь относится к В(III) группе.
Если агглютинация произошла во всех каплях, — это может свидетельствовать о наличии в эритроцитах испытуемой крови агглютиногенов α и β, но утверждать это можно только исключив неспецифическую агглютинацию, для чего в таких случаях проводится обязательное контрольное исследование с сывороткой IV группы. Если при этом реакция агглютинации не развивается, можно с уверенностью отрицать неспецифическую агглютинацию в предшествовавшем опыте и отнести испытуемую кровь к АВ (IV) группе.
Определение групповой принадлежности крови с помощью цоликлонов.
Применение цоликлонов так же, как и использование поликлональных сывороток, позволяет определить групповую принадлежность крови по системе АВ0, благодаря обнаружению агглютиногенов эритроцитов в реакции прямой гемагглютинации.
Цоликлоны анти-А, анти-В и анти-АВ представляют собой моноклональные антитела класса М, продуцируемые мышиными гибридомами.
1) На плоскость наносятся отдельными пипетками большие капли цоликлонов анти-А, анти-В и анти-АВ под соответствующими надписями.
2) Рядом с каплями реагентов наносят в 10 раз меньшие капли исследуемой крови (по одной капле крови рядом с каждой каплей реагента).
3) Кровь смешивается с реагентами отдельными стеклянными палочками.
4) Пластина или планшет покачиваются в течение 3 минут.
5) Учитывают реакцию.
Трактовка результатов.
Возможно получение 4 вариантов результатов исследования:
1) Если реакция агглютинации не развилась с цоликлонами анти-А, анти-В и анти-АВ, — то исследуемую кровь следует отнести к 0 (I) группе, так как ее эритроциты не содержат агглютиногенов А и В.
2) Если реакция агглютинации отмечена после смешивания капли исследуемой крови с реагентами анти-А и анти-АВ, — значит, эритроциты содержат агглютиноген А, а исследуемая кровь должна быть отнесена к группе А(II). При этом агглютинация с цоликлоном анти-В отсутствует.
3) Если наблюдается реакция агглютинации с цоликлонами анти-В и анти-АВ, но отсутствует с цоликлоном анти-А, — исследуемая кровь относится к В(III) группе, так как ее эритроциты содержат агглютиноген В.
4) Если наблюдается положительная реакция агглютинации во всех 3 каплях, где смешаны реагенты с каплями испытуемой крови, — эритроциты исследуемой крови содержат агглютиногены А и В, а значит, кровь относится к АВ (IV) группе. Но для обоснованного утверждения этого факта необходимо исключить спонтанную неспецифическую реакцию. Для этого следует произвести смешивание капли исследуемой крови с каплей изотонического раствора хлорида натрия на плоскости. При отсутствии агглютинации в контрольном исследовании исследуемая кровь с уверенностью может быть отнесена к АВ (IV) группе.
Определение групповой принадлежности крови перекрестным способом.
Этот метод определения групповой принадлежности крови предполагает одновременное определение как агглютиногенов в эритроцитах исследуемой крови, так и агглютининов, содержащихся в ее плазме или сыворотке. В качестве диагностикумов используют как стандартные гамагглютинирующие сыворотки, так и стандартные эритроциты с известной групповой принадлежностью.
1) Под предварительно сделанными обозначениями на пластинке с белой смачивающейся поверхностью наносят большие капли стандартных гемагглютинирующих сывороток первых 3 групп в двух сериях. Капли сывороток должны быть объемом не меньше 0,1 мл. Таким образом, получаются 6 капель, располагающихся в 2 ряда.
2) На нижнюю часть пластинки, также под соответствующими обозначениями, наносят маленькие капли (0,01 мл) взвеси стандартных эритроцитов первых 3 групп.
3) Из пробирки, содержащей центрифугированную испытуемую кровь, пипеткой извлекают сыворотку (плазму) и смешивают большие капли плазмы (сыворотки) объемом 0,1 мл со стандартными эритроцитами.
Теми же пипетками наносят маленькие (0,01 мл) капли осадка эритроцитов испытуемой крови рядом с каплями стандартных гемагглютинирующих сывороток.
4) Капли, в которых смешаны эритроциты испытуемой крови со стандартными сыворотками, и плазма испытуемой крови со стандартными эритроцитами, перемешивают раздельными стеклянными палочками, пластинку покачивают, затем оставляют в покое 1-2 минуты и снова покачивают. Наблюдение за развивающейся реакцией проводят не менее 5 минут.
5) По истечении 3 минут во все капли, добавляют по капле физраствора, снова покачивают пластинку для лучшего смешивания реагентов и учитывают результаты через 5 минут.
