Профилактика потенции: Главная вещь в жизни каждого мужчины — ФГБУ «НМИЦ ТПМ» Минздрава России

Содержание

7 основных причин, приводящих к импотенции

Нормальная потенция обеспечивается гармоничной работой всего организма: не только тела, но и психики.

Современный ритм жизни не способствует идеальному здоровью. Стремительная урбанизация, ухудшение экологии, повышение среднего возраста населения нашей планеты – все это может стать негативными факторами для мужского здоровья.

Но решение всегда есть: простые правила здорового образа жизни помогут поддерживать нормальную потенцию!

Пребывание на свежем воздухе, регулярная физическая активность (будь то командные игры, велопробеги или просто прогулки с собакой), сбалансированное полноценное питание с достаточным количеством клетчатки и белка – все это поможет сохранить мужское здоровье до преклонного возраста.

1. Депрессия и стресс

Усталость и негативные эмоции – также возможные причины импотенции у мужчин в 40 лет, когда приходится искать разумный баланс между карьерой, детьми и личной жизнью.

А это совсем не просто…

Возможные причины импотенции у мужчин в молодом возрасте – психологические. Даже однократная неудача в постели может повлечь за собой страх вновь оказаться не на высоте, пессимистичные мысли. Стоит отложить секс до того момента, когда мужчина будет чувствовать себя отдохнувшим и полным сил.

Депрессия – еще одна причина нарушения потенции2. При этом проблемы с эрекцией возникают как на фоне самого депрессивного состояния, так и ввиду приема антидепрессантов.

Назначая антидепрессанты, врач всегда предупреждает о возможном симптоме – снижении либидо.

После лечения потенция полностью восстанавливается. Лечение у психотерапевта помогает преодолеть депрессию и восстановить потенцию. Помощью в борьбе со стрессом может стать любимое дело – работа или хобби. Физическая активность, прогулки на свежем воздухе также способствуют улучшению самочувствия.

2. Болезни сердца и сосудов

Атеросклероз – появление атеросклеротических бляшек в сосудах, которое связывают с возрастными изменениями в организме, курением, повышенным уровнем холестерина в крови.

Атеросклероз также может вызывать ухудшение кровотока в пенисе и стать поводом снижения потенции.

Причины импотенции у мужчин после 50 так или иначе связаны с атеросклерозом в 40 % случаев

2.

Профилактика атеросклероза поможет предотвратить проблемы с эрекцией в будущем3. Для этого необходимо придерживаться здорового образа жизни, отказаться от курения и сделать выбор в пользу сбалансированного питания, а также проходить периодические осмотры у врача.

3. Сахарный диабет

Нарушения потенции встречаются у диабетиков в 3 раза чаще, чем у людей, которые имеют нормальный уровень глюкозы в крови2.

Это связано с тем, что при сахарном диабете развиваются негативные изменения сосудов и ухудшается кровообращение. Сахарный диабет – возможная причина ранней импотенции.

Достаточная физическая активность и регулярное посещение врача помогут избежать эректильной дисфункции при данном заболевании или своевременно выявить ее.

При этом врач назначает лечение и диету: данные меры помогают поддерживать нормальный уровень сахара в крови.

4. Артериальная гипертония

Повышенное давление вызывает ухудшение кровообращения. Медленно, но неуклонно нарастают изменения в сосудах, которые вызывают нарушения потенции.

Таблетки от повышенного давления также могут ухудшить эрекцию. Однако эту проблему легко устранить: достаточно обратиться к врачу, который поможет подобрать препараты, не оказывающие отрицательного влияния на «мужскую силу».

5. Курение

Курение провоцирует развитие атеросклероза сосудов3.

Это может приводить к нарушению кровообращения и ухудшению эрекции.

Вредная привычка может стоить уверенности в себе, поэтому лучше отказаться от нее как можно скорее!

6. Малоподвижный образ жизни

Умеренные физические нагрузки могут способствовать улучшению общего самочувствия:

  • настраивать на позитивный лад,
  • поддерживать хорошее настроение,
  • стимулировать работу сердечно-сосудистой системы4.

Все это, пожалуй, оказывает весьма позитивное влияние и на потенцию. Поэтому так важно избегать гиподинамии для профилактики мужской импотенции.

7. Возраст

Чем старше мужчина, тем более вероятно появление проблем с потенцией1,2.

Это связано со снижением уровня мужского гормона тестостерона, развитием атеросклероза сосудов, уменьшением эластичности сосудистой стенки и другими факторами. Однако средний или даже преклонный возраст – это не повод для прекращения сексуальной активности.

Люди, которые сумели сберечь свое здоровье, имеют все шансы не испытывать проблем с потенцией даже в 80 лет2!

Комплексный подход к хорошему самочувствию – это следование правилам здорового образа жизни:

  • регулярные посильные физические нагрузки,
  • здоровое питание,
  • отсутствие серьезных стрессов,
  • позитивный настрой.

Все это может способствовать сохранению хорошей потенции.

Что еще можно сделать для улучшения потенции?

Препараты ингибиторов ФДЭ — также могут стать эффективным способом решения проблем с потенцией5.

Оптимального результата в ряде случаев возможно достигнуть при приеме рекомендованной врачом дозы не менее чем за 30 — 60 минут до полового акта. Препарат действует при условии сексуальной стимуляции. Он помогает восстановить мужскую силу и вернуть веру в себя.

При возникновении проблем в любом случае необходимо обратиться к врачу!

Список литературы

  1. Гориловский Л.М., Лахно Д.А. Эректильная дисфункция // РМЖ. 2005. №10. С. 653
    Оригинальная статья опубликована на сайте РМЖ (Русский медицинский журнал):
    http://www.rmj.ru/articles/obshchie-stati/Erektilynaya_disfunkciya/#ixzz4bwv2c6qX
  2. А.Л. Верткин, Д.Ю. Пушкарь, А.В. Тополянский, А.С. Сегал, «Эректильная дисфункция», медицинский научно-практический журнал «Лечащий врач», #07/03.
    https://www.lvrach.ru/2003/07/4530520/
  3. Официальный сайт ВОЗ. «Профилактика сердечно-сосудистых заболеваний.» Женева, 2007 г.
    http://www.who.int/publications/list/PocketGL_Russian.pdf?ua=1
  4. Официальный сайт ВОЗ. «10 фактов о физической активности».
    http://www.who.int/features/factfiles/physical_activity/facts/ru/index1.html
  5. А.Г. Мартов, Д.В. Ергаков, «Силденафил в современной урологической практике»// ЭФФЕКТИВНАЯ ФАРМАКОТЕРАПИЯ. Урология и нефрология. №2 (15)/2014
    http://umedp.ru/articles/sildenafil_v_sovremennoy_urologicheskoy_praktike.html


Создано экспертами по заказу ООО «КРКА ФАРМА»

Вибромагнитолазерный массаж предстательной железы для повышения потенции и лечения (профилактики) простатита

Подробности
Автор: ЛДЦ Нейрон
Опубликовано: 01 Ноябрь 2015

Сегодня очень востребованными, становятся аппараты для лечения простатита. Лечение, хронического простатита, нарушений эректильной функции, аденомы простаты, везикулита – это не полный список урологических болезней, с которыми аппаратные средства справляются очень успешно. 

 

Аппаратные средства для борьбы с простатитом можно разделить на отдельные группы, но сами принципы их действия различны:

  • Лазерное воздействие

    – это лечение с помощью излучения инфракрасным и красным спектром.

  • Вибрационное воздействие – стимуляция мышечных элементов простаты и мышц тазового дна к сокращению, восстановления их тонуса, устранение застойных явлений в простате и снятие симптомов раздражения нижних половых путей, благодаря улучшению эвакуации секрета, все это с помощью микровибраций механическим методом.

  • Магнитное воздействие – является противоотечным, трофикорегенеративным, болеутоляющим и противовоспалительным действием, которое оказывается на предстательную железу.

  • Электрическое воздействие – стимулирование тканей железы, которые модулируются токами через  ректальные или накожные электроды и электрофорез лекарственных препаратов;

  • Тепловое воздействие – благодаря этому воздействию, улучшается микроциркуляция крови в простате, а так же стимулируется иммунная система в окружающих тканях;

  • Виброакустическое воздействие –  осуществляется микровибрация тканей предстательной железы, потому что создается постоянно меняющаяся звуковая частота;

  • Ультразвуковое низкочастотное воздействие

    и фонофорез лекарственных препаратов

Существуют три основные методики, они оказывают воздействие, на ткани предстательной железы они являются самыми используемыми и  эффективными  на данное время. Почти все аппараты имеют принцип работы, основанный на сочетании этих воздействий: сила тока и его частота подбирается для пациента индивидуально, это будет зависеть от состояния болевого порога самого пациента, при стимулировании мышечных сокращений.

Электрический ток истребляет застой в железах и эпителии, активизирует физиологический дренаж простаты, увеличивает пассивную перистальтику лимфокапилляров.

Лазеротерапия

При лазеротерапии используется инфракрасное излучение пониженной эффективности, обладающие хорошей способностью проникать и достигать простаты через кожный покров промежности или сквозь стенки прямой кишки.

Благодаря воздействию лазера процесс регенерации в клетках происходит быстрее, так же, быстрее фаза отека сменяется фазой рубцевания в самом очаге воспаления, тканевой иммунитет усиливается и обеспечивается обезболивающий эффект. Помимо этого существенно уменьшаются дозы пролонгирования и усиления действия медикаментозных препаратов, используемых при лечении простаты вместе с аппаратной лазерной методикой.

Вибромагнитолазерный массаж при хроническом простатите

Известно, что массаж предстательной железы улучшает кровообращение и уменьшает венозный застой, способствует не только приливу артериальной крови в ткань железы, тем самым улучшая ее трофику, но и устранению застоя секрета и освобождению ацинусов, обусловливая дренирование окклюзированных протоков и облегчение доступа антибиотиков. Его успешно применяют для создания необходимого оттока патологических продуктов, содержащихся в секрете расширенных ацинусов при конгестивных формах хронического простатита.

Методика проведения вибромагнитолазерного массажа предстательной железы зависит от характера заболевания, его длительности, от состояния мышц брюшного пресса, тазового дна, функции сердечно-сосудистой системы, возраста, условий труда и быта.

В лечебно-диагностическом центре «Нейрон» вибромагнитолазерный массаж простаты выполнятся не только с целью лечения хронического простатита и профилактики его возникновения, но и с целью увеличения потенции и лечения бесплодия у мужчин.

Противопоказания при выполнении вибромагнитолазерного массажа при хроническом простатите

Противопоказаниями к выполнению этой лечебной процедуры являются острый простатит, обострение общих инфекций и гнойных заболеваний, повышение температуры тела и обострение хронического простатита и хронического уретрита, туберкулез половых органов, рак и камни предстательной железы, трещины заднего прохода, проктит, парапроктит, обострение геморроя, наличие острых инфекций.

В настоящее время в России с целью дренирования предстательной железы при хроническом простатите применяют метод пальцевого массажа. Однако в западных странах этот метод не используется. Установлено, что в 65% случаев воспалительный процесс имеет обструктивный характер, при котором пальцевой массаж, проводимый нередко в грубой форме, может привести к «раздавливанию» микроабсцессов и распространению инфекции. Аппаратный массаж имеет большие преимущества перед пальцевым, отличаясь не только атравматичностью, но и меньшей трудоемкостью для врача.

Применение вибромагнитолазерной методики на базе аппарата лазерной терапии «Матрикс-Уролог» в комплексном лечении больных хроническим бактериальным простатитом позволяет повысить эффективность лечения за счет сочетанного воздействия антибактериальных препаратов и бактериостатического и иммуномодулирующего действия применяемых физических факторов, восстановления и нормализации микроциркуляции в зоне предстательной железы, улучшения дренирующей функции протоков предстательной железы.

Видео Правильный массаж простаты

Звоните и мы ответим на все Ваши вопросы.

 

8(8634) 31-22-16

 Сохраним Ваше здоровье вместе!

Понижение потенции. Импотенция. Лечение | Клиника Здоровья

В нашей клинике используются самые современные, эффективные и прогрессивные методы лечения импотенции. 

Эректильная дисфункция представляет собой постоянную неспособность поддерживать эрекцию, достаточную для совершения полового акта, невозможность достижения эякуляции либо сочетание обоих этих нарушений. 

психологические проблемы.


Важнейший этап в лечении импотенции — определение её типа. Эректильная дисфункция может иметь органическую природу (80 %), психогенную (стресс, невроз, депрессия, неудовлетворенность сексуальной жизнью), смешанную.

Курс лечения патологии разрабатывается индивидуально. Органическая импотенция нуждается в устранении предпосылок развития, которые могут оказаться:

васкулогенными;
гормональными;
нейрогенными.

Лечение импотенции психогенного характера включает консультацию психолога.

Пациенты «Клиники Здоровья» проходят тщательное обследование и получают адекватное лечение импотенции. Помощь оказывают врачи высокой квалификации, в распоряжении которых — надежная лабораторная и техническая база. 

Правильное лечение подберет сексопатолог, уролог-андролог. 

Почему же наши урологи лучше других?

Знания и опыт врачей нашей клиники позволяют добиться поразительных успехов в повышении потенции. 

В Клинике Здоровья самое современное диагностическое оборудование, которое позволяет поставить точный диагноз и начать лечение.

Расположение в самом центре Москвы,  в шаговой доступности от двух станций метро.

Привлекательные цены

Удобное время для посещения врача.

Мы работаем для того, что бы вы были здоровы.


Запись на приём по телефонам: +7(495) 961-27-67 и +7(495) 951-39-09 

Топ продуктов, усиливающих потенцию у мужчин

Усталость, плохое настроение, пассивная женщина – в половом бессилии мужчины способны винить кого и что угодно, только не себя. А ведь причина сниженной потенции кроется в образе жизни сильной половины человечества, неправильном питании, не регулярных занятиях спортом. Кому-то для восстановления сил надо пройти серьезное лечение, некоторым достаточно слетать в теплые страны https://otdyh.onlinetours.ru/turkey, понежиться на горячем песке, поесть морепродукты и экзотические травы. Для улучшения фертильности и поддержания организма в тонусе надо включить в ежедневный рацион ряд продуктов.

Начать стоит с меда, он занимает первую строчку в списке. Добавлять ложку натурального подсластителя в чай, кашу стакан теплой воды с лимоном надо всем представителям сильной половины человечества независимо от возраста. Сила продукта заключается в содержании большого количества витаминов, минералов, микроэлементов. Если регулярно употреблять мед, повысится тонус сосудов, в том числе малого таза, усилится репродуктивная функция и продлиться эрекция.

Второе место в списке занимают орехи: грецкие, миндальные, фундук, кешью, фисташки. Орехи содержат полиненасыщенные жиры, которые улучшаю качество спермы, и не влияют на набор массы тела. Содержащийся в них аргинин и другие, биологически активные вещества улучшают циркуляцию крови естественным образом. Если сделать смесь из орехов и меда, можно получить отличный афродизиак.

Морепродукты способны увеличить сексуальное влечение у мужчин и женщин. Кальмары, устрицы, креветки, мидии содержат в большом количестве белки, углеводы, микроэлементы, витамины группы В, которые необходимы для поддержания метаболических процессов в организме. В частности устрицы усиливают выработку тестостерона, активируют сперматогенез, качество и количество спермы. Поедание морской рыбы увеличивает содержание полиненасыщенных жирных кислот в организме, служат профилактикой атеросклероза. Кислоты повышают эластичность сосудов и укрепляют их, усиливают микроциркуляцию крови в области малого таза, что приводит к стабильной эрекции. Чтобы вдоволь поесть блюда, приготовленные из жителей морских глубин, можно отправиться к морскому побережью https://www.onlinetours.ru/operators.

Содержащиеся в перепелиных яйцах аминокислоты, железо и фосфор улучшают работу половой системы. Регулярное употребление яичницы на завтрак усиливает кровообращение в половых органах и приводит к продолжительной эрекции и частым оргазмам. Употребление в пищу куриных яиц имеет схожие эффекты с «пестрыми собратьями». Особенно удачно сочетается яичница с луком.

Не зря мясо считается истинно мужским продуктом. Высокоэнергетическая пища, богатая микроэлементами, усиливает окислительные процессы в клетках, способствуя поддержанию возбудимости нервных окончаний. При выборе мяса стоит ориентироваться на говядину, баранину, конину, индейку, крольчатину, курицу. Блюда лучше не жарить, а тушить или парить, сохраняя все полезные вещества. Не стоит злоупотреблять и есть большое количество мясных блюд, эффект станет обратным: организму придется бросить все силы на переваривание тяжелого продукта.

Главный ингредиент в здоровом питании – зелень. Петрушка, шпинат, сельдерей, кинза, базилик наполнены витамина группы В, РР, макроэлементами, которые в комплексе повышают тонус организма, улучшают работу надпочечников, отвечающих за производство мужских половых гормонов. Благодаря содержанию аминокислот происходит синтез белков, что способствует укреплению мышц, а также стенок сердца и сосудов.

Если соблюдать здоровый образ жизни, отказаться от вредных организму продуктов и фастфудов, уделять должное внимание сну, тогда проблемы с потенцией можно отодвинуть на долгие годы.

Читайте также:

Профилактика эрекции у мужчин: лечение проблемы нарушения потенции и эректильной дисфункции

Стабильная эрекция для мужчин – это показатель мужественности и полноценности, можно даже сказать, что это гордость представителей сильного пола. Заботиться о своем сексуальном здоровье нужно всегда, и профилактика эрекции – одна из составляющих регулярной и качественной интимной жизни.

Бытует мнение, что профилактические мероприятия половой силы необходимы исключительно мужчинам старше 50-летнего возраста. Ведь именно в эти годы чаще всего диагностируется эректильная дисфункция.

Но мнение ошибочное, так как импотенция существенно помолодела в последние годы, и двадцатилетний парень может быть абсолютным импотентом. Кроме того, чтобы не задаваться вопросом восстановления мужской силы в зрелом возрасте, ее нужно беречь с молодых лет.

Следует рассмотреть, какие мероприятия в домашних условиях помогут поддерживать половые силы на самом высоком уровне? А также выяснить факторы, негативно влияющие на сексуальные возможности мужчин в постели.

Защита от ослабления эрекции: основные правила

О том, что мужское эрегированное состояние – это достаточно «тонкий инструмент», знает практически каждый из представителей сильного пола. Так как небольшой стресс либо конфликт, могут существенно сказаться на твердости пениса, что не позволит совершить полноценный половой акт.

К сожалению, редко какой мужчина начинает заботиться о своем сексуальном здоровье в молодые годы. Как правило, когда ничего не беспокоит, то об этом и не задумываются, полагая, что так будет все жизнь.

Однако в действительности картина предстает обратной стороной. Если говорить в целом, то образ жизни мужчины сказывается на эректильной функции. Однозначно, негативное влияние сразу не выявить, и этот процесс носит постепенный характер.

Среди наиболее распространенных причин полового бессилия выделяют следующие моменты:

  • Температурный режим окружающей среды. Переохлаждение способствует понижению сексуального влечения, может привести к нарушению эректильной функции.
  • Эмоциональный фон мужчин. Конфликт с партнершей может привести к самым непредсказуемым последствиям. Поэтому чем ровнее отношения, тем лучше секс.
  • Питание. Доказано, что чем мужчина разнообразнее питается, тем выше будет потенция, а эрекция качественнее.
  • Спорт. Сидячий образ жизни, отсутствие спорта – это факторы, которые влияют на мужские силы не самым лучшим образом.

Если исключить эти моменты из своей жизни, то можно с уверенностью утверждать, что вероятность снижения половой силы значительно уменьшается.

Как сохранить эрекцию?

Чтобы понимать, как сохранить эрекцию у мужчин, нужно знать основные моменты, которые приводят к ее нарушению и ослаблению. Доминирующий фактор – это уровень тестостерона, и чем его меньше, тем слабее мужчина в постели.

Эректильная дисфункция может стать следствием психологической неустойчивости, острого дефицита витаминов и минеральных веществ в организме, нарушения функциональности мочеполовой системы.

Кроме того, на качество эрегированного состояния влияет иммунный статус мужчины, полноценность кровообращения в организме, наличие либо отсутствие хронических заболеваний.

В связи с распространенностью такой проблемы как импотенция, проводятся многочисленные обширные исследования, направленные на нивелирование негативного влияния на мужские половые силы. К ним можно отнести растительные и медикаментозные препараты, специальную гимнастику, оздоровительную диету.

На пути к стабильной эрекции, мужчине рекомендуется предпринять некоторые шаги:

  1. Отказаться от курения, снизить потребление алкоголя. Доказано, что эти факторы угнетают систему кровообращения, негативно влияют на ЦНС, способствуют гормональным сбоям в организме.
  2. Исключить стрессовые ситуации. Однозначно, пункт достаточно двоякий, и все зависит от конкретного мужчины и определенных случаев. Однако нужно постараться реагировать на жизненные неурядицы спокойнее, что положительно скажется не только на упругости пениса, но и на общем состоянии организма.
  3. Питаться рекомендуется так, чтобы организм не испытывал дефицита каких-либо витаминов, минералов, жиров и прочих веществ.
  4. Движение – это залог хорошего стояка. Умеренные физические нагрузки нормализуют кровообращение, ускорят процессы обмена, не дадут набраться лишним килограммам, ускорят усвоение питательных веществ.
  5. Своевременное лечение хронических заболеваний, регулярное посещение уролога и других врачей.

Еще одной мерой профилактики качественной эрекции выступает регулярный секс. Если у мужчины нет регулярной интимной жизни, то вовсе не удивительно, что у него будут наблюдаться эректильные нарушения.

Регулярный секс – это профилактика заболеваний простаты, улучшение состояния сердечно-сосудистой системы, благоприятное влияние на эмоциональный фон представителей сильного пола.

Здоровая пища – хорошая эрекция

Врачи утверждают, что эрекция у мужчин предстает отражением того, какими продуктами они питаются. Чтобы организм работал нормально без сбоев, ему необходимо определенное количество витаминов, минералов и других веществ.

При дефиците полезных компонентов могут развиться различные заболевания, которые приведут к сексуальным расстройствам. Либо, организм будет рассчитывать свои ресурсы, и не исключается, что сил на эрегированное состояние, у него не хватит.

Сбалансированное питание сохранит эрекцию в 60 лет, и даже в пожилом возраста. Продукты как способ профилактики половой силы, используются не один десяток лет, и в эффективности многих из них, нет сомнений.

Положительно на мужское здоровье влияют следующие продукты:

  • Семена тыквы, миндаль, грецкие орехи, мед.
  • Баранина, говядина, красная рыба.
  • Перепелиные яйца.
  • Сельдерей, морковь, петрушка.

В перечисленных продуктах питания содержится достаточное количество фосфора, который необходим для полноценной работы мочеполовой системы.

Помимо этого, нужно обогатить свое меню овсянкой (например, взять за правило кушать овсяную кашу на завтрак каждый день), пшеничными хлопьями, горошком, цветной капустной. В этой пище много цинка, который способствует большей выработки тестостерона.

Витамин Е предотвращает ослабление эректильной функции, нормализует кровообращение. Он содержится в арахисовом масле, бананах и бобовых культурах.