Трактовка результатов.
Трактовка результатов предполагает сравнение результатов взаимодействия стандартных эритроцитов с плазмой испытуемой крови и стандартных гемагглютинирующих сывороток с эритроцитами крови, групповая принадлежность которой должна быть установлена. Возможны 4 комбинации:
1) При взаимодействии со стандартными сыворотками эритроцитов испытуемой крови агглютинация не развилась ни в одной из проб. Это свидетельствует об отсутствии в эритроцитах агглютиногенов А и В. При смешивании стандартных эритроцитов с плазмой испытуемой крови агглютинации нет только с эритроцитами 0(I) группы, а есть — с эритроцитами А(II) и В(III) групп. Последнее подтверждает принадлежность испытуемой крови к 0(I) группе, т.к. указывает на наличие в ее сыворотке агглютининов альфа и бета.
2) При взаимодействии эритроцитов испытуемой крови со стандартными сыворотками произошла агглютинация с сыворотками 0(I) и В(III) групп при отсутствии иммунного склеивания эритроцитов в капле сыворотки А(II) группы. Это свидетельствует о наличии в эритроцитах испытуемой крови агглютиногена А. Сыворотка (плазма) испытуемой крови дает агглютинацию со стандартными эритроцитами В(III) группы, а с эритроцитами 0(I) и А(II) — нет. Это подтверждает принадлежность испытуемой крови к А(II) группе, т.к. свидетельствует о наличии в сыворотке агглютинина бета.
3) При положительной реакции агглютинации со стандартными сыворотками 0(I) и А(II) групп констатируется наличие в эритроцитах испытуемой крови агглютиногена В, т.е. утверждается ее принадлежность к В(III) группе. При смешивании сыворотки (плазмы) испытуемой крови со стандартными эритроцитами реакция агглютинации оказывается отрицательной с эритроцитами 0(I) и В(III) групп, но положительной с эритроцитами А(II) группы. Таким образом обнаруживается наличие в сыворотке испытуемой крови агглютинина альфа, что подтверждает принадлежность испытуемой крови к В(III) группе.
4) При смешивании эритроцитов испытуемой крови со стандартными сыворотками получают реакцию агглютинации во всех 6 каплях, где происходило смешивание исследуемых эритроцитов с сыворотками первых 3 групп в 2 сериях. При контрольном исследовании с сывороткой АВ(IV) группы реакция агглютинации оказывается отрицательной, что позволяет говорить о принадлежности испытуемой крови к АВ(IV) группе. Исследование результатов взаимодействия сыворотки (плазмы) исследуемой крови со стандартными эритроцитами во всех случаях покажет отсутствие агглютинации, что свидетельствует об отсутствии естественных агглютининов против агглютиногенов А и В в плазме испытуемой крови, т.е. подтвердит ее принадлежность к АВ (IV) группе.
Определение резус-принадлежности крови
В настоящее время существует несколько способов определения резус-принадлежности крови (констатации наличия или отсутствия Rh0D антигена в эритроцитах. Следует отметить, что наибольшую роль в трансфузиологии играет резус-фактор D (Rh0 D), поэтому обычно применяемые пробы на резус-принадлежность выявляют именно эту разновидность резус-антигена.
Определение резус-принадлежности с помощью цоликлона анти-Д-Супер.
Действующим началом этого препарата являются моноклональные полные антирезусные антитела, относящиеся к классу Ig M.
1. Определение резус-принадлежности на плоскости.
На пластинку со смачивающейся поверхностью наносят 1 каплю Цоликлона Анти-D-Cynep.
Рядом помещается в 5-10 раз меньшая по объему капля испытуемой крови или взвеси эритроцитов.
Кровь (взвесь эритроцитов) смешивают с реагентом.
Через 20-30 секунд после смешивания пластинку слегка покачивают в течение 3 минут.
Учитывают результаты путем осмотра невооруженным глазом.
Трактовка результатов.
Появление агглютинации при смешивании испытуемой крови с реагентом свидетельствует о том, что эритроциты крови содержат антиген Rh0D, т.е. являются резус-положительными. При отсутствии агглютинации исследуемая кровь расценивается как резус-отрицательная.
Определение резус-фактора Rh0(D) реакцией конглютинации с применением желатина.
В 2 пробирки вносят по 1 капле взвеси исследуемых эритроцитов и по 2 капли 10% раствора желатина, подогретого до 46-48 градусов до разжижения.