Препараты для мужчин

Существует большой список натуральных средств, которые помогают мужчинам восполнить дефицит витаминов и минералов в организме, укрепляют иммунную систему, стабилизируют половые силы, и в целом положительно влияю на организм.

Следует сразу отметить, что не рекомендуется принимать препараты для эрекции как Виагра, Сиалис, Левитра и другие медикаменты, так как эти лекарства направлены уже на лечение дисфункции, а никак не на профилактику.

В качестве профилактики мужской силы, нужно отдавать предпочтение минеральным и витаминным комплексам, биологически активным добавкам. То есть препаратам, которые имеют растительный состав, и не нанесут вреда здоровью.

Проверенные препараты для усиления половой силы мужчин:

  1. Йохимбин – растительное средство, помогающее повысить половое влечение, предотвращает проблемы с эрекцией.
  2. Золотой конек способствует общему оздоровлению, увеличивает сексуальную активность.
  3. Красный корень обеспечивает качественный стояк, можно применять в качестве профилактики простатита и аденомы предстательной железы.
  4. Оргазекс повышает сексуальное желание, потенцию, усиливает ощущения во время полового акта.
  5. Стимин – природный афродизиак, стимулятор эрекции и потенции, обогащен витаминами и минералами – фосфор, цинк, калий, магний и др.

Принимать препараты нужно по инструкции, у каждого она своя. Как правило, курсовой прием ограничивается одним месяцем раз в полгода. Цена на средства не высокая, и каждый из мужчин сможет приобрести для себя идеальный вариант.

Спрей М-16 по праву уникальное средство, помогающее мужчинам оставаться на высоте в постели. Оно поддерживает половые силы на высоком уровне, повышает уровень тестостерона, предотвращает мужские заболевания и сексуальные расстройства.

Эректильная дисфункция и импотенция — лечение и профилактика в Выборгском районе Санкт-Петербурга

Содержание:

Проблемы с эрекцией

Почему наш метод лечения импотенции работает?

Каковы основные причины возникновения эректильной дисфункции?

При каких симптомах нужно обратиться к врачу?

Мужчины никогда не рассказывают о своих проблемах. Потому что любому мужчине тяжело признать за собой слабость или страх боли, особенно когда это касается интимной сферы. Он может мучиться годами — но не пойдёт к врачу, боясь боли от анализов или неприятного лечения.

Мы в клинике «Поэма Здоровья» в Выборгском районе развеиваем мифы о болезненном лечении эректильной дисфункции или невозможности восстановления потенции. Наша уникальная методика уже помогла и помогает выздороветь десяткам пациентов с проблемами, о которых так просто не расскажешь.

Почему наш метод лечения импотенции работает?

Да, мы не дадим вам чудо-таблетку, от которой вы почувствуете себя на 20 лет моложе. Проверено годами практики: восстановление потенции возможно, только если действовать комплексно. Когда все процедуры делаются не хаотично, а системно, вы постепенно получаете всё более ощутимый положительный результат.

Основные причины возникновения эректильной дисфункции

  • Заболевания сердечно-сосудистой системы
  • Заболевания нервной системы
  • Травмы полового члена.
  • Психологические трудности. Очень часто первопричиной для ухудшения потенции становятся стрессы и различные страхи, которые усугубляют положение. В таком случае необходима профессиональная и деликатная психологическая поддержка.
  • Частые заболевания мочеполовой системы и недоброкачественное их лечение
  • Сидячий образ жизни, малая активность, отказ от профилактического массажа простаты
  • Употребление ряда медикаментов также могут пагубно сказываться на мужской силе. Некоторые препараты, содержащие гормоны или вещества, влияющие на кору головного мозга, могут снижать потенцию. О возможных способах решения проблемы нужно обязательно посоветоваться с вашим лечащим врачом.
  • Систематическое употребление алкоголя и наркотиков
  • Психосоматические расстройства

Чаще всего проблемы с потенцией вызваны сразу несколькими из перечисленных факторов. Именно поэтому важно диагностировать их в точности на начальном этапе лечения. Так оно принесёт свои плоды гораздо быстрее.

Примерно в половине случаев причиной проблемы становятся именно психологические расстройства. Мало кто об этом знает, но со статистикой не поспоришь.

Мифы по поводу возникновения эрекции

Очень много мужчин думают, что эректильная дисфункция приходит с возрастом. Это не так. Дело в том, что у этого заболевания нет возрастных ограничений, ему подвержены абсолютно все мужчины.

Сексуальное желание и нормальная эрекция не взаимосвязаны. Это не так. Правда такова, что без должного позыва страсти, добиться нормального уровня возбуждения может быть проблематично. В некоторых случаях причина нарушения может быть связана не с проблемами организма мужчины, а просто с его холодностью к женщине. Не стоит бить тревогу.

Медикаменты для стимуляции эрекции помогут в любом случае. Это тоже не совсем правда. Медикаменты действительно могут помочь, однако есть ряд случаев, когда их действие будет либо снижено, либо вовсе не дать нужного эффекта.

При каких симптомах нужно обратиться к врачу?

Не затягивайте лечение импотенции, если у вас появились:

  • резкие боли в паху, внизу живота, в пояснице
  • ухудшение потенции
  • боли при мочеиспускании, изменение цвета или количества мочи
  • выделения из уретры

Конечно, лучшее средство от возможных болезней — это профилактические осмотры специалиста-уролога раз в год. Врач заметит первые признаки надвигающихся проблем и поможет их устранить.

Наши врачи

Уролог, врач ультразвуковой диагностики

Цены на услуги

  • Цены на консультацию врача
  • Процедуры
Прием (осмотр, консультация) врача-уролога первичный 2000
Прием (осмотр, консультация) врача-уролога повторный 1600
Краткая консультация уролога 1000
Прием (осмотр, консультация) врача-уролога-андролога первичный 2000
Прием (осмотр, консультация) врача-уролога-андролога повторный 1600
Комплексное обследование мужчин на ЗППП 1700
Лазер 1320
Массаж простаты 1000
Паховая блокада 1500
Расширенное комплексное обследование мужчин на ЗППП 2200
Спермограмма 1960
ТРУЗИ простаты 1500

Обратите внимание! Цены указаны для взрослых пациентов. Стоимость детских приёмов смотрите, пожалуйста, в разделе «Педиатрия».

Урология — манипуляции.  
Взятие секрета предстательной железы (1 проц) 610,00
Вправление парафимоза 5500,00
Вскрытие кист мошонки 22000,00
Забор материала для анализа (МАЗОК) 550,00
Забор материала для анализа (ПОСЕВ или соскоб из уретры) 720,00
Круговое иссечение крайней плоти (обрезание) при фимозе 22000,00
Круговое иссечение крайней плоти (обрезание), не осложненное 16500,00
Лазеротерапия ( внутриполосная) 660,00
Лазеротерапия (наружная) за 2 зоны 880,00
Массаж предстательной железы (1 проц) 730,00
Местная анестезия при урологических манипуляциях 550,00
Оперативное лечение варикоцеле 22000,00
Оперативное лечение гидроцеле 22000,00
Открытие головки (ликвидация сращений) 1650,00
Пластика уздечки полового члена 11000,00
Постановка уретрального катетера Фоллея (1 процедура без учета катетера) 880,00
Пункция водянки оболочек яичка — гидроцеле (варикоцеле)(с одной стороны) 3410,00
Радиохирургическое удаление кондилом полового члена 1 категории сложности 4950,00
Радиохирургическое удаление кондилом полового члена 2 категории сложности 7700,00
Удаление доброкачественных образований наружных половых органов 4620,00
Удаление инородных тел полового члена 5500,00
Удаление мочевого катетера* 550,00
Удаление остроконечных кондилом полового члена (единичных) 2860,00
Удаление остроконечных кондилом полового члена (множественных) 3630,00
Урологическая инстилляция в уретру (без стоимости препаратов) 880,00
Урологическая инстилляция в уретру (со стоимостью препаратов) 1650,00
Эвакуация мочи /забор мочи на анализ катетером (1 проц без стоимости катетера) 1100,00

 

 

✔ профилактика потенции у мужчин препараты

Тэги: как быстро улучшить потенцию без лекарств, где купить профилактика потенции у мужчин препараты, улучшить потенцию в домашних условиях народными средствами.


выбрать средство для потенции, лекарство для улучшения потенции у мужчин купить, какие таблетки поднимают потенцию у мужчин, как повысить потенцию без лекарств, средства повышающие потенцию у мужчин

Описание

Простатит – это тяжёлое прогрессирующее заболевание, возникающее из-за воспаления предстательной железы и патологического разрастания её ткани. Оно сопровождается высокой температурой тела, учащённым мочеиспусканием (особенно в ночное время), жжением в паховой области и животе, болями, отдающими в таз, поясницу, бёдра, расстройством эрекции, преждевременной эякуляцией, ухудшением общего самочувствия и повышенной утомляемостью. Большинство полагает, что простатит может проявиться только в пожилом возрасте, но как утверждают медики, он всё чаще диагностируется у молодых людей, не достигших даже 30-летнего возраста. Такая неутешительная статистика связана с широким рядом провоцирующих факторов. В первую очередь в группу риска попадают лица, страдающие гормональными нарушениями и имеющие слабый иммунитет, и те, кто игнорирует правильный образ жизни, поддерживает беспорядочные половые связи или, наоборот, слишком долго воздерживается от секса. Также недуг нередко развивается вследствие нервного переутомления, дефицита отдыха, переохлаждения. Естественно если есть подозрения на простатит или любое другое заболевание мочеполовой системы, то его стоит купить! Хороший препарат. Урелайн!!! Отличное средство, быстро пришло, и все помогло!


Официальный сайт профилактика потенции у мужчин препараты

Состав

28 достойных препаратов для повышения потенции мужчин, не. Обычно это натуральные препараты для повышения потенции у мужчин растительного. В целях профилактики принимать месяц каждый день. Преимущества в том, что он изготовлен на натуральной основе, нормализует сон. Не имеет никаких. Профилактика мужской потенции включает несколько предостережений, чтобы. У мужчин до 60. По статистике каждый третий после 35 страдает от снижения. Фармацевтические препараты. Мужские витамины рекомендуется принимать 1 раз в полгода. Если уже появились симптомы снижения эрекции, то лучше. Для поддержания потенции у мужчин необходимо постоянно проводить профилактику. Важно знать какие препараты, таблетки лучше использовать для этого. Профилактика – эффективный способ для сохранения потенции. В переводе с латинского языка потенция имеет значение сила. Поэтому. Профилактика потенции у мужчин препараты. Темп жизни, серьезные умственные и физические перегрузки привели к тому, что эректильная дисфункция помолодела, мужчины сталкиваются с ней уже в 40 лет и раньше. Профилактика импотенции. В большинстве случаев для профилактики потенции у мужчин, следует пользоваться таблетками и выполнять. Принимать препараты, оказывающие профилактику потенции, следует только после консультации врача. Неоспорим факт того, что принимать таблетки просто и эффективно. Профилактика потенции у мужчин имеет огромное значение в современном мире. Стрессы, физические и психические перегрузки, экология, вредные привычки оказывают повреждающее влияние на состояние эректильной функции. Медикаментозные препараты для профилактики потенции. Многие считают, что проблемы с потенцией возникают только на фоне возрастных изменений. Эффективные меры профилактики снижения половой активности у мужчин. Нарушения потенции негативно сказываются не только. Профилактика потенции у мужчин — задача особой важности. Половое бессилие помолодело. Раньше проблемы при сексуальном контакте испытывали мужчины старше 60 лет. Сегодня 30-летние оказываются несостоятельными. Профилактика импотенции у мужчин, препараты и лекарства, народные средства и питание, упражнения и советы для предотвращения эректильной дисфункции. Профилактика импотенции – как мужчине предотвратить бессилие? 6472 0. Темп жизни, серьезные умственные и физические.

Эффект от применения

Отзывы реальных покупателей о Урелайн практически в большинстве своем говорят о том, что мы имеем дело с обычным концентратом. Его натуральный состав, если это действительно так, может витаминизировать организм, но не вылечить болезнь. Но опять же, его химический состав никто не анализировал. Возможно, что там и нет тех компонентов, которые перечислены в аннотации. Ведь Урелайн не продается в аптеках, а распространяется только через интернет. Очень велика вероятность того, что и витаминов там нет никаких. Оригинальное средство Урелайн производится только в форме порошка. В упаковке должны находиться саше (20 штук) – пакетики с порционной дозой. Количество препарата в каждом конверте – 5 грамм. Порошок Урелайна должен быть только белого цвета, мелкозернистый, с характерным травянистым запахом (нерезким, достаточно приятным). После растворения в воде получается полупрозрачная белесая жидкость, может выпадать небольшое количество осадка. Хранить препарат после покупки надо при комнатной температуре. Ставить в холодильник средство не требуется. После приготовления раствор Урелайн надо выпить в течение суток. На следующий день раствор использовать нельзя.

Мнение специалиста

В прошлом году на базе известного научно-исследовательского института им. Г. Н. Лучникова проводилось масштабное тестирование с привлечением 750 респондентов, и оно показало, что препарат работает эффективно в 100% случаев. Абсолютно все участники испытания остались удовлетворены полученными результатами и отмечали значительное улучшение своего физического состояния.

Эксклюзивные тибетские рецепты восстановления мужской потенции. Лучшие народные средства и снадобья, используемые. Настоять еще 3 дня. Приступить к восстановлению мужской эрекции. Употреблять такое средство нужно по несколько капель эликсира, разведенного в четверти стакана прохладного. Тибетские средства укрепляют организм в целом и не вызывают побочных эффектов. Содержание статьи [скрыть]. Преимущества применения тибетских средств для мужской потенции. Тибетская медицина предлагает множество лекарственных средств для борьбы с эректильной дисфункцией. Препарат предназначен для восстановления здоровой потенции, а также для профилактики эректильной дисфункции. Новое канадское средство для потенции Vimax имеет уникальный натуральный состав и подходит для всех возрастных категорий. Препарат разработан на основе черных муравьев для увеличения пениса и эффективной потенции на все 100%. Описание препарата. Китайские средства для повышения потенции у мужчин, совершенно безопасны, у них. Тибетский герой. БАД укрепляет мужскую силу и восстанавливает работу почек. Кроме сниженных эрекции и потенции, средство рекомендовано при: малых размерах полового члена; низком качестве спермы. Популярные средства. Перечислить весь спектр лекарств для улучшения потенции едва ли возможно. Тибетская медицина предлагает еще один препарат, который применяется многими представителями сильной половины человечества. Расстройства мочеполовой системы, заболевания предстательной железы. Секрет Тибета пилюли для потенции — известный в китайской медицине препарат, предназначенный для улучшения потенции. Состав: член тибетского козла, пятнистого жеребца, бычий член и член пятнистого оленя, морские коньки и такие растительные компоненты, как шафран, актинолит и другие. Тибетское средство для потенции. ВАЖНО ЗНАТЬ! Д. Пушкарь рассказал, как победить простатит в домашних условиях. 2.4 Правила приема препарата. 2.5 Как приобрести биологически активную добавку. Травы для повышения потенции у мужчин — более 10 рецептов! Эффективны ли травы для повышения. Состав препарата для потенции Тибетский кордицепс. Препарат имеет полностью натуральный состав и изготавливается из натурального сырья растительного и животного происхождения.

Способ применения

Отзывы реальных покупателей о Урелайн практически в большинстве своем говорят о том, что мы имеем дело с обычным концентратом. Его натуральный состав, если это действительно так, может витаминизировать организм, но не вылечить болезнь. Но опять же, его химический состав никто не анализировал. Возможно, что там и нет тех компонентов, которые перечислены в аннотации. Ведь Урелайн не продается в аптеках, а распространяется только через интернет. Очень велика вероятность того, что и витаминов там нет никаких.

Как заказать?

Заполните форму для консультации и заказа профилактика потенции у мужчин препараты. Оператор уточнит у вас все детали и мы отправим ваш заказ. Через 1-10 дней вы получите посылку и оплатите её при получении.

профилактика потенции у мужчин препараты. народные средства повышения потенции у пожилых мужчин. Отзывы, инструкция по применению, состав и свойства.

Аналог Сиалиса, но более дешевый и не менее действенный. Стандартная доза – 1 таблетка в сутки при сохранении. С алкоголем совместимы, как и с жирной пищей. Продукт основан на базе сразу двух медикаментов – Виагры и Левитры. Аванафил можно рекомендовать в следующих случаях: нерешительность. Виагра Софт. Препарат является аналогом Виагры, который необходимо рассасывать под языком. Кроме совмещения с алкоголем этот аналог Сиалиса можно употреблять одновременно с жирной пищей, но грейпфрутовым соком препарат запивать нельзя. к содержанию ↑. Левитра. Сочетание Виагры и алкоголя. С алкоголем все более-менее понятно. Это самый популярный тип напитков в нашей стране. Проще говоря, исследования показали, что Виагра и алкоголь совместимость отзывы такие же, как и без спиртного. Но только при потреблении небольшого количества. Если пациент. Алкоголь и дженерики — это возможно Все мы понимаем, что алкоголь в больших количествах вредит здоровью. Многочисленные исследования показали, что улучшение эрекции после выпитого алкоголя и таблетки Виагры может не наступить. И чем больше принятая доза спиртного напитка, тем меньше. Виагра и ее аналоги. Важно учесть, что сочетание спиртного с Виагрой возможно только в тех случаях, если вы купили препарат в проверенном месте. К сожалению, сегодня на рынок поставляется много подделок, которые даже без порции алкоголя могут сильно навредить вашему организму. В нашем. Виагра Софт – индийский дженерик небезызвестной Виагры. Виагра Софт имеет схожий состав, но другую форму выпуска. Совместимые с алкоголем. Алкоголь прямо на препараты, усиливающие эрекцию, не действует, но способен влиять на их всасывание из кишечника. Все зависит от дозы. Бывают ситуации, когда нам нужно и спиртного выпить, и в постели не ударить в грязь лицом. В этом случае помогут таблетки, совместимые. Таблетки для потенции, совместимые с алкоголем. Можно ли совмещать Виагру со спиртным? Сочетание Сиалиса со спиртным. Варденафил и алкоголь. Какие есть. Аналоги Виагры и алкоголь. Совместимость. Практически все дженерики (дженерик — копия оригинальной формулы лекарства, выпускаемая разными фармацевтическими компаниями после окончания срока патента на оригинальную формулу) не рекомендуется употреблять с алкоголем. Причин сразу. Аналоги Виагры, совместимые с алкоголем. В современной жизни употребление алкоголя часто сопровождается интимной близостью. Поэтому фармакологическая промышленность не стоит на месте и постоянно разрабатывает новое поколение препаратов для улучшения потенции, которые разрешено принимать. Совместимость с алкоголем имеют аналоги виагры, такие как сиалис и левитра. Это проверенные заменители и аналоги, которые не боятся смешивания со спиртом. Работа доказана и с любвым видом алкоголя, будь то ром,текила,абсент и прочие. Эффективность сиалиса и левитры с алкоголем 100%. Этот момент.


Официальный сайт профилактика потенции у мужчин препараты

✅ Купить-профилактика потенции у мужчин препараты можно в таких странах как:


Россия, Беларусь, Казахстан, Киргизия, Молдова, Узбекистан, Украина Армения


Простатит – это тяжёлое прогрессирующее заболевание, возникающее из-за воспаления предстательной железы и патологического разрастания её ткани. Оно сопровождается высокой температурой тела, учащённым мочеиспусканием (особенно в ночное время), жжением в паховой области и животе, болями, отдающими в таз, поясницу, бёдра, расстройством эрекции, преждевременной эякуляцией, ухудшением общего самочувствия и повышенной утомляемостью. Большинство полагает, что простатит может проявиться только в пожилом возрасте, но как утверждают медики, он всё чаще диагностируется у молодых людей, не достигших даже 30-летнего возраста. Такая неутешительная статистика связана с широким рядом провоцирующих факторов. В первую очередь в группу риска попадают лица, страдающие гормональными нарушениями и имеющие слабый иммунитет, и те, кто игнорирует правильный образ жизни, поддерживает беспорядочные половые связи или, наоборот, слишком долго воздерживается от секса. Также недуг нередко развивается вследствие нервного переутомления, дефицита отдыха, переохлаждения.

В силу отсутствия химических компонентов в составе препарат обеспечивает минимум негативных эффектов при применении. Появление побочных действий обусловлено индивидуальными характеристиками организма, если человек предрасположен к определенным реакциям, препарат может спровоцировать их развитие. Среди побочных эффектов можно отметить развитие аллергической реакции, развивающееся по причине гиперчувствительности организма к растительным компонентам.

Заказала Урелайн своему мужу, для профилактики, улучшения нашей сексуальной жизни. В интернете были цепляющие отзывы и его цена показалась нормальной. В отзывах, кроме всего прочего, гарантировались новые ощущения во время секса, повышение чувствительности. Но это все вранье. Никаких таких ощущений у нас не было.

Нагруженный антибиотиком β-трикальцийфосфат/сульфат кальция для антимикробной активности, предотвращения и эффективности уничтожения биопленок Pseudomonas aeruginosa и Staphylococcus aureus

  • Zimmerli, W. Клиническая картина и лечение инфекций, связанных с ортопедическими имплантатами. Дж. Междунар. Мед. 276 , 111–119. https://doi.org/10.1111/joim.12233 (2014 г.).

    КАС Статья пабмед Google ученый

  • Кунуцор С.К. и др. Исходы повторного заражения после одно- и двухэтапной хирургической ревизии инфицированного коленного протеза: систематический обзор и метаанализ. PLoS ONE 11 , e0151537. https://doi.org/10.1371/journal. pone.0151537 (2016 г.).

    КАС Статья пабмед ПабМед Центральный Google ученый

  • Panteli, M. & Giannoudis, P.V. Хронический остеомиелит: что должен знать хирург. EFORT Open Rev. 1 , 128–135. https://doi.org/10.1302/2058-5241.1.000017 (2016 г.).

    Артикул пабмед ПабМед Центральный Google ученый

  • Ибрагим М.С. и др. Инфекция в эндопротезировании: фундаментальная наука о бактериальных биопленках в их патогенезе, диагностике, лечении и профилактике. Инстр. Лекция курса. 69 , 229–242 (2020).

    ПабМед Google ученый

  • Фостер, А. Л. и др. Инфекция, связанная с переломом: современные методы профилактики и лечения. Expert Rev. Противоинфекционное средство. тер. 66 , 1–15. https://doi.org/10.1080/14787210.2020.1729740 (2020 г.).

    КАС Статья Google ученый

  • млн лет, Д. и др. Жизнеспособные бактерии сохраняются на антибиотических спейсерах после двухэтапной ревизии по поводу перипротезной инфекции сустава. J. Ортопед. Рез. 36 , 452–458. https://doi.org/10.1002/jor.23611 (2018 г.).

    КАС Статья Google ученый

  • Моргенштерн, М. и др. Образование биопленки увеличивает неэффективность лечения Staphylococcus epidermidis связанного с устройством остеомиелита нижней конечности у пациентов-людей. J. Ортопед. Рез. Опубл. Ортопедический. Рез. соц. 34 , 1905–1913 гг. https://doi.org/10.1002/jor.23218 (2016 г.).

    КАС Статья Google ученый

  • Кнехт, К. С. и др. Насыщенный антибиотиками шариковый и импульсный лаваж сульфата кальция уничтожает биопленки на металлических материалах имплантатов in vitro. J. Ортопед. Рез. 36 , 2349–2354. https://doi.org/10.1002/jor.23903 (2018 г.).

    КАС Статья Google ученый

  • Geurts, J.A.P. & Walenkamp, ​​GHIM в Лечение перипротезных инфекций суставов (PJIs) (под редакцией JJ Chris Arts & Jan Geurts) 219–230 (Woodhead Publishing, 2017).

  • Инзана, Дж. А., Шварц, Э. М., Кейтс, С. Л. и Авад, Х. А.Подходы биоматериалов к лечению имплант-ассоциированного остеомиелита. Биоматериалы 81 , 58–71. https://doi.org/10.1016/j.bimaterials.2015.12.012 (2016 г.).

    КАС Статья пабмед Google ученый

  • Абосала, А. и Али, М. Использование гранул сульфата кальция при перипротезных инфекциях суставов, систематический обзор. J. Инфекция костных суставов. 5 , 43–49. https://doi.org/10.7150/jbji.41743 (2020).

    Артикул Google ученый

  • Пинчер Б., Фентон К., Джеяпалан Р., Барлоу Г. и Шарма Х.К. Систематический обзор одноэтапного лечения хронического остеомиелита. J. Ортопед. Surg. Рез. 14 , 393. https://doi.org/10.1186/s13018-019-1388-2 (2019).

    Артикул Google ученый

  • Абдельазиз Х., von Forster, G., Kuhn, K.D., Gehrke, T. & Citak, M. Минимум 5 лет наблюдения после гентамицин- и клиндамицин-нагруженного цемента PMMA при тотальном эндопротезировании суставов. J. Med. микробиол. 68 , 475–479. https://doi.org/10.1099/jmm.0.000895 (2019 г.).

    КАС Статья пабмед Google ученый

  • Gandhi, R., Backstein, D. & Zywiel, M.G. Костный цемент с антибиотиками при первичном и ревизионном эндопротезировании тазобедренного и коленного суставов. Дж. Ам. акад. Ортопедический. Surg. 26 , 727–734. https://doi.org/10.5435/JAAOS-D-17-00305 (2018 г.).

    Артикул Google ученый

  • Джеймсон, С. С. и др. Нагруженный антибиотиками костный цемент связан с более низким риском ревизии после тотального эндопротезирования коленного сустава с цементом: анализ 731 214 случаев с использованием данных Национального объединенного реестра. Bone Joint J. 101 , 1331–1347.https://doi.org/10.1302/0301-620x.101b11.bjj-2019-0196.r1 (2019 г.).

    Артикул пабмед Google ученый

  • Санс-Руис, П., Матас-Диез, Дж. А., Санчес-Сомолинос, М., Вильянуэва-Мартинес, М. и Вакеро-Мартин, Дж. Является ли коммерческий костный цемент, содержащий антибиотики, полезным для профилактики и стоимости экономия после эндопротезирования коленного и тазобедренного суставов? Трансатлантический парадокс. J. Артропластика 32 , 1095–1099.https://doi.org/10.1016/j.arth.2016.11.012 (2017 г.).

    Артикул пабмед Google ученый

  • Ostermann, P.A., Seligson, D. & Henry, S.L. Местная антибактериальная терапия при тяжелых открытых переломах. Обзор 1085 последовательных случаев. J. Хирург суставов костей. Брит. 77 , 93–97 (1995).

    КАС Статья Google ученый

  • Китинг Дж.Ф., Блахут, П.А., О’Брайен, П.Дж., Мик, Р.Н. и Броекхейс, Х. Рассверливание гвоздей при открытых переломах большеберцовой кости: снижает ли пакетик с шариками антибиотика частоту глубоких инфекций?. Дж. Ортоп. Травма 10 , 298–303. https://doi.org/10.1097/00005131-199607000-00002 (1996).

    КАС Статья пабмед Google ученый

  • Зиран, Б. Х., Даровиш, М., Клатт, Б. А., Агудело, Дж. Ф. и Смит, В. Р. Интрамедуллярное закрепление гвоздей при открытых переломах большеберцовой кости: сравнение двух методов. Междунар. Ортоп. 28 , 235–238. https://doi.org/10.1007/s00264-004-0567-9 (2004 г.).

    Артикул пабмед ПабМед Центральный Google ученый

  • Моргенштерн, М. и др. Эффект местной профилактики антибиотиками при лечении открытых переломов конечностей: систематический обзор и метаанализ. Рез. сустава кости. 7 , 447–456. https://doi.org/10.1302/2046-3758.77.bjr-2018-0043.r1 (2018 г.).

    КАС Статья пабмед ПабМед Центральный Google ученый

  • Laycock, P. A. и др. Эффективность in vitro антибиотиков, высвобождаемых из гранул наполнителя костных пустот на основе сульфата кальция. Материалы https://doi.org/10.3390/ma11112265 (2018).

    Артикул пабмед ПабМед Центральный Google ученый

  • Howlin, R. P. et al. Синтетические гранулы сульфата кальция, содержащие антибиотики, для предотвращения бактериальной колонизации и образования биопленки при перипротезных инфекциях. Антимикроб. Агенты Чемотер. 59 , 111–120. https://doi.org/10.1128/AAC.03676-14 (2015 г.).

    КАС Статья пабмед Google ученый

  • Хаулин, Р. стр. и др. Профилактика биопленки грамотрицательных бактериальных патогенов, вовлеченных в перипротезную инфекцию, с помощью гранул сульфата кальция, нагруженных антибиотиками, in vitro. Биомед. Матер. 12 , 015002. https://doi.org/10.1088/1748-605X/12/1/015002 (2016).

    ОБЪЯВЛЕНИЕ Статья пабмед Google ученый

  • Howlin, R. P. et al. Предотвращение образования биопленки Propionibacterium acnes при инфекциях протезов in vitro. J. Плечевой локтевой хирург. 26 , 553–563. https://doi.org/10.1016/j.jse.2016.09.042 (2017 г.).

    Артикул пабмед Google ученый

  • Ян, Х.Л. и др. Реакция заживления кости на синтетический трансплантат из сульфата кальция/бета-трикальцийфосфата в модели дефекта тела позвонка овцы. Дж. Биомед. Матер. Рез. Б заявл. Биоматер. 100 , 1911–1921 гг. https://doi.org/10.1002/jbm.b.32758 (2012).

    ОБЪЯВЛЕНИЕ КАС Статья пабмед Google ученый

  • Лоури, К., Чатуверди, А., Бломфилд, М. и Шарма, Х. Эффективность лечения костного суставного коллапса с костными дефектами при переломах плато большеберцовой кости с использованием Genex: рассасывающаяся кальциевая композитная синтетическая кость прививка. Дж. Лимб. Расчет длины 4 , 20–25. https://doi.org/10.4103/jllr.jllr_9_17 (2018 г.).

    Артикул Google ученый

  • Wilson, S., Hamilton, MA, Hamilton, GC, Schumann, MR & Stoodley, P. Статистическая количественная оценка скорости открепления и распределения размеров скоплений клеток от дикого типа (PAO1) и мутантного клеточного сигнала (JP1) Pseudomonas aeruginosa биопленки. Заяв. Окружающая среда. микробиол. 70 , 5847–5852. https://doi.org/10.1128/AEM.70.10.5847-5852.2004 (2004 г.).

    КАС Статья пабмед ПабМед Центральный Google ученый

  • Плаут Р.Д., Мокка, С.П., Прабхакара, Р., Меркель, Т.Дж. и Стибиц, С. Стабильно люминесцентные клинические штаммы Staphylococcus aureus для использования в биолюминесцентной визуализации. PLoS ONE 8 , e59232. https://doi.org/10.1371/journal.pone.0059232 (2013 г.).

    ОБЪЯВЛЕНИЕ КАС Статья пабмед ПабМед Центральный Google ученый

  • Wiegand, I., Hilpert, K. & Hancock, R.E. Методы разбавления агара и бульона для определения минимальной ингибирующей концентрации (МИК) противомикробных веществ. Нац. протокол 3 , 163 (2008).

    КАС Статья Google ученый

  • McPherson, E., Dipane, M. & Sherif, S. Растворимые шарики с антибиотиками в лечении перипротезной инфекции суставов и ревизионном эндопротезировании — использование синтетического чистого сульфата кальция (стимулан), пропитанного ванкомицином и тобрамицином. Реконстр. Ред. 3 , 32–43. https://doi.org/10.15438/rr.v3i1.27 (2013).

    Артикул Google ученый

  • Херигстад, Б., Гамильтон, М. и Херсинк, Дж. Как оптимизировать метод капельной пластины для подсчета бактерий. J. Microbiol. Методы 44 , 121–129. https://doi.org/10.1016/s0167-7012(00)00241-4 (2001 г.).

    КАС Статья пабмед Google ученый

  • Metsemakers, W. J. et al. Основанные на фактических данных рекомендации по местным антимикробным стратегиям и управлению мертвым пространством при инфекциях, связанных с переломами. Дж. Ортоп. Травма 34 , 18–29. https://doi.org/10.1097/BOT.0000000000001615 (2020 г.).

    Артикул пабмед Google ученый

  • Цзян Н. и др. Клинические характеристики и лечение хронического остеомиелита конечностей в Южном Китае: ретроспективный анализ 394 последовательных пациентов. Медицина 94 , e1874. https://doi.org/10.1097/MD.0000000000001874 (2015 г.).

    Артикул пабмед ПабМед Центральный Google ученый

  • Wee, J. & Thevendran, G. Роль ортобиологических препаратов в хирургии стопы и голеностопного сустава: Аллогенные костные трансплантаты и заменители костных трансплантатов. EFORT открытые обзоры 2 , 272–280. https://doi.org/10.1302/2058-5241.2.160044 (2017 г.).

    Артикул пабмед ПабМед Центральный Google ученый

  • Вилтфанг, Дж. и др. Характеристики деградации альфа- и бета-трикальцийфосфата (TCP) у мини-свиней. Дж. Биомед. Матер. Рез. 63 , 115–121. https://doi.org/10.1002/jbm.10084 (2002 г.).

    КАС Статья пабмед Google ученый

  • Гао, П. и др. Гранулы бета-трикальцийфосфата улучшают остеогенез in vitro и создают инновационные остеорегенераторы для инженерии костной ткани in vivo. Науч. Респ. 6 , 23367. https://doi.org/10.1038/srep23367 (2016).

    ОБЪЯВЛЕНИЕ КАС Статья пабмед ПабМед Центральный Google ученый

  • Дренерт М., Дренерт А. и Дренерт К. Остеоинтеграция гидроксиапатита и ремоделирование-резорбция трикальцийфосфатной керамики. Микроск. Рез. Технол. 76 , 370–380. https://doi.org/10.1002/jemt.22176 (2013 г.).

    КАС Статья Google ученый

  • Огосе А. и др. Сравнение гидроксиапатита и бета-трикальцийфосфата в качестве костных заменителей после удаления опухолей костей. Дж. Биомед. Матер. Рез. Б заявл. Биоматер. 72 , 94–101. https://doi.org/10.1002/jbm.b.30136 (2005 г.).

    КАС Статья пабмед Google ученый

  • Смитс, Р. и др. Новый двухфазный остеоиндуктивный кальциевый композитный материал с отрицательным дзета-потенциалом для наращивания кости. Head Face Med. 5 , 13. https://doi.org/10.1186/1746-160X-5-13 (2009).

    КАС Статья пабмед ПабМед Центральный Google ученый

  • Poole, K. Устойчивость к аминогликозидам в Pseudomonas aeruginosa . Антимикроб. Агенты Чемотер. 49 , 479–487 (2005).

    КАС Статья Google ученый

  • Уайтсайд, Л.в Ортопедические труды. 83–83 (Британское редакционное общество хирургии костей и суставов).

  • Парвизи, Дж. в Orthopaedic Proceedings. 84–84 (Британское редакционное общество хирургии костей и суставов).

  • Омикрон снижает эффективность вакцины Pfizer, но данные показывают, что бустер может восстановить защиту

    Согласно предварительным данным лабораторных испытаний, опубликованным компаниями в среду, три дозы вакцины Pfizer и BioNTech против COVID-19 могут защитить от нового варианта омикрон так же хорошо, как две дозы против исходного штамма коронавируса.

    Образцы крови от лиц, получивших только две дозы прививки, показали значительное снижение вируснейтрализующих антител при тестировании на омикрон, что позволяет предположить, что люди, не получившие бустерную дозу, могут быть уязвимы к инфекции.

    «Новые данные … показывают нам, что первая линия защиты с двумя дозами вакцины может быть скомпрометирована, и для восстановления защиты требуются три дозы вакцины», — сказал Угур Сахин, генеральный директор BioNTech, на пресс-конференции в среду.

    Результаты, которые были обнародованы в пресс-релизе и не рецензировались экспертами, подчеркивают угрозу, которую представляет омикрон, и дают некоторую надежду на то, что вакцины все еще могут эффективно защищать от этого варианта. Важно отметить, что Pfizer и BioNTech, а также многие ученые ожидают, что вакцинация по-прежнему должна предотвращать тяжелые заболевания даже без бустерной дозы.

    Исследователи всего мира поспешили оценить способность омикрон обходить иммунную защиту, вызванную вакцинацией или перенесенной инфекцией.Данные от Pfizer и BioNTech — одни из первых, появившихся с момента идентификации омикрона учеными в Южной Африке примерно две недели назад. Большое количество мутаций, обнаруженных в омикронах, особенно в областях вируса, на которые нацелены вакцины против COVID-19, быстро вызвало тревогу, что он может представлять большую опасность, чем ныне доминирующий дельта-вариант.

    Хотя есть некоторые предварительные признаки того, что омикронные инфекции могут привести к более легким случаям, многое остается неясным в отношении этого варианта, включая то, как его генетические различия повлияют на защиту имеющихся вакцин.

    Неопубликованное исследование, опубликованное во вторник учеными Африканского научно-исследовательского института здравоохранения, дало первое представление. Их данные показали, что, хотя омикрон не полностью избегает вакцины Pfizer и BioNTech, уровни нейтрализующих антител после двух доз были в 40 раз ниже по сравнению с вариантом, чем с исходным штаммом коронавируса. Однако эта цифра является предварительной и может быть скорректирована по мере завершения дополнительных исследований.

    Результаты Pfizer и BioNTech показали меньшее, но все же значительное 25-кратное снижение уровня антител по сравнению с омикроном после двух доз.Однако третья доза повысила уровень антител на аналогичную величину, что примерно соответствует реакции, вызванной двумя дозами исходного штамма коронавируса. Однако неясно, как долго могут длиться дополнительные преимущества бустера и потребуется ли в конечном итоге еще один выстрел для поддержания защиты.

    Данные показывают, что омикрон «все еще не является полным вариантом побега», заявил в среду Сахин из BioNTech. «Это вариант частичного ускользания, и это означает, что вирус может быть нейтрализован высокими [уровнями] нейтрализующих антител.»

    Уровни антител, хотя и коррелируют со степенью защиты от вакцин, не являются единственными иммунными защитниками, которые реагируют на вирусные инфекции. Исследователи, а также компании Pfizer и BioNTech считают, что иммунные клетки, известные как Т-клетки, могут играть важную роль в защите от COVID-19, особенно от более тяжелых форм заболевания.

    По данным компаний, Т-клетки, разбуженные вакцинацией, нацелены на области от коронавируса, которые в значительной степени не затронуты многочисленными мутациями омикрон.

    Поскольку Т-клетки и другие части иммунной системы играют роль в защите, снижение уровня антител может не привести к снижению эффективности.Например, 25-кратное падение уровня антител не обязательно указывает на 25-кратное снижение общей эффективности вакцины.

    Pfizer и BioNTech провели этот первый раунд тестирования с использованием сконструированных «псевдовирусных» форм омикрона, которые могут не полностью воспроизвести реакцию антител на живой вирус. Компании проводят дополнительные лабораторные испытания.

    В то время как бустер может поддерживать защиту от омикрон, производители лекарств все еще продвигаются вперед в разработке бустера, специфичного для омикрон, как и другие производители вакцин, такие как Moderna.

    Работа над этим выстрелом началась 25 ноября, и компании ожидают, что они смогут подготовить его в течение 100 дней, в зависимости от объема испытаний, которые могут потребоваться регулирующим органам. Pfizer и BioNTech в настоящее время нацелены на доступность к марту, хотя Шахин заявил в среду, что до сих пор не ясно, понадобится ли бустер омикрон.

    «В ближайшие несколько недель появятся дополнительные данные, чтобы ответить на вопрос, нужна ли нам вакцина омикрон и когда, — сказал Шахин.

    Pfizer и BioNTech ожидают, что в следующем году они смогут произвести 4 миллиарда доз своей вакцины и могут перевести часть этих мощностей на бустер омикрон.По словам Шахина, вначале, однако, запасы индивидуального выстрела не будут широко доступны.

    Проверка марихуаны: определение потенции | Департамент общественного здравоохранения и окружающей среды

    Что касается анализа активности, хотя существует несколько опубликованных методов, доступные методы не были проверены на уровне стандартного метода. Ниже приведен список соответствующих эталонных методов. Методы потенции должны быть тщательно проверены, чтобы гарантировать, что они соответствуют требованиям тестирования.

     

    Методы определения активности:

    • Ассоциация аналитических сообществ (AOAC), 2018 г. «Каннабиноид в сухих цветах и ​​масле, 2018.10» http://www.eoma.aoac.org/ method/info.asp?ID=51811
    • Ассоциация аналитических сообществ (AOAC), 2018 г. «Количественный анализ каннабиноидов в высушенных растительных материалах, концентратах и ​​маслах каннабиса, 2018.11» http://www.eoma.aoac. org/methods/info.asp?ID=51760​
    • Бакер, Бенджамин Де., et al., 2009. Инновационная разработка и проверка метода ВЭЖХ/DAD для качественного и количественного определения основных каннабиноидов в растительном материале каннабиса. Journal of Chromatography B , 887 4115-4124.​
    • Gambaro, Veniero., et al., 2002. Определение основных активных компонентов в препаратах каннабиса с помощью газовой хроматографии высокого разрешения/детектирования пламенно-ионизационным методом и высокоэффективной жидкостной хроматографии/ультрафиолетового обнаружения. Analytica Chimica Acta 468, 245-254.
    • Л. Амбах, Ф. Пеничка, А. Бройе, С. Кениг, В. Вайнманн., 2014 г. Одновременная количественная оценка дельта-9-ТГК, ТГК-кислоты А, КБН и КБД в изъятых наркотиках с использованием ВЭЖХ-ДАД. Международная судебная медицина 243, 107-111.
    • Stolker, A.A.M., et al., 2004. Определение каннабиноидов в продуктах каннабиса с помощью жидкостной хроматографии с масс-спектрометрией с ионной ловушкой. Журнал хроматографии А , 1058, 143-151.
    • Swift, Wendy., et al., 2013. Анализ изъятий каннабиса в Новом Южном Уэльсе, Австралия: эффективность каннабиса и профиль каннабиноидов, PLOS One v.8 i.7 e70052.
    • Upton, Roy., et al., 2014. Соцветия каннабиса Cannabis Spp.: Стандарты идентификации, анализа и контроля качества. Американская травяная фармакопея.

    Чем они отличаются? > Новости > Йель Медицина

    Pfizer-BioNTech        

    Вакцина Pfizer-BioNTech (торговая марка: Comirnaty) получила полное одобрение FDA в августе 2021 года для людей в возрасте 16 лет и старше. До этого это была первая вакцина против COVID-19, получившая разрешение FDA на экстренное использование (EUA) еще в декабре 2020 года после того, как компания сообщила, что ее вакцина очень эффективна для предотвращения симптоматического заболевания.Это матричная РНК (мРНК) вакцина, в которой используется относительно новая технология. Она должна храниться при температуре морозильной камеры, что может затруднить ее распространение по сравнению с некоторыми другими вакцинами.

    Кто может его получить:  Все в возрасте 16 лет и старше в США. Дети и подростки в возрасте от 5 до 15 лет имеют право на участие в программе EUA.

    Дозировка: Для основной серии: две инъекции с интервалом 21 день. Полностью эффективен через две недели после второго выстрела.Для некоторых людей старше 12 лет, особенно для мальчиков и мужчин в возрасте от 12 до 39 лет, Центр по контролю и профилактике заболеваний (CDC) предлагает восьминедельный интервал между двумя прививками, чтобы снизить риск миокардита, редкого побочного эффекта (см. предупреждения FDA ниже).

    Кто может получить бустерную прививку: Любой, кому была сделана прививка Pfizer-BioNTech для их (двукратной) серии первичной вакцины, и в возрасте от 12 до 17 лет должен получить бустерную прививку Pfizer-BioNTech через пять месяцев, согласно данным CDC. рекомендации.Если вам 18 лет или больше, в большинстве случаев предпочтительнее бустер мРНК Pfizer-BioNTech или Moderna.

    Если у вас ослабленный иммунитет: Любой человек в возрасте 5 лет и старше с ослабленным иммунитетом средней или тяжелой степени должен получить дополнительную первичную прививку (или третью дозу) через 28 дней после второй прививки. Через пять месяцев они получат право на повторную прививку. Подростки в возрасте 12-17 лет должны получать только бустер Pfizer-BioNTech; любой человек в возрасте 18 лет и старше в большинстве случаев может выбрать бустер Pfizer-BioNTech или Moderna.

    Возможные побочные эффекты: Боль, покраснение или припухлость в месте укола и/или усталость, головная боль, мышечная боль, озноб, лихорадка или тошнота в остальных частях тела. Если эти побочные эффекты возникают, они должны пройти через несколько дней. Несколько побочных эффектов являются серьезными, но редкими. К ним относятся анафилаксия, тяжелая реакция, которую можно лечить адреналином (препарат в Epipens ® ).

    Предупреждения FDA: FDA добавило предупреждающую этикетку на мРНК-вакцинах относительно серьезных (но редких) случаев воспаления сердечной мышцы (миокардит) и внешней оболочки сердца (перикардит) у подростков и молодых людей, чаще после введения второй дозы мРНК-вакцины.Воспаление в большинстве случаев проходит само по себе без лечения.

    Как это работает: В нем используется технология мРНК, представляющая собой новый тип вакцины. Он работает, отправляя инструкции клеткам-хозяевам в организме для создания копий шиповидного белка (например, шипы, торчащие из коронавируса на фотографиях). Но наши клетки признают, что этот белок не принадлежит, и иммунная система реагирует, активируя иммунные клетки и вырабатывая антитела. Это побудит организм распознать и атаковать настоящий шиповидный белок SARS CoV-2, если вы подвергнетесь воздействию настоящего вируса.

    Насколько хорошо это работает: Когда компания Pfizer-BioNTech подала заявку на получение разрешения FDA на свою вакцину в декабре 2020 года, ее первоначальные клинические данные Фазы 3 превзошли ожидания с эффективностью 95%, основанной на независимом анализе FDA. Но данные о реальной эффективности для взрослых показывают, что защита от двух доз первичной серии мРНК со временем ослабевает; однако бустерная доза (для тех, кто имеет право) возвращает иммунную систему на устойчивый уровень.