В одну из пробирок добавляют 2 капли группоспецифической (т.е. относящейся к той же группе по системе АВО, что и исследуемые эритроциты) антирезусной человеческой сыворотки. В другую пробирку сыворотку не добавляют (она служит для контроля специфичности агглютинации)
Параллельно таким же образом в отдельных маркированных пробирках исследуют стандартные резус- положительные и резус-отрицательные эритроциты (их смешивают с антирезусной сывороткой и раствором желатина, как описано в предыдущих пунктах).
Содержимое пробирок перемешивают и пробирки помещают на водяную баню при температуре 46-48 градусов на 15 минут или в термостат при такой же температуре на 30 минут.
По истечении указанного времени пробирки извлекают из термостата (водяной бани) и добавляют в каждую из них по 5-8 мл физраствора, с которым содержимое пробирок тщательно перемешивают.
Оценивают результаты просматриванием пробирок в проходящем свете невооруженным глазом или через лупу с 2-5-кратным увеличением.
Трактовка результатов.
При положительном результате (исследуемые эритроциты резус-положительны и дают реакцию агглютинации с антирезусными сыворотками) агглютинаты хорошо заметны на фоне почти обесцвеченной жидкости. При отрицательном результате жидкость в пробирке со взвесью испытуемых эритроцитов окрашена в равномерный красный или розовый цвет, а хлопья агглютинатов не выявляются. Результат учитывают как истинный при наличии агглютинации в параллельном опыте со стандартными резус-положительными эритроцитами и при отсутствии агглютинации в опыте со стандартными резус-отрицательными эритроцитами, а также — в пробирке, содержащей только исследуемые эритроциты и желатин (контроль специфичности реакции).
Положительный результат свидетельствует о том, что эритроциты испытуемой крови содержат резус-антиген (т.е.являются резус-положительными), а отрицательный — о том, что исследуемые эритроциты не содержат резус-антигена, т.е. являются резус-отрицательными.
Дополнение. Для исследования можно применять как нативную кровь, так и в смеси с консервантом, но в последнем случае консервант необходимо отмыть десятикратным объемом изотонического раствора хлорида натрия. Кроме того, в каждом случае определения резус-принадлежности этим способом следует использовать группоспецифические антирезусные сыворотки 2 серий (контроль сыворотки).
Определение резус-принадлежности с помощью универсального антирезусного реагента Rh0(D).
Универсальный антирезусный реагент представляет собой человеческую сыворотку, содержащую антирезусные антитела, но лишенную антител альфа и бета, — почему она и может быть использована для определения резус-принадлежности крови любой группы системы АВО. С целью обеспечения протекания реакции в нее добавляют 33% раствор полиглюкина или 20% раствор альбумина
В коническую пробирку помещают 1 каплю исследуемой крови или взвеси эритроцитов.
Добавляют 2 капли универсального антирезусного реагента и смешивают с исследуемой кровью.
Наклоняют пробирку с тем, чтобы содержимое ее растекалось по стенкам, и медленно вращают пробирку вокруг вертикальной оси для лучшего контакта эритроцитов и реагента в течение 5 минут.
По истечении 5 минут добавляют 2-3 мл изотонического раствора хлорида натрия и перемешивают (не взбалтывая) содержимое пробирки.
Учитывают результат, рассматривая содержимое пробирки в проходящем свете невооруженным глазом.
Трактовка результатов.
При наличии агглютинатов и просветлении жидкости в пробирке исследуемые эритроциты содержат Rh 0(D) антиген, а испытуемая кровь является резус-положительной. При отсутствии агглютинатов и розовой окраске жидкости, дающей при встряхивании пробирки перламутровый отлив, — исследуемая кровь является резус-отрицательной.
studfile.net
7.Наследование групп крови по система ав0, Rh, mn.
Генетико-физиологическая характеристика системы АВ0
С точки зрения генетики, наиболее изученной является система АВ0, определяющая I (0), II (А), III (В) и IV (АВ) группы крови. На поверхности эритроцитов могут находиться агглютиногены (антигены) А и В, а в плазме крови – агглютинины (антитела) и . В норме одноименные агглютиногены и агглютинины совместно не обнаруживаются. Нужно отметить, что А- и В-антигены образуют многочисленный ряд антигенов (А1, А2 … A; В1, В2 …В).