    Насколько хорошо это работает против вариантов : ученые все еще изучают, насколько эффективна вакцина Pfizer-BioNTech против Omicron, который является преобладающим вариантом в США.S. В начале этого года CDC опубликовал данные, которые показали, что прививки мРНК обеспечивают значительную защиту от госпитализации от Omicron и могут снизить риск обращения в отделение неотложной помощи или клинику неотложной помощи. Дополнительные данные CDC в феврале показали, что эффективность мРНК-бустера против госпитализации и посещений отделений неотложной помощи или центров неотложной помощи снижается примерно через четыре месяца. Недавние данные CDC и исследование (еще не рецензированное) Департамента здравоохранения штата Нью-Йорк показали, что защита от коронавирусной инфекции у детей в возрасте от 5 до 11 лет со временем ослабевает, хотя вакцина по-прежнему обеспечивает защиту от госпитализации. и смерть, даже во время волны Омикрона.


    Модерна

    FDA предоставило вакцине Moderna (торговая марка: Spikevax) полное одобрение для людей в возрасте 18 лет и старше в январе 2022 года, обновив EUA вакцины, которое было предоставлено в декабре 2020 года (через неделю после Pfizer-BioNTech). Moderna использует ту же технологию мРНК, что и Pfizer-BioNTech, и показала столь же высокую эффективность в предотвращении симптоматического заболевания, когда компании подали заявку на получение разрешения; он также должен храниться при температуре морозильной камеры.

    Кто может получить:  Все в возрасте 18 лет и старше в США.С.

    Дозировка: Для основной серии: две инъекции с интервалом 28 дней. Полностью эффективен через две недели после второго выстрела. Для некоторых людей старше 12 лет, особенно мальчиков и мужчин в возрасте от 12 до 39 лет, CDC предлагает восьминедельный интервал между двумя прививками, чтобы снизить риск миокардита, редкого побочного эффекта (см. предупреждения FDA ниже).

    Кто может получить бустер: Любой человек в возрасте 18 лет и старше должен получить бустерную прививку через пять месяцев после основной серии Moderna (две прививки).В большинстве случаев предпочтительнее бустер мРНК Pfizer-BioNTech или Moderna.

    Если у вас ослабленный иммунитет: Любой человек в возрасте 18 лет и старше с ослабленным иммунитетом средней или тяжелой степени должен получить дополнительную первичную прививку (или третью дозу) вакцины Pfizer-BioNTech или Moderna через 28 дней после второй прививки Moderna. Через пять месяцев они получат право на повторную прививку и в большинстве случаев могут выбрать бустерную прививку Moderna или Pfizer-BioNTech.

    Возможные побочные эффекты: Побочные эффекты аналогичны побочным эффектам вакцины Pfizer-BioNTech: боль, покраснение или припухлость в месте укола и/или усталость, головная боль, мышечная боль, озноб, лихорадка или тошнота на всем протяжении остальное тело.Если какой-либо из этих побочных эффектов возникает, он должен пройти через несколько дней. Несколько побочных эффектов являются серьезными, но редкими. К ним относятся анафилаксия, тяжелая реакция, которую можно лечить адреналином (препарат в Epipens®).

    Предупреждения FDA:  Управление по санитарному надзору за качеством пищевых продуктов и медикаментов (FDA) поместило на вакцину Moderna предупреждающую этикетку в отношении «вероятной связи» с зарегистрированными случаями воспаления сердца у молодых людей. Это воспаление может возникать в сердечной мышце (миокардит) или во внешней оболочке сердца (перикардит) — чаще всего оно возникает после введения второй дозы мРНК-вакцины.Воспаление в большинстве случаев проходит само по себе без лечения.

    Как это работает:  Подобно вакцине Pfizer, это мРНК-вакцина, которая отправляет клеткам организма инструкции по созданию спайкового белка, который обучает иммунную систему распознавать его. Затем иммунная система атакует шиповидный белок в следующий раз, когда увидит его (прикрепленный к реальному вирусу SARS CoV-2).

    Насколько хорошо это работает: Первоначальные клинические данные фазы 3 Moderna в декабре 2020 года были аналогичны данным Pfizer-BioNTech — на тот момент обе вакцины показали эффективность около 95%.

    Насколько хорошо она работает с вариантами вируса:  Ученые все еще изучают, насколько эффективна вакцина Модерна против Омикрона. В начале этого года CDC опубликовал данные, которые показали, что прививки мРНК обеспечивают значительную защиту от госпитализации от Omicron и могут снизить риск обращения в отделение неотложной помощи или клинику неотложной помощи. Дополнительные данные CDC в феврале показали, что эффективность мРНК-бустера против госпитализации и посещений отделений неотложной помощи или центров неотложной помощи снижается примерно через четыре месяца.

    Джонсон и Джонсон

    FDA одобрило вакцину против коронавируса компании Johnson & Johnson (торговая марка: Janssen) в феврале 2021 года. В отличие от первых двух вакцин, это вакцина-носитель или вирусный вектор, тип вакцины, которая ранее использовалась для лечения гриппа. Стратегия одноразового введения упростила распространение вакцины J&J и ее введение людям, которые сочли ее наиболее удобной для получения вакцины. Но весной 2021 года опасения по поводу редких тромбов, связанных с вакциной, побудили правительство приостановить ее действие, которое вскоре было снято.Затем, в декабре, CDC снова отреагировал на эти опасения, выразив предпочтение прививкам Pfizer и Moderna.

    Кто может это получить:  В некоторых ситуациях первичную серию однократных инъекций можно назначать взрослым от 18 лет и старше, в том числе в случае тяжелой реакции после введения дозы мРНК-вакцины или тяжелой аллергии на ингредиент другой вакцины. вакцины, если в противном случае они остались бы непривитыми из-за ограниченного доступа к другим вакцинам или если они предпочитают прививку J&J, несмотря на соображения безопасности.

    Кто может получить бустерную дозу: В большинстве случаев каждый человек в возрасте 18 лет и старше должен получить бустерную дозу вакцины Pfizer-BioNTech или Moderna как минимум через 2 месяца после однократной первичной прививки J&J.

    Если у вас ослаблен иммунитет: В настоящее время дополнительная первичная прививка не рекомендуется; в большинстве случаев рекомендуется бустер Pfizer-BioNTech или Moderna.

    Дозировка: Одиночный выстрел. Полностью эффективен через две недели после вакцинации.

    Возможные побочные эффекты:  Боль, покраснение, отек в руке, в которую был сделан укол; усталость, головная боль, боль в мышцах, озноб, лихорадка, тошнота во всем остальном теле. Если какой-либо из этих побочных эффектов возникает, он должен пройти через несколько дней.

    Предупреждения FDA : В июле FDA приложило предупреждение к вакцине Johnson & Johnson после того, как были зарегистрированы редкие случаи неврологического расстройства синдрома Гийена-Барре у небольшого числа реципиентов.Большинство случаев произошло в течение 42 дней после вакцинации.

    В апреле 2021 года FDA добавило предупредительную этикетку после прекращения паузы в отношении вакцины, которую оно рекомендовало «из-за большой осторожности» в связи с необычным, но потенциально смертельным нарушением свертываемости крови , которое произошло у небольшого числа реципиентов.

    В декабре FDA обновило свой информационный бюллетень о прививке, включив в него информацию о редком, но серьезном нарушении свертываемости крови, называемом тромбозом с синдромом тромбоцитопении (TTS), которое было связано с вакциной.Имеющиеся в настоящее время данные подтверждают причинно-следственную связь между тромбами в сочетании с низким уровнем тромбоцитов и вакциной J&J, но FDA продолжает находить, что известные и потенциальные преимущества вакцины перевешивают известные и потенциальные риски COVID-19 для людей в возрасте 18 лет и старше. старшая.

    Как это работает:  Это вакцина-носитель, в которой используется подход, отличный от мРНК-вакцин, для инструктирования клеток человека производить шиповидный белок SARS CoV-2. Ученые создают безвредный аденовирус (распространенный вирус, который, если его не инактивировать, может вызывать простуду, бронхит и другие заболевания) в качестве оболочки для переноса генетического кода шиповидных белков в клетки (похоже на троянского коня).Оболочка и код не могут вызвать у вас заболевание, но как только код оказывается внутри клеток, клетки вырабатывают шиповидный белок для тренировки иммунной системы организма, который создает антитела и клетки памяти для защиты от настоящего SARS-CoV-2. инфекционное заболевание.

    Насколько хорошо это работает:   Данные, представленные компанией J&J в FDA в начале 2021 года, когда она подавала заявку на получение разрешения на свою вакцину, показали эффективность 67% в предотвращении заболевания средней и тяжелой степени/критического состояния через 14 дней после вакцинации и эффективность 66% через 28 дней после вакцинации. вакцинация.

    Насколько хорошо он работает с вариантами вируса: В конце 2021 года J&J объявила, что предварительные результаты исследования в Южной Африке показали, что бустер J&J на 85% эффективен против госпитализации в то время, когда Омикрон был доминирующим вариантом в этой стране. Дополнительные данные об эффективности вакцины против Омикрона ожидаются.

    IgG3 усиливает нейтрализующую активность и эффекторную функцию Fc ВИЧ-специфического широкого нейтрализующего антитела V2

    Abstract

    Антитела широкого нейтрализующего действия (bNAb) защищают от ВИЧ-инфекции у нечеловеческих приматов, и их эффективность может быть повышена за счет взаимодействия с Fc-рецепторами на иммунных клетках.Изотип антитела является модулятором этого связывания с подклассом IgG3, опосредующим мощную эффекторную функцию Fc, и связан с эффективностью вакцины против ВИЧ и контролем над ВИЧ. Функции BNAb обычно оценивают независимо от константной области, с которой они естественным образом экспрессируются. Чтобы изучить роль естественного изотипа в контексте линии bNAb, мы изучили CAP256, ВИЧ-инфицированного человека, у которого развился мощный V2-специфический ответ bNAb. CAP256 экспрессировал постоянно высокие уровни IgG3 в плазме, которые, как мы обнаружили, опосредовали как широкую нейтрализующую активность, так и мощную функцию Fc.Секвенирование ДНК зародышевой линии и константных областей V2-направленных bNAb от этого донора выявило экспрессию нового аллеля IGHG3 , а также IGHG3*17 , аллеля, который продуцирует антитела IgG3 с увеличенным периодом полужизни в плазме. Оба аллельных варианта использовали для создания bNAb IgG3 CAP256-VRC26.25 и CAP256-VRC26.29, и их сравнивали с версиями IgG1. Было показано, что варианты IgG3 имеют значительно более высокий фагоцитоз и трогоцитоз по сравнению с вариантами IgG1, что соответствует повышенной аффинности к FcγRIIa.Нейтрализующая активность также была значительно выше для bNAb IgG3, особенно против вирусов, у которых отсутствует гликан N160. Путем обмена областями шарнира между вариантами подкласса мы показали, что длина шарнира модулирует как эффективность нейтрализации, так и функцию Fc. Это исследование показало, что взаимодействие между вариабельной и природной константными областями IgG3 повышает полифункциональность антител, указывая на ценность использования генетической изменчивости, которую можно использовать для пассивного иммунитета.

    Резюме автора

    В единственном на сегодняшний день частично эффективном испытании вакцины против ВИЧ снижение риска инфекции коррелировало с антителами IgG3, которые связывались с областью V2 оболочки ВИЧ.Антитела IgG3 эффективно опосредуют самый широкий спектр цитотоксических функций Fc, таких как отложение комплемента, клеточный лизис, поглощение и откусывание мембраны. Значимость различных аллелей IgG3 в функции антител обычно не исследуется, равно как и антитела обычно не оцениваются в контексте их природного изотипа. Здесь мы показываем, что IgG3 V2-специфические широко нейтрализующие антитела из донорского CAP256 опосредуют как усиленные цитотоксические функции, так и эффективность нейтрализации по сравнению с вариантом IgG1.Мы демонстрируем, что длинная шарнирная область IgG3 способствовала этой повышенной функциональности. Эти данные позволяют предположить, что изотип может быть настроен для усиления как нейтрализующей, так и цитотоксической активности широко нейтрализующих антител, которые можно использовать для повышения эффективности стратегий пассивной иммунизации для профилактики ВИЧ.

    Образец цитирования: Ричардсон С.И., Лэмбсон Б.Е., Кроули А.Р., Баширова А., Шиперс С., Гарретт Н. и др. (2019) IgG3 усиливает нейтрализующую активность и эффекторную функцию Fc ВИЧ-специфического широкого нейтрализующего антитела V2.ПЛОС Патог 15(12): е1008064. https://doi.org/10.1371/journal.ppat.1008064

    Редактор: Katie J. Doores, Королевский колледж Лондона, СОЕДИНЕННОЕ КОРОЛЕВСТВО

    Получено: 25 июня 2019 г.; Принято: 2 сентября 2019 г.; Опубликовано: 16 декабря 2019 г.

    Эта статья находится в открытом доступе, свободна от каких-либо авторских прав и может свободно воспроизводиться, распространяться, передаваться, изменяться, дополняться или иным образом использоваться любым лицом в любых законных целях.Работа доступна в качестве общественного достояния Creative Commons CC0.

    Доступность данных: Новая последовательность аллеля IGHG3 (IGHG3*01m) доступна в базе данных Genbank (MK679684) https://www.ncbi.nlm.nih.gov/nuccore/MK679684. Все остальные соответствующие данные находятся в рукописи и файлах со вспомогательной информацией.

    Финансирование: S.I.R. финансируется Национальным исследовательским фондом, Фондом полиомиелита, Университетом Витватерсранда и поддерживается двумя стипендиями для научных обменов в области вакцин против СПИДа от Фонда Билла и Мелинды Гейтс.Это исследование было поддержано Национальным институтом аллергии и инфекционных заболеваний Национального института здравоохранения под номером награды U01AI136677. Финансирование также было получено от Флагманской программы Южноафриканского совета медицинских исследований и программ SHIP, а также от Национальных институтов здравоохранения (NIH) / Национального института аллергии и инфекционных заболеваний (NIAID) номер гранта R01: R01AI104387. CAPRISA финансируется Национальным институтом аллергии и инфекционных заболеваний (NIAID), Национальными институтами здравоохранения (NIH) и U.S.С. Министерство здравоохранения и социальных служб (грант: AI51794). П.Л.М. поддерживается Южноафриканской инициативой кафедр исследований Департамента науки и технологий и Национального исследовательского фонда (грант № 98341). М.Е.А. поддерживается Фондом Билла и Мелинды Гейтс OPP1114729, OPP1146996, Национальными институтами здравоохранения 1P01AI120756 (NIAID), 1R0AI131975 (NIAID и NIGMS). Этот проект полностью или частично финансируется за счет федеральных средств Национальной лаборатории исследований рака им. Фредерика по контракту №HHSN261200800001E. Содержание этой публикации не обязательно отражает взгляды или политику Министерства здравоохранения и социальных служб, а упоминание торговых наименований, коммерческих продуктов или организаций не означает их одобрения правительством США. Это исследование было частично поддержано Программой внутренних исследований NIH, Национальной лаборатории Фредерика, Центра исследований рака. Спонсоры не играли никакой роли в дизайне исследования, сборе и анализе данных, принятии решения о публикации или подготовке рукописи.

    Конкурирующие интересы: Авторы заявили об отсутствии конкурирующих интересов.

    Введение

    Антитела представляют собой многофункциональные молекулы, которые опосредуют как нейтрализацию патогенов за счет взаимодействия Fab-антиген, так и различные эффекторные функции Fc благодаря их способности взаимодействовать с клеточными рецепторами. Было показано, что пассивный перенос ВИЧ-специфических широко нейтрализующих антител (bNAb) обеспечивает стерилизующий иммунитет на животных моделях, поэтому их индукция остается основной целью вакцинации [1].Однако накопленные данные свидетельствуют о том, что эффекторные функции Fc также способствуют защите, обеспечиваемой этими bNAb [2–5]. Fc-зависимые механизмы могут ограничивать количество передаваемых вирусов/основных вирусов, которые вызывают инфекцию, влияют на вирусную нагрузку, способствуют ускользанию вируса [6–9] и связаны с контролем ВИЧ [10] и замедлением прогрессирования заболевания [11, 12]. В частично эффективном испытании вакцины против ВИЧ RV144 снижение риска инфицирования коррелировало с эффекторной функцией Fc, опосредованной в основном антителами IgG3, направленными к области V1V2 оболочки ВИЧ [13, 14].К ним относятся антителозависимая клеточная цитотоксичность (ADCC) или лизис клеток, клеточный фагоцитоз (ADCP) и отложение комплемента [13–16], что впервые иллюстрирует важность функций Fc и их модуляторов, таких как изотип, в профилактике ВИЧ.

    Несмотря на высокую консервативность Fc антитела, вариации константных областей генов тяжелой цепи (Ch2-3) приводят к появлению различных изотипов (IgM, IgA, IgG и IgE) и подклассов (IgG1-4 и IgA1-2), а также аллельные варианты.Эти изотипы имеют различную структуру, образование иммунных комплексов, время полужизни и аффинность связывания с рецепторами Fc, что позволяет им по-разному взаимодействовать с различными клетками и модулировать эффекторные функции Fc [17]. В настоящее время имеются убедительные доказательства того, что разные изотипы и их полиморфизмы проявляют различную защиту от ряда заболеваний, включая ВИЧ, хотя механизм этого не часто исследуется [18–21].

    IgG3 является наиболее полифункциональным из подклассов IgG, вызывая самый широкий спектр и наиболее мощные эффекторные функции Fc [22].Этот изотип обычно появляется на ранних стадиях ВИЧ-инфекции [23, 24] и, как было показано, снижается по мере прогрессирования заболевания, совпадающего со снижением эффекторных функций Fc [25]. Несмотря на низкие титры, антитела IgG3 являются мощными медиаторами реакций, индуцированных вакциной против ВИЧ [13, 14, 26], и связаны с контролем ВИЧ в ряде когорт [10, 27, 28], что позволяет предположить, что поддержание уровня IgG3 может быть полезным для профилактика. Однако недавнее исследование показало, что IgG3 при хронической инфекции может ослаблять ответ В-клеток [29], подчеркивая сложную и множественную роль IgG3 при ВИЧ-инфекции.Ген IGHG3 является высокополиморфным с 29 зарегистрированными аллелями [30], обеспечивая еще один уровень изменчивости, хотя функциональная значимость этого в значительной степени неизвестна. Хотя большинство вариантов IgG3 связаны с более коротким периодом полужизни в плазме по сравнению с IgG1 [23, 24], пять аллельных вариантов IgG3 имеют период полужизни, эквивалентный IgG1 [31]. Кроме того, в зависимости от аллельного варианта шарнир IgG3, соединяющий области Fab и Fc, в 2–4 раза длиннее, чем у IgG1. Эта увеличенная длина шарнира может повлиять на стабильность антител, гибкость и сродство к антигенам, что, в свою очередь, влияет на функцию и может привести к дифференциальной защите [32–34].Таким образом, имеются убедительные доказательства того, что аллельные вариации в IgG3 могут непосредственно влиять на эффекторную функцию Fc и нейтрализацию, опосредованную дистальным Fab.

    В этом исследовании мы стремились выяснить, можно ли улучшить функцию bNAb при экспрессии в виде IgG3, а также изучить ценность изучения антител, поскольку они экспрессируются естественным образом. Ранее мы описали CAP256, ВИЧ-инфицированного донора, который развил мощный V2-направленный широкий нейтрализующий ответ и поддерживал высокие уровни ВИЧ-специфического IgG3 в течение 3 лет [35].Здесь мы показываем, что плазменный ответ IgG3 в CAP256 способствует как широте нейтрализации, так и функции Fc. Кроме того, мы описываем представителей линии CAP256-VRC26 V2 bNAb [36, 37], которые используют новый аллель IGHG3 и наличие долгоживущего аллеля IGHG3*17 , который придает улучшенную эффекторную функцию Fc и нейтрализующую активность. Это исследование представляет собой первый пример подкласса IgG3, модулирующего улучшенную нейтрализующую способность с помощью V2-специфического bNAb, и определяет новый механизм, с помощью которого могут быть созданы bNAb для повышения эффективности и защиты.

    Результаты

    IgG3 опосредует эффекторные функции и нейтрализацию Fc в донорском CAP256

    Используя индивидуальный мультиплексный анализ подкласса IgG [38] с 14 различными антигенами ВИЧ, а также тримерный ИФА BG505.SOSIP.664, мы провели скрининг образцов от 24 ВИЧ-инфицированных доноров в когорте острой инфекции CAPRISA 002 [39, 40] в через 6, 12 и 36 месяцев после заражения. Только у трех доноров были обнаружены высокие уровни ВИЧ-специфического IgG3 (выделены звездочкой на рис. 1А). У донора CAP177 эти уровни со временем снижались, что типично для ВИЧ-инфекции [23], в то время как у донора CAP331 наблюдался IgG3-ответ на несколько не-ВИЧ-антигенов, что свидетельствует об общем искаженном IgG3-гуморальном ответе, уникальном для этого индивидуума.Как наблюдалось в предыдущем исследовании, мы подтвердили, что донорский CAP256 имел высокие уровни ВИЧ-специфических IgG3, которые увеличивались со временем [35], с небольшой реактивностью к антигенам, не относящимся к ВИЧ. CAP256 продемонстрировал самую высокую широту нейтрализации и Z-показатель полифункциональности Fc среди всех участников, указанный в течение 36 месяцев после заражения (рис. 1А). Кроме того, ВИЧ-специфические антитела IgG3 плазмы в CAP256 нацелены на более широкий спектр антигенов ВИЧ по сравнению с CAP177 и CAP331 (рис. 1B).

    Рис. 1. ВИЧ-специфический IgG3 опосредует как эффекторные функции Fc, так и нейтрализующую активность в CAP256.

    (A) Уровни общего и антиген-специфического IgG3 (против 14 антигенов ВИЧ, BG505.SOSIP.664, гликопротеина В цитомегаловируса, нуклеопротеина кори и гемагглютинина гриппа) измеряли в плазме IgG у 24 человек CAPRISA с помощью ИФА или мультиплексного анализа . Данные за 6, 12 и 36 месяцев p.i. для каждого человека сложены, представлены в виде Z-показателей IgG3, нормализованных к общему IgG, со звездочкой, указывающей на людей с высокими уровнями ВИЧ-специфического IgG3. Данные ранжированы по общей Z-оценке полифункциональности Fc и показаны на серой шкале, определяемой как добавление ADCC, специфичной для ConC gp120 (% гранзима B в CEM живой мишени.Клетки NKR.CCR5), ADCP (% клеток THP-1, которые поглощают флуоресцентные шарики x MFI), ADCT (относительная доля PKh36, перенесенная из клеток-мишеней в клетки CSFE+ THP-1) и ADCD (% отложения C3b) с течением времени. Широта нейтрализации против панели из 44 вирусов через 36 месяцев p.i. показан серой заливкой. (B) Относительная доля антител IgG3, связывающихся с 14 различными ВИЧ-специфическими антигенами и сгруппированных по эпитопам, показана для CAP177, CAP256 и CAP331 через 36 месяцев p.i. (C) Нейтрализующая активность (IC 50 в мкг/мл) недеплетированного (черный) и обедненного IgG3 (красный) поликлонального IgG из CAP256 через 36 месяцев p.я. против нескольких вирусов, где KO = нокаут или более 25 мкг/мл. Достоверная разница указана как *p<0,05, определенная с помощью знакового рангового критерия Уилкоксона для сопоставленных пар. (D) Эффекторная функция Fc в отношении BG505.SOSIP.664 для образцов с истощенным (красный) и недеплетированным (черный) CAP256 IgG3. Значимые различия, показанные как *p<0,05 и **p<0,01, были определены критерием Фридмана с поправкой Данна. Все данные являются репрезентативными для трех независимых экспериментов.

    https://дои.org/10.1371/journal.ppat.1008064.g001

    Чтобы определить, обладают ли антитела IgG3 в донорском CAP256 функциональной активностью, мы удалили IgG3 из общего IgG плазмы, используя магнитные шарики анти-IgG3 [13] через 36 месяцев после инфицирования. момент времени пиковой широты нейтрализации. Было подтверждено, что обработанный IgG плазмы лишен IgG3 с помощью ELISA, и было протестировано против панели из семи чувствительных вирусов. За исключением аутологичного вируса CAP256_SU, наблюдалось значительное снижение титра нейтрализации (p = 0.016; Знаковый ранговый тест Уилкоксона на соответствие пар) после истощения IgG3, на что указывает более чем 3-кратное изменение или нокаут (> 25 мкг / мл) по сравнению с образцами без истощения (рис. 1C, рис. S1). Хотя остаточная нейтрализация после истощения демонстрирует, что другие подклассы IgG также вносят свой вклад, большая часть нейтрализующего ответа против этих вирусов была опосредована mAb IgG3.

    Затем мы исследовали эффекторную функцию Fc с использованием образцов, лишенных IgG3, через 6, 12 и 36 месяцев после заражения BG505.Тример СОСИП.664. Эти функции включали антителозависимый клеточный фагоцитоз (ADCP), измеряемый как поглощение гранул с покрытием моноцитарной клеточной линией [41], антителозависимый клеточный трогоцитоз (ADCT), измеряемый как перенос мембранного красителя PKh36 от покрытых антигеном клеток-мишеней к THP- 1 [42], антителозависимая клеточная цитотоксичность (ADCC), определяемая как процент гранзима B, секретируемого NK-клетками на покрытых антигеном клетках-мишенях [43], и, наконец, антителозависимое отложение комплемента (ADCD), определяемое отложением C3b на поверхности клеток, покрытых антигеном [10].Значительное снижение ADCT, ADCP, ADCC и ADCD наблюдалось для образцов, истощенных по CAP256 IgG3 (рис. 1D). Эти данные показывают, что стойкий ВИЧ-специфический ответ IgG3 в плазме от донорского CAP256 опосредует как мощную нейтрализацию, так и множественные эффекторные функции Fc.

    bNAb, выделенный из CAP256, использует новый аллель

    IGHG3

    Ранее мы выделили большое семейство bNAb из донорского CAP256, которые нацелены на четвертичный эпитоп V2, присутствующий только на тримере ВИЧ [36, 37].Используя остатки кДНК из предыдущих сортов В-клеток, мы амплифицировали все Ch2-Ch4 и шарнирные области CAP256-VRC26.29 (далее именуемые CAP256.29) (рис. 2A и S2). Анализ последовательности показал, что этот bNAb использует ранее неописанный аллель IGHG3 , который мы обозначили как IGHG3*01m (идентификатор GenBank: MK679684). Этот новый аллель отличается от IGHG3*01 по положению 419 и от IGHG3*13 по положению 392 (S3 Fig). Два дополнительных bNAb из этой линии (CAP256.30 и CAP256.33), также было обнаружено, что они принадлежат к подклассу IgG3 (рис. S2). Последовательность области Ch2-3 из геномной ДНК CAP256 соответствовала генотипу IGHG3*01m/17 (рис. S2). Это наблюдение было дополнительно подтверждено секвенированием кДНК из mAb 1G2 и трех других неродственных тяжелых цепей, выделенных от того же донора, которые отличались от линии bNAb CAP256-VRC26 и использовали аллель IGHG3*17 (рис. 2A и S2). Этот аллель представляет особый интерес, поскольку его период полужизни эквивалентен IgG1, в отличие от большинства других вариантов IgG3, которые имеют значительно более короткий период полужизни в результате их более низкой аффинности к неонатальному рецептору Fc, приписываемому аргинину в положении 435. [31].

    Рис. 2. Аллельные варианты IgG3 bNAb CAP256 демонстрируют усиление ADCP и ADCT.

    (A) Аминокислотные последовательности области Ch4 антител, выделенных из CAP256, выровнены с IGHG1 . Выравнивание IGHG3*01 (синий), нового аллеля, обозначенного IgG3*01m, из CAP256.29 bNAb (красный), не-ВИЧ mAb CAP256.1G2 и IGHG3*17 (зеленый). SNP, которые различаются между вариантами IgG3, обозначены серым цветом. (B) Варианты CAP256.29 (оранжевый) и CAP256.25 (фиолетовый) экспрессировались как IgG1, IgG3*01, *01m и *17. (C) Все варианты CAP256.29 и CAP256.25 тестировали на ADCP (% клеток THP-1, которые поглощают покрытые антигеном флуоресцентные гранулы x MFI), ADCT (относительная доля PKh36, перенесенных из клеток-мишеней в CSFE+ THP- 1), ADCC (% гранзима B в живых клетках-мишенях) и ADCD (% отложения C3b на поверхности клеток-мишеней) против BG505.SOSIP.664. Клетки-мишени CEM.NKR.CCR5, покрытые тримером gp140. Паливизумаб (Pali) был отрицательным контролем, а поликлональный IgG из пула ВИЧ+ — положительным контролем.Значимые различия между вариантами IgG1 и IgG3 показаны черным цветом, а между аллельными вариантами IgG3 — серым цветом. Для всех экспериментов статистическую значимость рассчитывали с использованием критерия Фридмана с поправкой Данна на множественные сравнения, где *p<0,05, **<0,01 и ***<0,001. Представлены среднее значение и стандартное отклонение 3 независимых экспериментов.

    https://doi.org/10.1371/journal.ppat.1008064.g002

    bNAb CAP256, экспрессированные в виде IgG3, проявляют улучшенную эффекторную функцию Fc

    Чтобы исследовать функциональное влияние этих различных константных областей, мы создали CAP256.29 и CAP256.25 (более мощный и широкий член линии) в виде вариантов IgG3*01, IgG3*01m и IgG3*17 (рис. 2B). Чистоту этих препаратов оценивали с помощью нативного электрофореза в электрофорезе с минимальными признаками димеризации для обоих подклассов. Как и ожидалось, все варианты IgG3 были примерно на 10 кДа больше, чем варианты IgG1.

    Эти антитела тестировали на эффекторную функциональную активность Fc против тримера BG505.SOSIP.664 с концентрациями, адаптированными с учетом различного размера белков.Все варианты IgG3 как CAP256.29, так и CAP256.25 продемонстрировали значительно более высокие уровни ADCP и ADCT, чем варианты IgG1 (представленные в концентрации пиковой активности на рис. 2C и в диапазоне концентраций на рис. S4), в соответствии с числом исследований, показавших усиление фагоцитоза антителами IgG3 [44–46] (Chu, совместное представление). Однако улучшения ADCC или ADCD не наблюдалось, поскольку bNAb CAP256.25 и CAP256.29 обычно демонстрировали низкие уровни ADCD по сравнению с поликлональным ВИЧ-положительным контролем.В нескольких случаях наблюдались значительные различия между аллельными вариантами IgG3 в их способности опосредовать ADCP, ADCT и ADCC (показаны серыми полосами значимости), что указывает на то, что не только подкласс, но и аллельная вариация могут влиять на некоторые Fc-опосредованные эффекторные функции.

    Улучшенная эффекторная функция Fc отслеживает взаимодействие с рецептором Fc, но не увеличивает связывание антигена

    Чтобы определить, зависит ли эффекторная функция Fc от сродства к антигену, мы оценили, демонстрируют ли варианты IgG3 различия в связывании с BG505.Тример СОСИП.664. Ранее было показано, что на эффекторные функции Fc влияет аффинность Fab к антигену [47]. Используя анти-Fab ELISA, чтобы учесть потенциальное изотипическое смещение анти-IgG-антител, мы не обнаружили различий в аффинности антител CAP256 к тримеру независимо от подкласса (рис. 3A и 3B).

    Рис. 3. Fcγ-рецептор и отсутствие связывания с антигеном связаны с дифференциальной эффекторной функцией Fc.

    (A) Связывание с тримером BG505.SOSIP.664 с помощью ELISA показано для всех вариантов CAP256/29 и CAP256.25 соответственно. F105 и 447-52D показаны как отрицательный контроль. Графики являются репрезентативными для 2 независимых экспериментов. (B) Константы равновесия диссоциации (K D в мкМ), определенные методом поверхностного плазмонного резонанса (SPR) вариантов подкласса для всех Fc-рецепторов, сгруппированы по bNAb. Значимость определяли с помощью парного t-критерия, где ns = незначимо. (C) Константы равновесия диссоциации для всех вариантов связывания CAP256.29 и CAP256.25 с 5 различными рецепторами Fc.Связанные точки указывают на антитела с одной и той же частью Fc, связывающейся с одним и тем же рецептором Fc, но с частями Fab CAP256.29 (оранжевый) или CAP256.25 (фиолетовый). Поликлональный IgG CAP256 был положительным контролем, а VRC01 N297Q был отрицательным контролем. Данные являются репрезентативными для 2 независимых экспериментов. (D) Константы равновесия диссоциации (K D в мкМ) показаны для IgG1 в сравнении с вариантами IgG3 для каждого из протестированных Fc-рецепторов. Полиморфные варианты каждого рецептора, а также сродства к обоим CAP256.29 и CAP256.25 сгруппированы вместе. Значимость указывается как *p<0,05 или **p<0,001 и определяется с помощью парного t-критерия.

    https://doi.org/10.1371/journal.ppat.1008064.g003

    Затем мы исследовали аффинность антитела к рецепторам Fc, которая варьируется в зависимости от подкласса и, как известно, модулирует эффекторную функцию Fc. В предыдущем исследовании сообщалось об усиленном связывании антител IgG3 с различными FcɣR [17]. Поэтому мы использовали поверхностный плазмонный резонанс (SPR), чтобы исследовать, отслеживается ли повышенная эффекторная функция Fc, опосредованная IgG3, при более сильном связывании вариантов с соответствующими низкоаффинными Fc-рецепторами.Антитела CAP256.29 и CAP256.25 оценивали на силу связывания с FcγRIIa и FcγRIIb, которые опосредуют ADCP и ADCT, и FcγRIIIa, необходимыми для ADCC [48]. Полиморфные варианты рецепторов Fc, которые, как известно, влияют на сродство к IgG, включая FcγRIIa (R131 против h231) и FcγRIIIa (F158 против V158), также были протестированы [17]. Микромолярные значения K D показаны на рис. 3B–3D, а репрезентативные кинетические кривые и стандартное отклонение аффинности показаны на рис. S5. Различия в аффинности Fc-рецептора между одними и теми же вариантами Fc CAP256.29 и CAP256.25 в целом не были значимыми (фиг. 3B), как и ожидалось, учитывая, что Fab вряд ли будет играть роль в связывании рецептора Fc в отсутствие антигена. В соответствии с наблюдаемым повышением активности ADCP и ADCT версии IgG3 как CAP256.29, так и CAP256.25 показали умеренную, но значительно более сильную аффинность связывания с FcγRIIa и FcγRIIb по сравнению с IgG1 (рис. 3C и 3D). Наиболее выраженным было 3,7–5-кратное усиление связывания вариантов IgG3 с FcγRIIA h231 по сравнению с IgG1.Связывание FcγRIIIa было одинаковым для всех вариантов IgG3 и IgG1 (рис. 3D), что согласуется со сравнимыми уровнями активности ADCC, за исключением CAP256.25 IgG3*17, который показал самое слабое связывание (варьируется в 1,7–1,9 раза меньше, чем другие варианты) и самые низкие уровни ADCC (рис. 2C). В целом, большее сродство к FcγRIIa/b отслеживается с усиленной функцией ADCP и ADCT.

    Аллельная вариация в Ch4 IgG3 изменяет активность ADCC

    Более низкие уровни активности ADCC с помощью CAP256.25 IgG3*17 по сравнению с другими аллельными вариантами IgG3 были неожиданными (рис. 2C и 2D).Анализ последовательностей показал, что IgG3*17 имеет лизин в положении 392 (рис. 2А), который аннулирует потенциальный N-связанный гликановый (PNG) мотив, важный для стабильности [33] и ранее связанный с различиями в ADCC [49]. Чтобы исследовать это, мы мутировали лизин на аспарагин, чтобы он соответствовал IgG3*01m (рис. 2А, рис. S2). Восстановление этого мотива PNG привело к значительному увеличению активности ADCC, но не повлияло на другие функции (S6 Fig). Это открытие было подтверждено сопутствующим увеличением аффинности мутанта к обоим полиморфным вариантам FcγRIIIa (S6 Fig).Мутант K392N также демонстрировал значительно повышенное связывание с FcγRIIb, но не влиял на активность ADCP, возможно, потому, что аффинность к рецепторам FcγRIIa оставалась неизменной. Эти данные дополнительно иллюстрируют взаимосвязь между связыванием рецептора Fc и эффекторной функцией Fc и указывают на то, что аллельные вариации в Ch4 могут значительно влиять на активность Fc.

    Варианты IgG3 bNAb CAP256 демонстрируют значительно более высокую эффективность нейтрализации

    Затем мы проверили, влияет ли использование константной области IgG3 на нейтрализующую активность антител CAP256, используя большую панель вирусов в надежном анализе TZM-bl.CAP256.25 значительно шире, чем CAP256.29, поэтому для каждого mAb использовали хорошо охарактеризованную панель из 49 вирусов и панель из 22 вирусов (таблица S1). Анализы проводили не менее 3 раз в прямом сравнении с оператором, ослепленным тестируемым вариантом антитела. Все варианты IgG3 продемонстрировали значительно более высокую эффективность по сравнению с IgG1 как в отношении CAP256.29 (рис. 4A и 4C), так и в отношении CAP256.25 (рис. 4B и 4D) в целом. Варианты IgG3 CAP256.29 также показали небольшое увеличение ширины по сравнению с IgG1 (83% против 74%, таблица S1).Кроме того, наблюдались значительные различия между аллельными вариантами IgG3 CAP256.25, при этом IgG3*01 и IgG3*01m демонстрировали повышенную эффективность по сравнению с IgG3*17 (рис. 4C). Этот эффект не был характерен для всех вирусов (таблица S1), что свидетельствует о сопутствующей роли вирусной сигнатуры. кратное изменение между bNAb IgG3 и IgG1 против псевдовируса BG505 (таблица S1).

    Рис. 4. Варианты IgG3 CAP256.29 и CAP256.25 демонстрируют усиленную нейтрализацию по сравнению с IgG1.

    Кривые широты действия нейтрализации для вариантов IgG1 (черный), IgG3*01m (красный), IgG3*01 (синий) и IgG3*17 (зеленый) (A) (B) CAP256.25 протестирован на панели из 49 вирусов. Медиана IC 50 всех вариантов (C) CAP256.29 и (D) CAP256.25 bNAb показаны со значительными различиями, рассчитанными по критерию Фридмана с критерием Данна для множественных поправок, где ****p<0 .0001, ***р<0,001, **р<0,01, *р<0,05. Различия между вариантами IgG1 и IgG3 показаны черным цветом, а различия между аллельными вариантами IgG3 — серым. Значения являются репрезентативными для 3 независимых экспериментов. (E) IC 50 вариантов CAP256.25 против вирусов CAP256_PI, 96ZM651.02 и CAP256_SU показаны с использованием клеток TZM-bl без Fc-рецепторов (WT) и клеток, экспрессирующих FcγRI, FcγRIIa, FcγRIIb или FcγRIIIa. Серая область указывает на разницу между потенциями нейтрализации вариантов IgG1 и IgG3.

    https://doi.org/10.1371/journal.ppat.1008064.g004

    Учитывая, что варианты подкласса IgG3 имеют более высокое сродство к рецепторам Fc, и ранее было показано, что нейтрализация bNAb усиливается за счет присутствия рецепторов Fcγ [50]. , мы стремились оценить, усиливались ли различия подклассов нейтрализации в присутствии этих рецепторов. Поэтому мы тестировали нейтрализацию с использованием клеток TZM-bl, трансдуцированных одним из трех рецепторов Fc (FcγRIIa, FcγRIIb и FcγRIIIa).Не было значительного увеличения титра нейтрализации IgG1 или любых аллельных вариантов IgG3 по сравнению со стандартными клетками TZM-bl, в которых отсутствуют рецепторы Fc (серая область постоянна для разных типов клеток, рис. 4E). Это указывало на то, что на различия в нейтрализации между подклассами не влияло присутствие рецепторов Fc.

    Вирусная сигнатура усиления нейтрализации IgG3

    Варианты CAP256.25 IgG3 продемонстрировали наибольшее увеличение нейтрализующей активности по сравнению с IgG1 для 3 вирусов, у всех которых отсутствовал мотив PNG в положении 160 (рис. 5A и таблица S2).Этот гликан является частью эпитопа для этого bNAb и является высококонсервативным [37]. Введение мотива PNG в эти 3 вируса, CAP256_PI, CAP8.6F и CA146.h4.3, привело к сходной нейтрализующей активности для IgG1 и IgG3 (рис. 5B и таблица S3). Однако удаление мотива PNG в вирусе CAP256_SU не приводило к предпочтительной нейтрализации IgG3 (таблица S3). Только у одного другого вируса в нашей панели, BG505, отсутствовал N160, но он не демонстрировал усиленной нейтрализации IgG3, что позволяет предположить, что отсутствие одного этого гликана недостаточно для дифференциальной нейтрализации подклассами IgG.Тем не менее, эти данные указывают на то, что вирусные детерминанты также способствуют повышению эффективности вариантов IgG3.

    Рис. 5. Вирусные и шарнирные механизмы усиленной эффекторной функции Fc и нейтрализующей активности bNAb IgG3.

    (A) Кратность различия IC 50 титров нейтрализации между версиями IgG1 и IgG3*01 CAP256.25 среди 36 вирусов с/без потенциального PNG в положении 160. Значимость рассчитывали с использованием теста Манна-Уитни *р<0.05. (B) Нейтрализационные титры IgG1 и всех аллельных вариантов IgG3 против 3 вирусов (обозначенных формой), у которых отсутствует мотив PNG в мутантах 160 (-N160) и 160 нокаут-ин (+N160). Показаны значимые различия, рассчитанные с помощью критерия ранжирования знаков Уилкоксона, где **p<0,01. (C) Шарнирные последовательности IgG1, IgG3*01m и IgG3*17 показаны с указанными шарнирными экзонами h2-h5. (D) Активность ADCP и ADCT шарнирных вариантов CAP256.25 и вариантов IgG1 или IgG3 дикого типа (подчеркнуты) против BG505.СОСИП.664. Паливизумаб используется в качестве отрицательного контроля, а пул ВИЧ+ клады C используется в качестве положительного контроля. Среднее значение и стандартное отклонение указаны со значимостью, рассчитанной с использованием критерия Фридмана с поправкой Даннса для множественных сравнений, что показано *p<0,05 и **p<0,01. (E) Титры нейтрализации шарнирных вариантов CAP256.25 показаны для 8 вирусов. Указаны медианы, а значимость, рассчитанная с использованием критерия Фридмана с поправкой Даннса для множественных сравнений, показана с *p<0.05 и **р<0,01. (F) Средние и среднегеометрические варианты шарнира IC50, а также различия по кратности от IgG1 показаны сгруппированными по шарниру, где красный цвет указывает на увеличение, а зеленый — на уменьшение различий по кратности.

    https://doi.org/10.1371/journal.ppat.1008064.g005

    Увеличенная длина шарнира IgG3 обеспечивает как усиленную эффекторную функцию Fc, так и нейтрализующую активность

    Другие предположили, что повышенная нейтрализующая способность и/или эффекторная функция Fc антител IgG3 могут быть следствием увеличения длины шарнира и его гибкости [44, 51, 52].Учитывая, что связывание с рецепторами Fcγ было лишь умеренно улучшено для вариантов IgG3, мы исследовали влияние длины шарнира на способность bNAb модулировать функцию Fc. Варианты шарнирного переключателя CAP256.25 были разработаны и протестированы против BG505.SOSIP.664 на активность ADCP и ADCT. Варианты IgG3*01 и IgG3*01m имеют длину шарнира 62 аминокислотных остатка, в то время как шарнир IgG3*17 составляет 47 аминокислотных остатков, а IgG1 — 16 аминокислотных остатков (рис. 5C). Введение шарниров IgG3 из 47 и 62 а.о. в IgG1 значительно повышало активность как ADCP, так и ADCT, в то время как вставка более короткого шарнира IgG1 в варианты IgG3 значительно снижала их активность (рис. 5D).Мы также проверили эти варианты шарнира на нейтрализацию с использованием восьми вирусов, которые показали усиленную нейтрализацию вариантами IgG3 (вирус CAP256_SU служил контролем без различий между подклассами) (таблица S4). Подобно ADCP и ADCT, вставка более длинных петель IgG3 в вариант IgG1 CAP256.25 приводила к значительному увеличению нейтрализующей активности по сравнению с IgG1 (рис. 5E и 5F). Введение короткого шарнира IgG1 в оба bNAb IgG3 приводило к значительному снижению активности.В целом, эти данные показывают, что усиление эффекторной функции Fc и нейтрализация вариантами IgG3 CAP256.25 в значительной степени связаны с естественно длинной шарнирной областью IgG3.

    Обсуждение

    Разработка антител к ВИЧ для пассивной иммунизации в основном сосредоточена на нейтрализующей активности, но вклад константной области в защиту становится все более очевидным [19]. ВИЧ-инфицированный донор CAP256 предоставил уникальную возможность изучить роль IgG3, поскольку было показано, что как широта нейтрализации, так и эффекторные функции Fc опосредуются этим подклассом у этого индивидуума.Используя V2-специфические антитела, ранее выделенные из донорского CAP256, мы показали, что константная область IgG3 улучшает как эффекторную функцию Fc, так и эффективность нейтрализации. Этот эффект был прежде всего результатом увеличенной длины шарнира IgG3. Эти данные подчеркивают особенности константной области, которые можно использовать для повышения функциональности антител, разрабатываемых для пассивного иммунитета.