Наследование групп крови системы АВ0. В системе АВ0 синтез агглютиногенов и агглютининов определяется аллелями гена I: I0, IA, IB. Ген I контролирует и образование антигенов, и образование антител. При этом наблюдается полное доминирование аллелей IA иIB над аллелем I0, но совместное доминирование (кодоминирование) аллелей IA и IB. Соответствие генотипов, агглютиногенов, агглютининов и групп крови (фенотипов) можно выразить в виде таблицы:
Генотипы | Антигены (агглютиногены) | Антитела (агглютинины) | Группы крови (фенотипы) |
I 0 I 0 | Нет | α,β | I (0) |
I A I A, I A I 0 | А | β | II (A) |
I B I B, I B I 0 | В | α | III (B) |
I A I B | А, В | нет | IV (AB) |
В норме образуются нормальные антитела (агглютинины), которые синтезируются в очень небольших количествах; они относятся к классу М; при иммунизации чужеродными антигенами вырабатываются иммунные антитела класса G (подробнее различия между нормальными и иммунными антителами будут рассмотрены ниже). Если по каким-либо причинам агглютиноген А встречается с агглютинином или агглютиноген В встречается с агглютинином , то происходит реакция агглютинации – склеивания эритроцитов. В дальнейшем агглютинированные эритроциты подвергаются гемолизу (разрушению), продукты которого ядовиты.
Из-за кодоминирования наследование групп крови системы АВ0 происходит сложным образом. Например, если мать гетерозиготна по II группе крови (генотип IAI0), а отец гетерозиготен по III группе крови (генотип IBI0), то в их потомстве с равной вероятностью может родиться ребенок с любой группой крови. Если у матери I группа крови (генотип I0I0), а у отца IV группа крови (генотип IAIB), то в их потомстве с равной вероятностью может родиться ребенок или со II (генотип IAI0), или с III (генотип IBI0) группой крови (но не с I, и не с IV).
Резус-фактор
Белок на мембране эритроцитов. Присутствует у 85% людей — резус-положительных. Остальные 15% — резус-отрицательны.
Наследование: R- ген резус-фактора. r — отсутствие резус фактора.
Родители резус-положительны (RR, Rr) — ребенок может быть резус-положительным (RR, Rr) или резус-отрицательным (rr).
Один родитель резус-положительный (RR, Rr), другой резус-отрицательный (rr) — ребенок может быть резус-положительным (Rr) или резус-отрицательным (rr).
Родители резус-отрицательны, ребенок может быть только резус-отрицательным.
Резус-фактор, как и группу крови, необходимо учитывать при переливании крови. При попадании резус фактора в кровь резус-отрицательного человека, к нему образуются антирезусные антитела, которые склеивают резус-положительные эритроциты в монетные столбики.
Система МN
В 1927 году К. Ландштейнер и П. Левин обнаружили, что при введении кроликам красных кровяных телец человека у них вырабатываются антитела к антигенам человеческих клеток. Исследуя антитела к кровяным тельцам разных людей, Ландштейнер и Левин опознали два типа антител, которые назвали М и N. Кровяные клетки типа М вызывали у кроликов производство антител М, а клетки типа N — антител типа N. Выяснилось, что каждый человек имеет кровь типа М, типа N или типа MN — смести антигенов М и N.
Передача этих типов по наследству носит следующий характер:
Это значит, что люди с кровью типа М или N — гомозиготы по разным аллелям одного гена, а люди с кровью типа MN — гетерозиготы по обоим выраженным аллелям. Ген этого признака назван L в честь Ландштейнера; его два аллеля обозначаются как LM и LN. Эти аллели кодоминантны, то есть в гетерозиготах LM и LN они выражены в равной степени. Модель объясняет три вышеописанные схемы наследования. Кроме того, если родители гетерозиготы, то каждый из них образует половину гамет LM и половину гамет LN, которые, объединяясь, дают LMN.
studfile.net
Группа крови по системе AB0 и резус-принадлежность (Rh), кровь
Подготовка к исследованию: Исследуемый материал: Взятие крови
Определение принадлежности к определенной группе крови по системе AB0.
Группа крови — это генетически наследуемый признак, не изменяющийся в течение жизни при естественных условиях. Определение групповой принадлежности крови широко используется в клинической практике при переливании крови и ее компонентов, в гинекологии и акушерстве при планировании и ведении беременности. Система групп крови AB0 является основной системой, определяющей совместимость (или несовместимость) переливаемой крови, так как эти антигены наиболее иммуногенны. Особенностью системы AB0 является то, что в плазме у неиммунных людей имеются естественные антитела к отсутствующему на эритроцитах антигену. Систему групп крови AB0 составляют два групповых эритроцитарных антигена — агглютиногены А и В и два соответствующих антитела — агглютинины плазмы a (анти-А) и b (анти-В). Различные сочетания антигенов и антител образуют 4 группы крови.