    В этом исследовании мы показываем, что подкласс IgG оказывает значительное влияние на эффекторную функцию Fc, при этом варианты IgG3 bNAb CAP256-VRC26 лучше способны опосредовать ADCP и ADCT по сравнению с IgG1.Это наблюдение подтверждает несколько исследований, показывающих, что ВИЧ-специфические mAb, экспрессируемые в виде IgG3, опосредуют более высокие уровни ADCP [44–46] (Chu, совместное представление). ADCP имеет большое значение для стратегий профилактики ВИЧ, поскольку его можно индуцировать вакцинацией [53], а эффекторные клетки слизистой оболочки демонстрируют мощный ВИЧ-специфический ADCP [54]. IgG3 также продемонстрировал усиленную ADCT, недавно описанную Fc-зависимую функцию ВИЧ, которая приводит к быстрому уничтожению за счет удаления фрагментов мембраны из клеток-мишеней [42]. Ранее мы показали связь между уровнями IgG3 в плазме и ADCT у ВИЧ-инфицированных доноров [55], и эти новые результаты с использованием изолированных антител подтверждают эту связь.Хотя улучшенные ADCP и ADCT отражались повышенной аффинностью к FcγRIIa/b, другие факторы также способствовали этой повышенной функциональности. Одним из факторов, который не влиял на ADCP, опосредованный IgG3 [44] (Chu, совместное представление) или ADCT, была аффинность антитела к антигену. Другие предположили, что усиление ADCP с помощью IgG3 связано с большей длиной шарнира [44], что мы показываем в этом исследовании и Chu, et al. подтверждает использование антител к ВИЧ различной специфичности, предполагая, что это наблюдение может быть применимо в более широком смысле (Чу, совместное представление).Кроме того, увеличенная длина шарнира IgG3 способствовала усиленному связыванию с FcγRII [56], что согласуется с нашими наблюдениями более высокой активности ADCP и ADCT. Способность рецепторов Fc группироваться на клеточной поверхности необходима для активности ADCP [57], где перекрестное связывание этих рецепторов может быть усилено мультимерами, состоящими из антител с вытянутыми петлями. В совокупности эти данные свидетельствуют о том, что механизм улучшения эффекторной функции Fc с помощью антител IgG3 в сочетании с улучшенной аффинностью FcγR заключается в увеличении длины шарнира.Это может обеспечить повышенную гибкость, приводящую к большему эффекту авидности, например, к способности задействовать несколько шипов огибающей.

    В дополнение к влиянию на функцию Fc мы показываем роль подкласса IgG3 в модулировании способности нейтрализации антител в bNAb CAP256.25 и CAP256.29. Хотя более ранние исследования показали аналогичный эффект для IgG3, в них использовались слабо нейтрализующие антитела к ВИЧ, F105 и F240, а не bNAb [58, 59]. Варианты переключения класса с использованием других изотипов, таких как версии IgA bNAbs Ch41, 2G12 и 2F5, также показали улучшенную аффинность, нейтрализацию и защиту по сравнению с IgG [60–62].Однако некоторые bNAb MPER не затрагиваются как варианты переключения подкласса [63], что позволяет предположить, что влияние константной области может зависеть от эпитопа-мишени. Отсутствие какого-либо влияния вариации переключения класса на нейтрализацию также наблюдалось для специфичного для сайта связывания CD4 VRC01 и специфичного для V3-гликана 447-52D, как описано Chu et al. (Чу, совместное представление). Это может быть связано с различиями в стехиометрии связывания между разными антителами, некоторые из которых могут получить большую пользу от повышенной гибкости шарнира, чем другие [36, 64].Тем не менее, эти данные предоставляют существенные доказательства того, что константные области ВИЧ-специфических mAb могут влиять на их нейтрализующую активность. Это открытие имеет значение для выбора подходящих подклассов антител для пассивной иммунизации, где повышенная эффективность приводит к более низкой терапевтической дозе [65].

    Для некоторых вирусов варианты IgG3 CAP256 bNAb показали 20-кратное увеличение активности по сравнению с IgG1. У этих вирусов отсутствовал PNG в положении 160 в петле V2, и они были наиболее сильно нейтрализованы вариантами IgG3 линии CAP256-VRC26.Этот гликан может стерически препятствовать углу, под которым варианты IgG3 с длинными шарнирами приближаются к тримеру. Тот факт, что взаимодействие с вирусными эпитопами изменяется в зависимости от изотипа, подтверждает предыдущие исследования варианта IgA bNAb 2F5, который имел отличный паратоп по сравнению с вариантом IgG [61]. Мы также подтвердили, что более длинная длина шарнира вариантов подкласса IgG3, IgG3*01m и IgG3*17 опосредована повышенной нейтрализующей активностью. Это подтверждает возможность того, что гибкость IgG3 повышает доступность этого паратопа антитела, отличного от тех, которые связаны шарнирными вариантами VRC01 и 447-52D, которые не различаются по эффективности нейтрализации (Chu, совместное представление).В соответствии с этим открытием Scharf и его коллеги показали, что шарнир способствует улучшенной нейтрализации путем сравнения фракций Fab и F(ab’)₂ (которые включают шарнир) поликлонального IgG3 от ВИЧ-инфицированных людей [52]. Внедрение шарнира IgG3 также недавно было использовано для значительного повышения активности и защиты биспецифического bNAb IgG1 ВИЧ [66]. Воздействие увеличенной длины шарнира может также зависеть от плотности антигена-мишени, как было показано для IgG3, который был более бактерицидным, чем IgG1, когда был направлен против редко распределенного менингококкового антигена [67].Учитывая, что тример также редко расположен на поверхности ВИЧ [68], подкласс IgG3 может обеспечить преимущество за счет улучшения связывания и нейтрализации тримерных белков. Это указывает на то, что шарнир действует как мостик для повышения гибкости как Fab в Fab [34], так и Fab в Fc, что может одновременно влиять на перекрестное связывание тримера и связывание Fc-рецептора.

    В нескольких исследованиях изучалось влияние серологически определенных аллотипов IgG на функцию, восприимчивость к заболеванию и ответ на вакцинацию против ВИЧ, подчеркивая актуальность генетической изменчивости в константной области [21, 69].Однако аллотипы IgG охватывают несколько аллелей и не полностью описывают аллельные вариации [30]. Примером может служить N392K, SNP, который не определяет какой-либо аллотип, но демонстрирует сниженную функцию ADCC IgG3*17. Здесь мы показываем, что аллельная вариация IgG3 как в Ch4, так и в шарнире IgG3 имеет функциональное значение, что позволяет предположить, что она может влиять на эффективность пассивной иммунизации или индивидуальные ответы на вакцинацию. Описание нового аллеля IgG3 в этом исследовании показывает важность секвенирования константных областей африканских популяций, которые недостаточно представлены в геномных базах данных.

    Вариабельную и константную области антител часто рассматривают как два структурно и функционально различных компонента, несмотря на растущее количество доказательств взаимодействия между ними [18, 70]. Недавно мы показали, что ранняя и мощная эффекторная полифункциональность Fc предсказывала развитие нейтрализующей активности, подчеркивая, что эти различные функции антител неразрывно связаны [55]. Это исследование подтверждает, что моноклональные антитела с идентичными вариабельными областями, но разными подклассами и аллелями IgG могут опосредовать усиленную эффекторную функцию и нейтрализацию Fc, модулируемую длиной шарнира.Это дает основание для выделения антител в том виде, в каком они встречаются в природе. IgG3 в настоящее время не используется для каких-либо терапевтических mAb, главным образом, из-за короткого периода полураспада и большого количества аллелей, которые могут приводить к антиаллотипическим эффектам. Однако варианты IgG3, такие как IgG3*17, имеют период полужизни, эквивалентный IgG1, и в настоящее время нет доказательств того, что аллельное несоответствие вызывает какие-либо клинические побочные эффекты при терапии, что свидетельствует о том, что IgG3 следует рассматривать для пассивной иммунизации. Кроме того, это и родственное исследование Chu, et al.. (совместная подача Чу) обеспечивают обоснование использования увеличенной длины шарнира для улучшения функции антител. В конечном счете, это исследование иллюстрирует силу использования генетической изменчивости для улучшения функции антител и показывает, что антитела следует оптимизировать на основе не только их характеристик связывания антигена, но и внутренних свойств их константных областей.

    Материалы и методы

    Заявление об этике

    Исследование CAPRISA 002 было одобрено Комитетом по этике биомедицинских исследований Университета Квазулу-Наталь (M160791), а это конкретное исследование было одобрено Комитетом по этике исследований на людях Университета Витватерсранда (M150313).Все участники были взрослыми и дали письменное информированное согласие на использование хранящихся у них образцов для будущих исследований. Все здоровые субъекты в этом исследовании были взрослыми и дали письменное информированное согласие на пожертвование как PBMC, так и плазмы, а также на хранение их образцов для будущего использования.

    Люди и подготовка образцов

    Для этого исследования мы использовали плазму 23 ВИЧ-положительных женщин из когортного исследования острой ВИЧ-инфекции CAPRISA 002, отобранную через 6, 12 и 36 месяцев после заражения.IgG выделяли из плазмы с использованием белка G, чтобы исключить совместное влияние цитокинов или белков плазмы на клеточные анализы, количественно определяли с помощью спектрофотометра Nanodrop (Pierce Biotechnology, Rockford, IL) и подтверждали IgG ELISA.

    Кроме того, мононуклеарные клетки цельной периферической крови (РВМС) здорового донора-мужчины использовали в качестве эффекторных клеток для анализов ADCC. Рецептор FcγRIIIa был генотипирован как гомозиготный по валину в положении 158 с помощью анализа генотипирования TaqMan SNP (rs396991) (Applied Biosystems, Foster City, CA) для обеспечения высоких уровней лизиса.Точно так же в качестве источника комплемента использовали плазму здоровой женщины-донора.

    Линии клеток

    клетки THP-1, полученные в рамках программы AIDS Reagent Program (Division of AIDS, NIAID, NIH, предоставленной доктором Ли Ву и Винитом Н. Кевал-Рамани), использовали как для анализа ADCP, так и для анализа ADCT. Клетки культивировали при 37°C, 5% CO2 в среде RPMI, содержащей 10% инактивированной нагреванием фетальной телячьей сыворотки (Gibco, Gaithersburg, MD), 1% пенициллин-стрептомицина (Gibco, Gaithersburg, MD) и 2-меркаптоэтанол до конечной концентрации 0.05 мМ. CEM-NK R .CCR5, клеточная линия Т-лимфобластов, устойчивых к СЕМ-натуральным киллерам, трансдуцированная CCR5, служила мишенями в анализах ADCC, ADCT и ADCD. Они были получены из программы реагентов AIDS (подразделение AIDS, NIAID, NIH, разработанное доктором Александром Трколой) и культивированы при 37°C, 5% CO2 в среде RPMI, содержащей 10% термоинактивированной фетальной телячьей сыворотки (Gibco, Gaithersburg, MD). ) и 1% пенициллин-стрептомицин (Gibco, Gaithersburg, MD). Клетки TZM-bl, ранее обозначенные как клетки JC53-bl (клон 13), представляют собой клеточную линию HeLa, экспрессирующую высокие уровни CD4 и CCR5 и трансдуцированную геном люциферазы под контролем промотора ВИЧ.Они были получены из Программы реагентов СПИДа (Отдел СПИДа, NIAID, NIH, разработанные доктором Джоном К. Каппесом и доктором Сяоюнь Ву). Эти клетки. Клетки TZM-bl, трансдуцированные FcγRI, FcγRIIa, FcγRIIb и FcγRIIIa, были подарком доктора Дэвида Монтефиори (Университет Дьюка, Дарем, Северная Каролина) и были приготовлены, как описано ранее [50]. Все эти клеточные линии использовали для анализа нейтрализации. Клетки HEK293T были получены от доктора Джорджа Шоу (Университет Алабамы, Бирмингем, Алабама) и использовались для экспрессии псевдовируса.Эти прилипшие клеточные линии культивировали при 37°C, 5% CO2, в среде DMEM, содержащей 10% термоинактивированной фетальной телячьей сыворотки (Gibco BRL Life Technologies) и дополненной 50 мкг/мл гентамицина (Sigma). Клетки разрушали при слиянии с 0,25% трипсином в 1 мМ ЭДТА (Sigma) каждые 48–72 часа. Суспензию клеток HEK293F культивировали в среде 293Freestyle (Gibco BRL Life Technologies) и выращивали во встряхивающем инкубаторе при 37°C, 5% CO2, влажности 70% при 125 об/мин.

    Белки и пептиды

    Плазмиды, кодирующие меченный гистидином рекомбинантный gp120 из ConC и gp120 из CAP45.Последовательности оболочки G3 трансфицировали с использованием полиэтиленимина 25 кДа (Polysciences Inc, Warrington, PA) в клетки HEK293T. Рекомбинантные белки экспрессировали и очищали, как описано ранее [71]. Тример gp140 BG505.SOSIP.664 получали в суспензии клеток HEK293F и очищали методом эксклюзионной хроматографии (SEC) [64]. Перед использованием тример подвергали контролю качества с помощью ELISA связывания CAP256.25 и PGT151 и отсутствия связывания с F105. Штаммы gp41, p24 и gp140 C.ZA.1197MB были приобретены у Immune Tech (Lexington, New York), CAP88.Пептид B5 V3, пептид CAP248 MPER и MPR.03 были приобретены у Peptide 2.0 (Chantilly, Virginia). Каркасные белки и пептиды V1V2, включая циклический CAP45.G3, циклический ConC, gp70V1V2 p2863, gp70V1V2 caseA2, AE 244a и Fda6-CAP45, были экспрессированы в клетках HEK293S (ATCC CRL-3022 N-ацетилглюкозаминилтрансфераза I-делетирована), выращенных в инкубаторе со встряхиванием при 37°C, 5% CO2, влажность 70% при 125 об/мин. Культуры собирали через семь дней и очищали последовательно с помощью Ni-NTA и SEC.

    Индивидуальный мультиплексный анализ подкласса IgG

    Был использован индивидуальный мультиплексный анализ, как описано ранее [38].Вкратце, мультиплексные карбоксилированные гранулы микроплекса (Luminex, Мэдисон, Висконсин) соединяли с 14 антигенами, специфичными для ВИЧ, включая gp120 (ConC и CAP45.G3), пептиды V2 и каркасы (циклический CAP45.G3, циклический ConC, gp70V1V2 p2863, gp70V1V2 caseA2, AE 244a). и Fda6-CAP45), пептид V3 (CAP88.B5), gp41 (пептид CAP248 MPER, пептид MPR.03 и gp41 C.ZA.1197MB), gp140 (C.ZA.1197MB) и p24 (C.ZA.1197MB) . Препарат гранул (50 мкл 100 микросфер/мкл) инкубировали с очищенным IgG в течение ночи (100 мкг/мкл) при 4°С.Уровни основных подклассов IgG и IgG1-IgG4 определяли с помощью PE-конъюгированных агентов для обнаружения (Southern Biotech, Birmingham, AL) с помощью Bio-Plex200. Среднее значение образцов только с PBS, добавленное к 3-кратному их стандартному отклонению, вычиталось из всех образцов в качестве фона.

    IgG3-специфический ИФА

    Общее количество IgG3 измеряли путем покрытия 96-луночного планшета для ELISA с высоким связыванием mAb против IgG человека (Sigma-Aldrich, Сент-Луис, Миссури) в течение ночи при 4°C. Аналогичным образом, для измерения специфических ответов IgG3 против других заболеваний планшеты для ELISA покрывали гликопротеином В цитомегаловируса (ab43040), вирусом кори Priorix, белком нуклеокапсида штамма Schwarz (ab74559) или белком h2 гемагглютинина вируса гриппа А (ab69741) (Abcam, Cambridge, MA). ).Планшеты блокировали 5% молока/0,05% Tween-20 в PBS в течение 1 часа при 37°C, плазму или выделенный IgG разводили в блокирующем буфере и инкубировали еще в течение часа. После промывания 0,05% Tween 20 в PBS IgG3 определяли с помощью HRP против IgG3 человека (Southern Biotech, Бирмингем, Алабама) и после еще одного часа инкубации добавляли субстрат TMB, и реакция останавливалась с помощью 1M H 2 S0 4 . Чтобы нормализовать уровни IgG у отдельных лиц, общие уровни IgG для всех образцов измеряли, как указано выше, за исключением обнаружения с помощью античеловеческого IgG-HRP (Sigma-Aldrich, Сент-Луис, Миссури).

    Истощение IgG3

    шарика для захвата IgG3 были изготовлены, как описано ранее [13]. М-270 Streptavidin Dynabeads (10 мг) (Invitrogen) промывали 3 раза в 500 мкл PBS. После ресуспендирования в 500 мкл PBS гранулы инкубировали с конъюгированным с биотином античеловеческим IgG3 (Southern Biotech, Birmingham, AL) при комнатной температуре с вращением в течение 1 часа. Шарики промывали 3 раза в 0,1% PBS/BSA. Гранулы восстанавливали в концентрации 10 мг/мл и 100 мкл инкубировали с вращением из стороны в сторону в течение 24 часов со 120 мкл (1 мг/мл) поликлонального IgG.Успешное истощение IgG3 из выделений IgG было подтверждено с помощью IgG3 ELISA, а общие концентрации IgG также скорректированы с учетом истощения для ввода в последующие анализы.

    Анализ антителозависимого клеточного фагоцитоза (ADCP)

    Анализ фагоцитоза THP-1 проводили, как описано в [41], с использованием 1 мкМ гранул нейтравидина (Molecular Probes Inc, Юджин, Орегон), покрытых тримером gp140 BG505.SOSIP.664. Образцы поликлональных IgG титровали и тестировали при конечной концентрации 100 мкг/мл. Дополнительно тестировали моноклональные антитела, начиная с 100 мкг/мл с 5-кратными разведениями.Фагоцитарные баллы рассчитывали как среднее геометрическое флуоресцентной интенсивности (MFI) поглощенных гранул, умноженное на процент поглощения гранул. Эта, а также вся другая работа по проточной цитометрии была выполнена на FACSAria II (BD Biosciences, Franklin Lakes, New Jersey). Объединенный IgG от ВИЧ-положительных доноров из программы NIH AIDS Reagent Program (HIVIG) использовался во всех анализах для нормализации вариаций от планшета к планшету, в то время как образцы от 10 человек, инфицированных Clade C, использовались в качестве положительного контроля для всех анализов.Паливизумаб (MedImmune, LLC; Gaithersburg, MD) использовали в качестве отрицательного контроля. Кроме того, F105 и A32 использовали для определения структурной целостности тримера BG505.SOSIP.664.

    Антителозависимая клеточная цитотоксичность (ADCC)

    Активность ADCC

    определяли с помощью анализа ADCC-GranToxiLux (GTL) с использованием клеток, покрытых антигеном, как описано в [43]. В качестве эффекторных клеток использовали целые РВМС от здорового донора. Клетки-мишени CEM-NKR.CCR5 покрывали BG505.SOSIP.664 в концентрации 10 мкг/мл соответственно.Оптимальную концентрацию покрытия определяли путем титрования антигена и измерения остаточных уровней несвязанного CD4 с помощью анти-CD4 FITC (клон SK3, BD Biosciences). Результаты, проанализированные в FlowJo (FlowJo LLC, Ashland, Oregon), выражены в виде % активности гранзима B (GzB), определяемой как процент клеток, положительных на протеолитически активный GzB, от общей жизнеспособной популяции клеток-мишеней. Окончательные результаты выражают после вычитания фона, представленного % активности GzB, наблюдаемой в лунках, содержащих популяции эффекторных клеток и клеток-мишеней в отсутствие IgG.

    Антителозависимое отложение комплемента (ADCD)

    ADCD определяли по отложению компонента комплемента C3b на поверхности клеток CEM-NK R .CCR5, как описано в [10]. Клетки-мишени обрабатывали 10 мкг тримера gp140 BG505.SOSIP.664 в 100 мкл среды R10 (10% FBS 1% Pen/Strep RPMI, Gibco, Gaithersburg, MD) в течение 1 часа при комнатной температуре и инкубировали со 100 мкг/мл препарата IgG. . В качестве источника комплемента использовали ВИЧ-отрицательную плазму в разведении 1:10:0.Добавляли 1% желатин/верональный буфер (Sigma-Aldrich, Сент-Луис, Миссури) и 150 мкл и инкубировали в течение 20 минут при 37°С. Затем клетки промывали в 15 мМ EDTA в PBS и C3b определяли с помощью проточной цитометрии с использованием mAb C3/C3b/iC3b компонента комплемента человека/мыши (Cedarlane, Burlington, Canada). Неимпульсные клетки использовали в качестве фонового контроля, а ВИЧ-отрицательную плазму инактивировали нагреванием при 56°C для удаления комплемента в качестве отрицательного контроля. Оценка ADCD была определена как геометрическая MFI, умноженная на % клеток, положительных в отношении отложения C3b.

    Антителозависимый клеточный трогоцитоз (ADCT)

    Клетки

    CEM-NK R .CCR5 обрабатывали тримером BG505.SOSIP.664 (10 мкг/мл) в течение 75 минут при комнатной температуре [42]. Оптимальные концентрации покрытия определяли, как описано выше. Клетки окрашивали красителем РХ36 (краситель Paul Karl Horan 26) в соответствии с инструкциями производителя (Sigma-Aldrich, Сент-Луис, Миссури) и ресуспендировали в концентрации 2 млн клеток/мл. К клеткам добавляли IgG в конечной концентрации 100 мкг/мл и инкубировали в течение 30 минут при 37°С.Клетки THP-1 окрашивали внутриклеточным CFSE (сукцинимидиловым эфиром карбоксифлуоресцеина) и добавляли в планшет 150 мкл, содержащих 6,7×10 5 клеток/мл, и инкубировали еще в течение часа при 37°C. Затем клетки промывали 15 мМ ЭДТА в PBS. Проточная цитометрия использовалась для различения клеток PKh36+ CFSE+ THP-1 (т.е. неинфицированных моноцитов, получивших фрагменты мембраны от клеток с покрытием) и представлена ​​в виде доли от общего количества клеток THP-1. Дублеты были исключены из анализа путем стробирования синглетов.Клетки были отобраны на окрашенных клетках CEM и THP-1, инкубированных в отсутствие IgG, чтобы гарантировать, что мы не измеряли независимый от антител трогоцитоз. Непокрытые клетки СЕМ, окрашенные PKh36, также инкубировали с клетками THP-1 в присутствии ВИЧ-специфического IgG, чтобы гарантировать, что наблюдаемые ответы были ВИЧ-специфичными.

    Продукция псевдовирусов и сайт-направленный мутагенез

    Псевдовирусные плазмиды, экспрессирующие представляющий интерес Env ВИЧ, котрансфицировали плазмидами, экспрессирующими скелет pSG3DEnv (полученными из Программы исследований и эталонных реагентов NIH AIDS, Division of AIDS, NIAID, NIH) в клетки 293T с использованием PEI-MAX 40,000 (Polysciences) .Культуры инкубировали в течение 48 часов при 37°C, затем фильтровали через 0,45 мкм и замораживали в среде DMEM/20% FBS с получением Env-псевдотипированных вирусов, способных к однократному заражению. Мутантные гены оболочки были созданы с помощью набора QuikChange Lightning Kit (Stratagene), подтверждены секвенированием ДНК и трансфицированы, как указано выше.

    Анализы нейтрализации

    Анализы нейтрализации проводили в клетках TZM-bl, как описано ранее (Montefiori, 2005). Нейтрализация измеряется как уменьшение в относительных световых единицах после однократного цикла инфицирования псевдовирусом в присутствии интересующего образца моноклонального антитела или IgG.Образцы IgG серийно разбавляли 1:3, тогда как bNAb серийно разводили 1:5, и IC 50 рассчитывали как разведение, при котором инфекция снижалась на 50%. Было подтверждено, что вариация в этом анализе менее чем в 3 раза. Все варианты переключения подклассов запускали вслепую и непосредственно на одной и той же пластине, чтобы ограничить внутриэкспериментальные вариации. Нейтрализацию, проведенную в клетках TZM-bl, трансдуцированных Fc-рецептором, проводили точно так же, как указано выше.

    Секвенирование константных областей CAP256 зародышевой линии

    Геномную ДНК экстрагировали из РВМС с использованием набора Qiagen Total Allprep DNA RNA.ДНК определяли количественно и использовали 20 нг для каждой реакции амплификации с полимеразой HF Platinum Taq. Всего для амплификации областей Ch2-3 IgG1-3 использовали 12 праймеров для ПЦР в интронных областях. Ампликоны Ch2 и Ch3-Ch4 секвенировали по Сэнгеру, и присутствие SNP отмечали с помощью кодов нуклеиновых кислот, используемых для обозначения неоднозначных оснований.

    Секвенирование константной области выделенных моноклональных антител

    MAb были выделены из CAP256, как описано ранее [37]. Исходную кДНК отсортированных В-клеток памяти, из которых были выделены антитела 29, 30 и 33, амплифицировали с прямым IGHV3 и обратным константным IgG-праймером.Антитело 29 амплифицировали с праймерами Vh4-leader B и Ch4 rev 2 в течение 50 циклов с использованием ДНК-полимеразы Qiagen HotStarTaq Plus. Затем пять мкл реакции ПЦР первого раунда амплифицировали с праймерами 5’L-Vh4 и Ch4 rev 3 в течение еще 50 циклов. Антитела 30 и 33 амплифицировали с теми же прямыми праймерами, но с обратными праймерами, расположенными в конце Ch2 – Ch2 rev 1 для первого раунда и Ch2 rev 2 для второго.

    Vh4-лидер B—TAAGAGGTGTCCAGTGT [72]

    5’L-Vh4 –AAGGTGTCCAGTGTGARGTGGCAG [73]

    Ch4 rev 2—GGT TGT GCA GAG CCT CAT GCA TCA C

    Ch4 rev 3—CCT CAT GCA TCA CGG AGC ATG AGA AG

    Ch2 rev 1—CTC TTG TCC ACC TTG GTG TTG CTG

    Ch2 rev 2—CTG GGC TTG TGA TTC ACG TTG CAG G

    Клонирование и экспрессия mAb

    Вариабельные области тяжелой и легкой цепей представляющих интерес mAb были клонированы в вектор экспрессии IgG1 и IgG3*01 (получен от Dr Bart Haynes, Университет Дьюка, Дарем, Северная Каролина).Плазмиду подвергали сайт-направленному мутагенезу с получением IgG3*01m. Мутантный шарнир и конструкции IgG3*17 были заказаны в GenScript (Piscataway, NJ). Для экспрессии антител плазмиды, отдельно кодирующие гены тяжелой и легкой цепей, совместно трансфицировали в клетки 293F с помощью PEI-MAX 40000 (Polysciences). Клетки культивировали в течение шести дней в среде 293Freestyle при 37°C, 10% CO2, затем собранные супернатанты фильтровали и очищали с использованием Protein G (Thermoscientific). Все варианты количественно определяли с помощью нанокапли с использованием коэффициентов экстинкции, специфичных для последовательности, определенных с помощью ProtParam (ExPASy) и подтвержденных с помощью ELISA.

    BG505.SOSIP.664 ИФА

    Тример

    Avitagged BG505.SOSIP.664 биотинилировали с использованием BirA-лигазы, как описано в [37]. Биотинилированный тример наносили на планшеты для ELISA со стрептавидином (Thermofisher) в концентрации 4 мкг/мл в PBS и инкубировали в течение 1 часа при комнатной температуре. После промывания PBS планшеты блокировали на 30 минут в 5% молоке/PBS и промывали в PBS. Пятьдесят мкл вариантов CAP256.29 и CAP256.25, а также отрицательные контроли 447-52D и F105 (начиная с 20 мкг/мл) инкубировали в течение 1 часа при комнатной температуре с последующим промыванием PBS.Вторичное антитело, козье анти-человеческое F(ab’)2 HRP, инкубировали в планшете в течение 1 часа при комнатной температуре, планшет трижды промывали PBS и в каждую лунку добавляли 100 мкл ТМВ. Реакцию останавливали 1M H 2 S0 4 и считывали при 450 нм.

    Кинетические измерения

    Поверхностный плазмонный резонанс (SPR) использовали для измерения равновесной аффинности связывания (как описано ранее [45]. Микроспоттер с непрерывным потоком (CFM) (Carterra, Солт-Лейк-Сити, Юта) использовали для печати до 96 отдельных интересующих областей ( ROI) на поверхности одной золотой призмы, функционализированной карбоксиметилдекстрановым субстратом (CMD200M, Xantec Bioanalytics, Дюссельдорф, Германия).Жидкостные пути CFM перед активацией обрабатывали 25 мМ ацетатом натрия, pH 5,0 + 0,01% Tween 20. Субстрат каждой ROI активировали в течение 5–7 мин 100 мкл 1,2 мМ N-гидроксисульфосукцинимида (NHS) (Pierce) и 0,3 мМ 1-этил-3-[3-диметиламинопропил]карбодиимида-HCl (EDC) (Pierce) в 10 мМ 2-(N-морфолино)этансульфоновой кислоты (MES) pH 5,0 при потоке со скоростью 45 мкл/мин. Антитела готовили в концентрации 200 нМ в 25 мМ ацетате натрия, рН 5,0, и печатали на активированном субстрате. Считывающее устройство на основе изображений (MX96, IBIS Technologies, Enschede, NL) заливали 25 мМ ацетатом натрия, pH 5.0 + 0,01% Tween 20 и призму загружали и гасили 120 мкл 1 М этаноламина (Sigma Aldrich) перед заливкой, кондиционированием и введением аналита. FcγR разбавляли в рабочем буфере (PBS + + + 0,05% Tween 20) и вводили в виде 8-частной серии 3-кратных серийных разведений, обычно начиная с 10–50 мкМ и состоящей из следующих этапов: исходный уровень 0,5 мин, 5 мин ассоциация, 5 мин диссоциация, 0,5 мин исходный уровень. За каждой серией инъекций FcγR следовали дублирующие холостые инъекции для обеспечения полной диссоциации аналита.Сигнал ROI был дважды связан с использованием сигнала от пустых инъекций и сигнала от несвязанных промежуточных точек для учета неспецифического связывания. Генетически агликозилированный IgG1 человека (N297Q) и вариант LALA использовали в качестве отрицательного контроля, а IgG от ВИЧ-положительных индивидуумов — в качестве положительного контроля. Эксперименты повторяли 2-3 раза с различной плотностью конъюгации и условиями рН печати. Представлены данные двух отдельных экспериментов с несколькими пятнами отпечатков для каждого образца IgG.

    Количественный анализ и статистический анализ

    Анализ всех экспериментов на основе проточной цитометрии был выполнен с использованием FlowJo (FlowJo LLC, Ashland, OR). Данные SPR обрабатывали в Scrubber 2 (Biologic Software Ltd, Canberra, AU) посредством кинетического анализа с применением глобального анализа для определения равновесной константы диссоциации K D . Результаты секвенирования анализировали с помощью Sequencher 5.4.1. Z-показатели полифункциональности Fc рассчитывали путем стандартизации каждой эффекторной функции Fc (где среднее значение функции вычитается из индивидуального значения и делится на стандартное отклонение среднего значения) с последующим сложением всех Z-показателей для каждой функции на индивидуума.Весь статистический анализ был выполнен в GraphPad Prism 6 (GraphPad Software, Inc, La Jolla, CA). Все сравнения между группами были выполнены с помощью непараметрических тестов, включая U-критерий Манна-Уитни (для двух несовпадающих групп), знаковый ранговый критерий Вилкоксона для совпадающих пар (для двух совпадающих групп) и критерий Крускала-Уоллиса с поправкой Тьюки для множественных сравнений или критерий Фридмана. для согласованных групп с поправкой Данна. Все доверительные интервалы были установлены на уровне 95%. Все представленные корреляции являются непараметрическими корреляциями Спирмена, и весь статистический анализ был выполнен с помощью двустороннего тестирования с использованием альфа-уровня, равного 0.05.

    Вспомогательная информация

    S1 Рис. Истощение IgG3 приводит к снижению нейтрализации IgG плазмы CAP256.

    В таблице указана IC 50 (мкг/мл) IgG плазмы с недеплетированным и IgG3-истощенным CAP256 через 36 месяцев p.i. против 8 вирусов с мощной нейтрализацией, обозначенной красным, и нокаутом (KO) нейтрализации, обозначенным синим цветом. Значительное кратное снижение нейтрализации показано жирным шрифтом с репрезентативными кривыми нейтрализации (ингибирования) для недеплетированного (черный) и обедненного IgG3 (красный) IgG CAP256 против всех протестированных вирусов.Эксперименты репрезентативны для трех отдельных повторов.

    https://doi.org/10.1371/journal.ppat.1008064.s001

    (PDF)

    S2 Рис.

    IGHG3 Последовательности аллелей из ДНК зародышевой линии и выделенных антител из донора CAP256.

    Последовательность Ch2-Ch4 зародышевой линии IGHG3 от донора CAP256 показана вместе с константными областями выделенных антител и двумя наиболее близкими аллелями IGHG3 . Аминокислоты пронумерованы по системе Eu с указанием SNP, уникальных для соответствующих аллелей.Цвета соответствуют IGHG3*01 (синий), IGHG3*01m (красный) и IGHG3*17 (зеленый).

    https://doi.org/10.1371/journal.ppat.1008064.s002

    (PDF)

    S3 Рис. Роман

    IGHG3 Аллель идентифицирован у донора CAP256.

    Все 29 аллелей константной области IGHG3 в базе данных ImMunoGeneTics (IMGT) показаны вместе с новым аллелем IGHG3*01m , идентифицированным у донора CAP256, как показано красным. Обозначены области Ch2, шарнир, Ch3 и Ch4.SNP, используемые для определения аллотипов IgG3, выделены оранжевым цветом, потенциальные сайты N-связанного гликозилирования показаны серым цветом, а положения указаны с использованием нумерации Eu.

    https://doi.org/10.1371/journal.ppat.1008064.s003

    (PDF)

    S4 Рис. Эффекторные функции Fc вариантов IgG1 и IgG3 CAP256.

    Титрование вариантов CAP256.29 и CAP256.25 IgG1 (черный), IgG3*01 (синий), IgG3*01m (красный) и IgG3*17 (зеленый) и паливизумаба (отрицательный контроль) для ADCP, ADCT, ADCC и Активность ADCD против BG505.Показан тример SOSIP.664. Представлены среднее значение и стандартное отклонение 3 независимых экспериментов.

    https://doi.org/10.1371/journal.ppat.1008064.s004

    (PDF)

    S5 Рис. Репрезентативные кривые отклика SPR и стехиометрическая модель кинетики 1:1.

    (A) Варианты константной области mAb CAP256.25 были непосредственно напечатаны на SPR-чипе и проанализированы на связывание с FcγRIIa-R131. Необработанные кривые (черные) и кинетические подборки (красные) показаны для IgG1, IgG3*01m, IgG3*01 и IgG3*17, агликозилированного варианта Fc, продуцируемого точечной мутацией N297Q, и сконструированного Fc мутанта LALA. (B) Стандартные отклонения констант равновесия диссоциации (K D в мкМ), определенные с помощью SPR для всех вариантов связывания CAP256.29 и CAP256.25 с 5 различными рецепторами Fc. Поликлональный IgG CAP256 был положительным контролем, а VRC01 N297Q был отрицательным контролем. Данные являются репрезентативными для 2 независимых экспериментов.

    https://doi.org/10.1371/journal.ppat.1008064.s005

    (PDF)

    S6 Рис. CAP256.25 IgG3*17 K392N значительно увеличивает ADCC и связывание с рецепторами FcγRIIIa.

    Положение Lys-392 CAP256.25 IgG3*17 был мутирован в Arg-392, и оба были протестированы на связывание (A) ADCP, ADCT, ADCD и ADCC, а также (B) с помощью SPR с FcγRIIa (h231 /R131), FcγRIIb и FcγRIIIa (F158/V158). Значимость между диким типом и мутантом рассчитывали с помощью знакового рангового критерия Уилкоксона, где *

    https://doi.org/10.1371/journal.ppat.1008064.s006

    (PDF)

    Благодарности

    Мы хотели бы поблагодарить участников группы CAPRISA и сотрудников лаборатории и клиник CAPRISA. Мы благодарны доктору Найджелу Макоа за производство белка BG505.SOSIP.664 и Дону Мвудуду за создание мутантов вируса.

    Каталожные номера

    1. 1. Уокер Л.М., Бертон Д.Р. Пассивная иммунотерапия вирусных инфекций: в бой вступают «суперантитела».Нат Рев Иммунол. 2018;18(5):297–308. пмид:29379211
    2. 2. Бурназос С., Кляйн Ф., Пицш Дж., Симан М.С., Нуссенцвейг М.С., Раветч Дж.В. Широко нейтрализующие антитела против ВИЧ-1 требуют эффекторных функций Fc для активности in vivo. Клетка. 2014;158(6):1243–53. пмид:25215485
    3. 3. Халпер-Стромберг А., Лу К.Л., Кляйн Ф., Хорвиц Дж.А., Бурназос С., Ногейра Л. и др. Широко нейтрализующие антитела и вирусные индукторы уменьшают отскок от латентных резервуаров ВИЧ-1 у гуманизированных мышей.Клетка. 2014;158(5):989–99. пмид:25131989
    4. 4. Hessell AJ, Hangartner L, Hunter M, Havenith CE, Beurskens FJ, Bakker JM, et al. Рецептор Fc, но не связывание комплемента, важен для защиты антител от ВИЧ. Природа. 2007;449(7158):101–4. пмид:17805298
    5. 5. Lu CL, Murakowski DK, Bournazos S, Schoofs T, Sarkar D, Halper-Stromberg A, et al. Повышенный клиренс ВИЧ-1-инфицированных клеток за счет нейтрализующих антител против ВИЧ-1 in vivo. Наука.2016;352(6288):1001–4. пмид:27199430
    6. 6. Hessell AJ, Shapiro MB, Powell R, Malherbe DC, McBurney SP, Pandey S, et al. Уменьшение клеточно-ассоциированной ДНК и улучшение вирусного контроля у макак после пассивного переноса одного моноклонального антитела против V2 и повторных заражений SHIV. Дж Вирол. 2018.
    7. 7. Horwitz JA, Bar-On Y, Lu CL, Fera D, Lockhart AAK, Lorenzi JCC, et al. Ненейтрализующие антитела изменяют течение инфекции ВИЧ-1 in vivo. Клетка.2017;170(4):637–48 e10. пмид:28757252
    8. 8. Moog C, Dereuddre-Bosquet N, Teillaud JL, Biedma ME, Holl V, Van Ham G, et al. Защитный эффект вагинального применения нейтрализующих и ненейтрализующих ингибирующих антител против вагинального заражения SHIV у макак. Иммунол слизистых оболочек. 2014;7(1):46–56. пмид:235