Группа 0 аb (I) — на эритроцитах отсутствуют групповые агглютиногены, в плазме присутствуют агглютинины a; и b;Группа Аb (II) — эритроциты содержат только агглютиноген А, в плазме присутствует агглютинин b;Группа Ва (III) — эритроциты содержат только агглютиноген В, в плазме содержится агглютинин a;Группа АВ (IV) — на эритроцитах присутствуют антигены А и В, плазма агглютининов не содержит.
Определение групп крови проводят путем идентификации специфических антигенов и антител (двойной метод, или перекрестная реакция).
Несовместимость крови наблюдается, если эритроциты крови донора (реципиента) несут агглютиногены (А или В), а в плазме крови реципиента (донора) содержатся соответствующие агглютинины (a илиb): при этом происходит реакция агглютинации. Переливать эритроциты, плазму и, особенно, цельную кровь от донора к реципиенту нужно строго соблюдая групповую совместимость. Лучше всего переливать кровь, эритроциты и плазму той же группы, которая определена у реципиента. В экстренных случаях эритроциты группы 0 (но не цельную кровь!) можно переливать реципиентам с другими группами крови; эритроциты группы А можно переливать реципиентам с группой кровиА и АВ, а эритроциты от донора группы В — реципиентам группы В и АВ.
Групповые агглютиногены находятся в строме и оболочке эритроцитов. Антигены системы AB0 выявляются не только на эритроцитах, но и на клетках других тканей. Развиваются они на ранних стадиях внутриутробного развития и у новорожденного уже находятся в существенном количестве. Кровь новорожденных имеет возрастные особенности — в плазме могут еще не присутствовать характерные групповые агглютинины, которые начинают вырабатываться позже (постоянно обнаруживаются после 10 мес), и определение группы крови в этом случае проводится только по наличию антигенов системы АВ0.
Помимо ситуаций, связанных с необходимостью переливания крови, определение группы крови, резус-фактора, а также наличия аллоиммунных (изоиммунных) антиэритроцитарных антител должно проводиться при планировании или во время беременности для выявления вероятности иммунологического конфликта матери и ребенка, который может приводить к гемолитической болезни новорожденных.
Существуют разновидности (слабые варианты) антигена А (в большей степени) и реже — антигена В. Что касается антигена А, имеются варианты: «сильный», А1 (более 80%), слабый, А2 (менее 20%), и еще более слабые (A3, А4, Ax — редко). Это теоретическое понятие имеет значение для переливания крови и может вызвать несчастные случаи при отнесении донора А2 (II) к группе 0 (I) или донора А2В (IV) — к группе В (III), поскольку слабая форма антигена А иногда вызывает ошибки при определении группы крови по системе АВ0. Точное определение слабых вариантов антигена А может требовать повторных исследований со специфическими реагентами. Снижение или полное отсутствие естественных агглютининов a и b иногда отмечается при иммунодефицитных состояниях (у пациентов с новообразованиями и болезнями крови — болезнь Ходжкина, множественная миелома, хроническая лимфатическая лейкемия; врожденными гипо- и агаммаглобулинемиями; у детей раннего возраста и пожилых людей; при проведении иммуносупрессивной терапии, во время тяжелых инфекций). Трудности при определении группы крови вследствие подавления реакции гемагглютинации возникают также после введения плазмозаменителей, переливания крови, трансплантации, септицемии и др.
Наследование групп крови.
В основе закономерностей наследования групп крови системы АВ0 лежат следующие понятия. В локусе гена АВ0 возможны три варианта (аллеля) — 0, А и В, которые экспрессируются по аутосомнокодоминантному типу. Это означает, что у лиц, унаследовавших гены А и В, экспрессируются продукты обоих этих генов, что приводит к образованию фенотипа АВ (IV группа крови). Фенотип А (II группа крови) может быть у человека, унаследовавшего от родителей или два гена А (генотип АА), или гены А и 0 (генотип А0). Соответственно фенотип В (III группа крови) — при наследовании или двух геновВ (генотип ВВ), или В и 0 (генотип В0). Фенотип 0 (I группа крови) проявляется в случае наследовании двух генов 0 (генотип 00).
Это объясняет, почему в том случае, если оба родителя имеют II группу крови (с возможным генотипом А0), кто-то из их детей может иметь первую группу (генотип 00), или в случае, если у одного из родителей группа крови А(II) (с возможным генотипом А0), а у другогоВ(III) (с возможным генотипом В0) — дети могут иметь не только группы крови А(II) и В(III), но и 0(I) и АВ (IV).
analizmarket.ru