    9. 9. Сантра С., Томарас Г.Д., Уорриер Р., Найсли Н.И., Ляо Х.С., Поллара Дж. и др. Человеческие ненейтрализующие моноклональные антитела к оболочке ВИЧ-1 ограничивают количество вирусов-основателей во время инфекции слизистых оболочек SHIV у макак-резусов.PLoS Патог. 2015;11(8):e1005042. пмид:26237403
    10. 10. Акерман М.Е., Михайлова А., Браун Е.П., Доуэлл К.Г., Уокер Б.Д., Бейли-Келлог С. и соавт. Реакция полифункциональных ВИЧ-специфических антител связана со спонтанным контролем над ВИЧ. PLoS Патог. 2016;12(1):e1005315. пмид:26745376
    11. 11. Фортал Д.Н., Ландуччи Г., Даар Э.С. Антитела от пациентов с острой инфекцией, вызванной вирусом иммунодефицита человека (ВИЧ), ингибируют первичные штаммы ВИЧ типа 1 в присутствии эффекторных клеток естественных киллеров.Дж Вирол. 2001;75(15):6953–61. пмид:11435575
    12. 12. Lambotte O, Ferrari G, Moog C, Yates NL, Liao HX, Parks RJ и др. Реакции гетерогенных нейтрализующих антител и антителозависимой клеточной цитотоксичности у элитных контролеров ВИЧ-1. СПИД. 2009;23(8):897–906. пмид:19414990
    13. 13. Чанг А.В., Гебремайкл М., Робинсон Х., Браун Э., Чой И., Лейн С. и др. Полифункциональные профили Fc-эффектора, опосредованные отбором подкласса IgG, отличают вакцины RV144 и VAX003.Sci Transl Med. 2014;6(228):228ra38. пмид:24648341
    14. 14. Yates NL, Liao HX, Fong Y, deCamp A, Vandergrift NA, Williams WT, et al. Индуцированный вакциной Env V1-V2 IgG3 коррелирует с более низким риском инфицирования ВИЧ-1 и снижается вскоре после вакцинации. Sci Transl Med. 2014;6(228):228ra39. пмид:24648342
    15. 15. Перес Л.Г., Мартинес Д.Р., деКэмп А.С., Пинтер А., Берман П.В., Фрэнсис Д. и другие. V1V2-специфический активирующий комплемент сывороточный IgG как коррелят снижения риска инфицирования ВИЧ-1 при RV144.ПЛОС Один. 2017;12(7):e0180720. пмид:28678869
    16. 16. Поллара Дж., Бонсиньори М., Муди М.А., Лю П., Алам С.М., Хван К.К. и др. Индуцированные вакциной против ВИЧ-1 Env-специфические антитела C1 и V2 усиливают противовирусную активность. Дж Вирол. 2014;88(14):7715–26. пмид:24807721
    17. 17. Брюнс П., Яннасколи Б., Ингленд П., Манкарди Д.А., Фернандес Н., Джорье С. и др. Специфичность и аффинность рецепторов Fcgamma человека и их полиморфных вариантов для подклассов IgG человека.Кровь. 2009;113(16):3716–25. пмид:192
    18. 18. Джанда А., Боуэн А., Гринспен Н.С., Касадевалл А. Влияние постоянной области Ig на структуру и функцию вариабельной области. Фронт микробиол. 2016;7:22. пмид:26870003
    19. 19. Парсонс М.С., Чанг А.В., Кент С.Дж. Важность Fc-опосредованных функций широко нейтрализующих антител против ВИЧ-1. Ретровирусология. 2018;15(1):58. пмид:30134945
    20. 20. Рекке А., Конитцер С., Лемке С., Фрейтаг М., Зоммер Н.М., Абдельхади М. и соавт.Вариант p.Arg435His IgG3 с высоким сродством к FcRn связан с восприимчивостью к обыкновенной пузырчатке — анализ четырех различных этнических когорт. Фронт Иммунол. 2018;9:1788. пмид:30116249
    21. 21. Окселиус В.А., Панди Дж.П. Гены константной тяжелой G-цепи (IGHG) (Fcgamma) (GM) иммуноглобулина человека, определяющие врожденные варианты молекул IgG и В-клеток, оказывают влияние на заболевание и терапию. Клин Иммунол. 2013;149(3):475–86. пмид:24239836
    22. 22. Дамеланг Т., Роджерсон С.Дж., Кент С.Дж., Чанг А.В.Роль IgG3 в инфекционных заболеваниях. Тренды Иммунол. 2019;40(3):197–211. пмид:30745265
    23. 23. Йейтс Н.Л., Лукас Дж.Т., Нолен Т.Л., Вандергрифт Н.А., Содерберг К.А., Ситон К.Е. и соавт. Множественные ответы IgG3, специфичные для ВИЧ-1, снижаются во время острого ВИЧ-1: последствия для выявления случаев ВИЧ-инфекции. СПИД. 2011;25(17):2089–97. пмид:21832938
    24. 24. Дугаст А.С., Стамататос Л., Тонелли А., Сускович Т.Дж., Лихт А.Ф., Микелл И. и соавт. Независимая эволюция Fc- и Fab-опосредованной активности ВИЧ-1-специфических противовирусных антител после острой инфекции.Евр Дж Иммунол. 2014;44(10):2925–37. пмид:25043633
    25. 25. Дугаст А.С., Тонелли А., Бергер К.Т., Акерман М.Е., Шарангелла Г., Лю К. и соавт. Снижение экспрессии рецептора Fc на клетках врожденного иммунитета связано с нарушением опосредованной антителами клеточной фагоцитарной активности у хронически инфицированных ВИЧ-1 лиц. Вирусология. 2011;415(2):160–7. пмид:21565376
    26. 26. Чанг А.В., Кумар М.П., ​​Арнольд К.Б., Ю.В.Х., Шон М.К., Данфи Л.Дж. и др. Анализ гуморального иммунитета против ВИЧ, индуцированного поликлональной вакциной, с использованием системной серологии.Клетка. 2015;163(4):988–98. пмид:26544943
    27. 27. Lai JI, Licht AF, Dugast AS, Suscovich T, Choi I, Bailey-Kellogg C, et al. Различные подклассы антител и профили специфичности, но не защитные аллели HLA-B, связаны с вариабельной эффекторной функцией антител среди контролеров ВИЧ-1. Дж Вирол. 2014;88(5):2799–809. пмид:24352471
    28. 28. Садананд С., Дас Дж., Чанг А.В., Шон М.К., Лейн С., Сускович Т.Дж. и соавт. Временная изменчивость ВИЧ-специфических антител подкласса IgG во время острой инфекции отличает спонтанных контролеров от хронических прогрессоров.СПИД. 2018;32(4):443–50. пмид:29239894
    29. 29. Кардава Л., Сон Х., Юн С., Остин Дж. В., Ван В., Бакнер С. М. и др. IgG3 регулирует тканеподобные В-клетки памяти у ВИЧ-инфицированных. Нат Иммунол. 2018;19(9):1001–12. пмид:30104633
    30. 30. Лефранк М.П., ​​Лефранк Г. Аллотипы Gm, Km и Am человека и их молекулярная характеристика: замечательная демонстрация полиморфизма. Методы Мол Биол. 2012; 882: 635–80. пмид:22665258
    31. 31. Stapleton NM, Andersen JT, Stemerding AM, Bjarnarson SP, Verheul RC, Gerritsen J, et al.Конкуренция за FcRn-опосредованный транспорт приводит к короткому периоду полужизни человеческого IgG3 и предлагает терапевтический потенциал. Нац коммун. 2011;2:599. пмид:22186895
    32. 32. Лю Х, Мэй К. Структуры дисульфидных связей молекул IgG: структурные вариации, химические модификации и возможное влияние на стабильность и биологическую функцию. МАб. 2012;4(1):17–23. пмид:22327427
    33. 33. Риспенс Т., Дэвис А.М., Оойеваар-де Хеер П., Абсалах С., Бенде О., Саттон Б.Дж. и др. Динамика взаимодействий между тяжелыми цепями в подклассах человеческого иммуноглобулина G (IgG), изученная с помощью кинетического обмена плечами Fab.Дж. Биол. Хим. 2014;289(9):6098–109. пмид:24425871
    34. 34. Ру К.Х., Стрелец Л., Михаэльсен Т.Е. Гибкость подклассов IgG человека. Дж Иммунол. 1997;159(7):3372–82. пмид:9317136
    35. 35. Мхизе Н.Н., Дургия Р., Эшли В., Арчари Д., Гарретт Н.Дж., Карим К.А. и др. Антитела широкого спектра нейтрализующей специфичности обнаружены в половых путях ВИЧ-1 инфицированных женщин. СПИД. 2016;30(7):1005–14. пмид:26836790
    36. 36. Дориа-Роуз Н.А., Шрамм К.А., Горман Дж., Мур П.Л., Бхиман Дж.Н., ДеКоски Б.Дж. и соавт.Путь развития мощных V1V2-направленных нейтрализующих антител к ВИЧ. Природа. 2014;509(7498):55–62. пмид:245
    37. 37. Дориа-Роуз Н.А., Бхиман Дж.Н., Роарк Р.С., Шрамм К.А., Горман Дж., Чуанг Г.Ю. и др. Новый член направленной на V1V2 линии передачи CAP256-VRC26, демонстрирующий увеличенную широту и исключительную эффективность. Дж Вирол. 2015;90(1):76–91. пмид:26468542
    38. 38. Браун Э.П., Лихт А.Ф., Дугаст А.С., Чой И., Бейли-Келлог С., Альтер Г. и соавт. Высокопроизводительный мультиплексный подкласс IgG антиген-специфических антител из клинических образцов.Дж Иммунол Методы. 2012;386(1–2):117–23. пмид:23023091
    39. 39. ван Логгеренберг Ф., Млисана К., Уильямсон С., Олд С.К., Моррис Л., Грей К.М. и др. Создание когорты с высоким риском заражения ВИЧ в Южной Африке: проблемы и опыт исследования острой инфекции CAPRISA 002. ПЛОС Один. 2008;3(4):e1954. пмид:18414658
    40. 40. Абдул Карим К., Абдул Карим С.С., Фролих Дж.А., Гроблер А.С., Бакстер С., Мансур Л.Е. и др. Эффективность и безопасность геля тенофовира, антиретровирусного микробицида, для профилактики ВИЧ-инфекции у женщин.Наука. 2010;329(5996):1168–74. пмид:20643915
    41. 41. Акерман М.Е., Молдт Б., Вятт Р.Т., Дугаст А.С., МакЭндрю Э., Цукас С. и соавт. Надежный высокопроизводительный анализ для определения фагоцитарной активности клинических образцов антител. Дж Иммунол Методы. 2011;366(1–2):8–19. пмид:21192942
    42. 42. Ричардсон С.И., Кроутер С., Мхизе Н.Н., Моррис Л. Измерение способности ВИЧ-специфических антител опосредовать трогоцитоз. Дж Иммунол Методы. 2018.
    43. 43. Поллара Дж., Харт Л., Брюэр Ф., Пикерал Дж., Паккард Б.З., Хокси Дж.А. и др.Высокопроизводительный количественный анализ ответов антител, опосредующих ADCC, специфичных для ВИЧ-1 и SIV. Цитометрия А. 2011;79(8):603–12. пмид:21735545
    44. 44. Tay MZ, Liu P, Williams LD, McRaven MD, Sawant S, Gurley TC, et al. Опосредованная антителами интернализация инфекционных вирионов ВИЧ-1 различается в зависимости от изотипов и подклассов антител. PLoS Патог. 2016;12(8):e1005817. пмид:27579713
    45. 45. Бош А.В., Майлз А.Р., Чан Ю.Н., Осей-Овусу Н.Ю., Акерман М.Э. Перекрестная реактивность варианта Fc IgG между FcgammaR человека и макака-резуса.МАб. 2017;9(3):455–65. пмид:28055295
    46. 46. Musich T, Li L, Liu L, Zolla-Pazner S, Robert-Guroff M, Gorny MK. Моноклональные антитела, специфичные для V2, V3, сайта связывания CD4 и gp41 опосредованного фагоцитоза ВИЧ-1 дозозависимым образом. Дж Вирол. 2017;91(8).
    47. 47. Мазор Ю., Ян С., Боррок М.Дж., Айрис Дж., Ахерн К., Ву Х и др. Усиление иммунных эффекторных функций путем модулирования внутренней аффинности IgG к целевому антигену. ПЛОС Один. 2016;11(6):e0157788.пмид:27322177
    48. 48. Бурназос С., Раветч СП. Диверсификация эффекторных функций IgG. Инт Иммунол. 2017;29(7):303–10. пмид:28472280
    49. 49. Нацумэ А., Ин М., Такамура Х., Накагава Т., Симидзу Ю., Китадзима К. и др. Сконструированы антитела смешанного изотипа IgG1/IgG3 с повышенной цитотоксической активностью. Рак рез. 2008;68(10):3863–72. пмид:18483271
    50. 50. Перес Л.Г., Коста М.Р., Тодд К.А., Хейнс Б.Ф., Монтефиори Д.К. Использование Fc-рецепторов иммуноглобулина G вирусом иммунодефицита человека типа 1: особая роль антител против проксимальной к мембране внешней области gp41.Дж Вирол. 2009;83(15):7397–410. пмид:19458010
    51. 51. Джунтини С., Гранофф Д.М., Бернинк П.Т., Иле О., Братли Д., Михаэльсен Т.Е. Мутанты IgG1, IgG3 и IgG3 человека с усеченным шарниром демонстрируют различные защитные способности против менингококков в зависимости от антигена-мишени и специфичности эпитопа. Клин Вакцина Иммунол. 2016;23(8):698–706. пмид:27307451
    52. 52. Шарф О., Голдинг Х., Кинг Л.Р., Эллер Н., Фрейзер Д., Голдинг Б. и др. Иммуноглобулин G3 из иммуноглобулина поликлонального вируса иммунодефицита человека (ВИЧ) более эффективен, чем другие подклассы, в нейтрализации ВИЧ типа 1.Дж Вирол. 2001;75(14):6558–65. пмид:11413323
    53. 53. Barouch DH, Alter G, Broge T, Linde C, Ackerman ME, Brown EP, et al. Защитная эффективность аденовирусных/белковых вакцин против заражения SIV у макак-резусов. Наука. 2015;349(6245):320–4. пмид:26138104
    54. 54. Sips M, Krykbaeva M, Diefenbach TJ, Ghebremichael M, Bowman BA, Dugast AS, et al. Fc-рецептор-опосредованный фагоцитоз в тканях как мощный механизм профилактических и терапевтических стратегий вакцинации против ВИЧ.Иммунол слизистых оболочек. 2016;9(6):1584–95. пмид: 26883728
    55. 55. Ричардсон С.И., Чанг А.В., Натараджан Х., Мабвакуре Б., Мхизе Н.Н., Гарретт Н. и соавт. Эффекторная функция ВИЧ-специфического Fc на ранних стадиях инфекции предсказывает развитие широко нейтрализующих антител. PLoS Патог. 2018;14(4):e1006987. пмид:29630668
    56. 56. Редпат С., Михаэльсен Т.Е., Сэндли И., Кларк М.Р. Влияние длины шарнирной области на связывание IgG человека с Fcgamma-рецепторами человека. Хум Иммунол.1998;59(11):720–7. пмид:9796740
    57. 57. Патель К.Р., Робертс Дж.Т., Барб А.В. Множественные переменные при воздействии на клеточную поверхность лейкоцитов гамма-рецептор-зависимых механизмов Fc. Фронт Иммунол. 2019;10:223. пмид:30837990
    58. 58. Cavacini LA, Emes CL, Power J, Desharnais FD, Duval M, Montefiori D, et al. Влияние константных областей тяжелой цепи на связывание антигена и нейтрализацию ВИЧ-1 человеческим моноклональным антителом. Дж Иммунол. 1995;155(7):3638–44. пмид:7561063
    59. 59.Миранда Л.Р., Дюваль М., Доэрти Х., Симэн М.С., Познер М.Р., Кавачини Л.А. Нейтрализующие свойства ВИЧ-специфического антитела заметно изменяются в результате гликозилирования вне антигенсвязывающего домена. Дж Иммунол. 2007;178(11):7132–8. пмид:17513762
    60. 60. Astronomo RD, Santra S, Ballweber-Fleming L, Westerberg KG, Mach L, Hensley-McBain T, et al. Нейтрализация имеет приоритет над функциями, связанными с изотипами IgG или IgA, в защите слизистых оболочек, опосредованной антителами к ВИЧ-1.ЭБиоМедицина. 2016;14:97–111. пмид:27919754
    61. 61. Tudor D, Yu H, Maupetit J, Drillet AS, Bouceba T, Schwartz-Cornil I, et al. Изотип модулирует эпитопную специфичность, аффинность и противовирусную активность человеческого широко нейтрализующего антитела 2F5 против ВИЧ-1. Proc Natl Acad Sci U S A. 2012;109(31):12680–5. пмид:22723360
    62. 62. Cheeseman HM, Olejniczak NJ, Rogers PM, Evans AB, King DF, Ziprin P, et al. Широко нейтрализующие антитела демонстрируют потенциал для предотвращения заражения ВИЧ-1 слизистой ткани лучше, чем ненейтрализующие антитела.Дж Вирол. 2017; 91(1).
    63. 63. Молинос-Альберт Л.М., Клотет Б., Бланко Дж., Каррильо Дж. Иммунологические взгляды на проксимальную внешнюю область мембраны: главная цель вакцины против вируса иммунодефицита человека типа 1. Фронт Иммунол. 2017;8:1154. пмид:28970835
    64. 64. Сандерс Р.В., Деркинг Р., Купо А., Жюльен Дж.П., Ясмин А., де Вал Н. и др. Расщепленный растворимый тример Env ВИЧ-1 нового поколения, BG505 SOSIP.664 gp140, экспрессирует множественные эпитопы для широко нейтрализующих, но не ненейтрализующих антител.PLoS Патог. 2013;9(9):e1003618. пмид:24068931
    65. 65. Джулг Б., Тарталья Л.Дж., Кил Б.Ф., Ваг К., Пегу А., Сок Д. и др. Широко нейтрализующие антитела, нацеленные на вершину V2 оболочки ВИЧ-1, обеспечивают защиту от заражения кладой C SHIV. Sci Transl Med. 2017;9(406).
    66. 66. Бурназос С., Газумян А., Симэн М.С., Нуссенцвейг М.С., Раветч Дж.В. Биспецифические антитела к ВИЧ-1 с увеличенным спектром действия и эффективностью. Клетка. 2016;165(7):1609–20. пмид:27315478
    67. 67.!!! НЕПРАВИЛЬНАЯ ЦИТАТА!!! [50].
    68. 68. Galimidi RP, Klein JS, Politzer MS, Bai S, Seaman MS, Nussenzweig MC, et al. Сшивка внутри спайка преодолевает уклонение антител от ВИЧ-1. Клетка. 2015;160(3):433–46. пмид:25635457
    69. 69. Краточвил С., Маккей П.Ф., Чанг А.В., Кент С.Дж., Гилмор Дж., Шатток Р.Дж. Аллотип иммуноглобулина G1 влияет на распределение подклассов антител в ответ на вакцинацию против ВИЧ gp140. Фронт Иммунол. 2017; 8:1883. пмид:29326728
    70. 70.Ричардсон С.И., Мур П.Л. Реакция антител у ВИЧ-1-инфицированных доноров. Curr Opin ВИЧ СПИД. 2019;14(4):233–9. пмид:31033730
    71. 71. Грей Э.С., Муди М.А., Вибмер К.К., Чен Х, Маршалл Д., Амос Дж. и др. Выделение моноклонального антитела, которое нацелено на спираль альфа-2 gp120 и представляет собой начальный ответ аутологичных нейтрализующих антител у человека, инфицированного ВИЧ-1 подтипа C. Дж Вирол. 2011;85(15):7719–29. пмид:21613396
    72. 72. Шейд Дж. Ф., Муке Х., Уберхайде Б., Дискин Р., Кляйн Ф., Оливейра Т.Ю. и др.Последовательность и структурная конвергенция широких и мощных антител к ВИЧ, которые имитируют связывание CD4. Наука. 2011;333(6049):1633–7. пмид:21764753
    73. 73. Tiller T, Meffre E, Yurasov S, Tsuiji M, Nussenzweig MC, Wardemann H. Эффективное получение моноклональных антител из одиночных B-клеток человека с помощью одноклеточной RT-PCR и клонирования вектора экспрессии. Дж Иммунол Методы. 2008;329(1–2):112–24. пмид:17996249

    границ | Оценка эффективности и продолжительности иммунитета, вызванного поливалентной ящурной вакциной для использования в Южной Африке

    Введение

    Ящур (ящур) — высококонтагиозная и экономически важная болезнь парнокопытных животных (1).Болезнь вызывается вирусом ящура (FMDV), Aphthovirus семейства Picornaviridae (2), и характеризуется лихорадкой до 42°C на виремических стадиях инфекции и поражением ротовой полости, особенно на языке, деснах и копытах (3, 4). Вирус встречается в семи антигенно и генетически различных серотипах, а именно, A, C, O, Asia-1 и южно-африканских территориях (SAT) 1, 2 и 3 (5, 6), характеризующихся отсутствием перекрестной защиты между и внутри серотипов (7).Все три серотипа SAT являются эндемичными для популяций африканских буйволов в большинстве африканских стран, включая регион Сообщества по вопросам развития юга Африки (SADC), и, следовательно, представляют постоянную угрозу заражения стад скота на стыках диких животных и животных (8, 9).

    Из-за глобальных правил ящура многие части Африки, Азии и Ближнего Востока, эндемично пораженные этим заболеванием, сталкиваются с экономическими барьерами, такими как невозможность торговли скотом и продуктами животноводства (10).Поскольку большинство развитых стран свободны от ящура, экономические последствия ящура в основном ощущаются в развивающихся странах (11). Вакцинация скота является неотъемлемым компонентом борьбы с ящуром во всем мире, и каждый год в кампаниях по контролю или ликвидации болезни используются миллиарды доз вакцины (12–14). Чтобы обеспечить доступ к рынкам скота и продуктов животноводства, некоторые страны, такие как Южная Африка (ЮАР) и соседние страны в рамках САДК, создали зоны, свободные от ящура, без вакцинации, в которых разрешена и практикуется региональная и международная торговля скотом и продуктами животноводства (15, 16). ).Для поддержания этого статуса свободы от ящура на территориях, прилегающих к эндемически зараженным зонам, строго практикуются тщательная профилактическая вакцинация скота и строгие санитарно-гигиенические меры в зоопарках (6).

    Методы борьбы с ящуром в разных странах различаются в зависимости от статуса страны по ящуру и имеющихся ресурсов (16). В 1980-х годах эффективные вакцины успешно применялись для искоренения ящура в континентальной Европе (17). Однако ликвидация с помощью вакцинации в большинстве африканских стран невозможна из-за присутствия популяций африканских буйволов в охотничьих угодьях, которые являются носителями серотипов SAT (10).Таким образом, рутинная профилактическая вакцинация скота в зонах повышенного риска (защитных зонах) в сочетании с другими стратегиями, такими как ограничение передвижения животных и наблюдение, необходимы для контроля болезней и поддержания зон, свободных от ящура, без вакцинации (6, 15, 16). Успешные схемы вакцинации, будь то кампании по ликвидации, уничтожение циркулирующего вируса во время вспышек, профилактика, поддержание свободы от болезни или восстановление свободы от болезни, требуют использования высококачественных и эффективных вакцин (18).

    Большинство вакцин от ящура представляют собой препараты одного или нескольких химически инактивированных вирусов, полученных из клеточных культур и смешанных с подходящими адъювантами и вспомогательными веществами (19). Поствакцинальная защита от инфекции впоследствии достигается за счет индукции высоких уровней антител (20). Из-за отсутствия длительного защитного иммунитета после вакцинации вакцинами серотипов SAT в SADC практикуются схемы повторной (бустерной) вакцинации для поддержания высокого уровня титров антител после вакцинации (21).

    Такие факторы, как активность, антигенное родство вакцинных штаммов и циркулирующих полевых штаммов, а также структурная целостность вируса; Частица 146 S может влиять на способность вакцины индуцировать защитный иммунитет (22). Эффективность вакцины представляет собой меру количества защитных доз (PD) в вакцине, оцениваемую по устойчивости к инфекционному вирусному заражению групп животных, иммунизированных различными количествами вакцины. Одна 50% защитная доза (PD50) представляет собой дозу вакцины, которая защитит 50% вакцинированных животных от клинического ящура (19).Также решающую роль в эффективности вакцины играет антигенная полезная нагрузка (19, 23) и тип адъюванта, используемого для приготовления вакцины, что может влиять на продолжительность иммунитета (24, 25). Обычно используемые адъюванты для приготовления вакцин против ящура представляют собой гидроксид алюминия вместе с сапонином (26, 27) и адъюванты в виде масляной эмульсии, такие как адъювант Montanide™ ISA 206 VG [двойная масляная эмульсия (DOE)] (25). Было показано, что использование вакцин против ящура Montanide™ с адъювантом DOE у крупного рогатого скота вызывает более высокие и продолжительные титры антител, хотя на их эффективность может влиять рецептура препарата (27–29).

    В ЮАР стада крупного рогатого скота, окружающие охотничий заказник Национального парка Крюгера (KNP), в настоящее время вакцинируются до четырех раз в год с использованием импортных коммерческих вакцин, приготовленных из полученных из клеточных культур химически инактивированных антигенов SAT 1, 2 и 3, с адъювантом с алюминием. гидроксид и сапонин (30). Однако есть свидетельства того, что эти вакцины плохо действуют, о чем свидетельствуют повторяющиеся и постоянные вспышки среди вакцинированного населения даже после увеличения частоты прививок (31). Низкие эксплуатационные характеристики используемых партий вакцины могут быть вызваны несколькими факторами, включая распад вирусной частицы 146 S во время приготовления антигена для состава вакцины из-за лабильной природы серотипов SAT (1, 9).Однако из-за того, что результаты проверки качества посредством контроля качества (КК) указаны в сертификате анализа использованных серий вакцин, низкая эффективность вакцин в полевых условиях, скорее всего, была результатом антигенной изменчивости между вакцинными штаммами и циркулирующими штаммами. полевых штаммов в СА, так как штаммы вакцины, а также ее активность не были раскрыты.

    В этом исследовании крупный рогатый скот нгуни использовали для оценки эффективности пяти моновалентных вакцин, приготовленных с использованием вирусных штаммов, представляющих три местных серотипа SAT, циркулирующих в зоне контроля ящура с помощью SA и адъюванта Montanide™ ISA 206 VG.После этого исследовали продолжительность иммунитета у крупного рогатого скота, вызванного пятью штаммами поливалентной вакцины, после введения первичной вакцинации с ревакцинациями и без них.

    Материалы и методы

    Приготовление вакцин и контрольных вирусов

    Штаммы-кандидаты на вакцины были предоставлены внутренней справочной лабораторией Международного бюро по эпизоотиям (МЭБ) по ящуру, и они представляли собой набор из пяти изолятов вируса, представляющих три серотипа SAT, которые ранее вызывали вспышки в зоне контроля ящура в ЮАР.Кроме того, было показано, что пять вирусных штаммов, а именно SAT 1: SAR 9/81 и BOT 1/06, SAT 2: KNP1/10 и SAR 3/04 и SAT 3: KNP 10/90, антигенно связаны с гетерологичные эталонные полевые штаммы ( r 1 — значения ≥0,3). Их молекулярно-эпидемиологические отношения, определенные секвенированием VP1 и филогенетическим анализом, проведенным в той же лаборатории, показали, что они генетически связаны с другими изолятами соответствующих серотипов из топотипа I (Мозамбик, ЮАР и Зимбабве).

    Вирусы были приготовлены в собственной модификации суспензионных культур клеток Baby Hamster Kidney (BHK)-21 клон 13 (ATCC CCL-10), как описано ранее (32). Инактивацию проводили согласно Bahnemann (33) в течение 24 ч при 35°C с использованием двух доз 2,5 мМ бинарного этиленимина (BEI, Merck, Дармштадт, Германия) в начале инактивации (0 ч) и через 4 ч, когда культуру переносили во вторые сосуды для инактивации. Антигены очищали центрифугированием при 1000 об/мин в течение 10 мин при 25°С и собирали в виде супернатантов перед переносом во второй сосуд для инактивации.Концентрацию и очистку антигенов проводили путем преципитации в полиэтиленгликоле 6000 (Merck, Дармштадт, Германия), как описано ранее (21). Впоследствии антигены, эквивалентные 200 дозам вакцины, были проверены на безвредность в монослойных клетках BHK, как описано в наземном руководстве МЭБ (19).

    Пять моновалентных вакцин, содержащих полезную нагрузку антигена 3,0 мкг/мл для штаммов SAT 1 и SAT 3 и 6,0 мкг/мл для штаммов SAT 2, были последовательно приготовлены в сочетании с другими вспомогательными веществами вакцин для образования водной фазы вакцин.Водную фазу вакцин смешивали 1:1 (по объему) с масляным адъювантом Montanide™ ISA 206 VG в соответствии с рекомендациями производителя по составу вакцины (34), и вакцины были соответственно названы SAT 1A, SAT 1B, SAT. 2А, SAT 2B и SAT 3 вакцины.

    Аналогичным образом, все пять штаммов, содержащих указанные выше антигены, были объединены и использованы в качестве поливалентной вакцины для оценки продолжительности иммунитета в течение 12 месяцев. Все вакцины впоследствии хранили при 4°C, в то время как образцы каждой из них подвергали тестам контроля качества на стерильность (19, 35) и частицы 146 S (36, 37).

    Одобрение этики животных, поиск и обращение с животными

    Исследование проводилось в соответствии с рекомендациями по благополучию животных и этическим нормам Комитета по этике животных (AEC) Совета по сельскохозяйственным исследованиям и Института ветеринарных исследований Ондерстепорта (ARC-OVI) и было одобрено под номером исследования 12/11/1/1a. Кроме того, национальное министерство сельского хозяйства, земельной реформы и развития сельских районов (DALRRD) предоставило разрешение в соответствии со статьей 20 Закона о болезнях животных, Закон №.35 от 1984 г.

    В общей сложности 160 голов крупного рогатого скота нгуни (самцы и самки в возрасте 6 месяцев) были получены из зоны, благополучной по ящуру, и помещены на карантин в открытые загоны крупного животноводческого комплекса ОВИ. У животных брали кровь из яремной вены в пробирки для сбора крови vacutainer, а образцы сыворотки, собранные из свернувшейся крови, тестировали на титры антител до вакцинации (0-й день) ящура.

    За десять дней до вакцинации или инокуляции вирусом ящура животных каждой исследовательской группы помещали в помещение для содержания животных с уровнем биобезопасности 3 (BSL-3) Лаборатории трансграничных болезней животных OVI и размещали в автономных стойлах с минимальной площадью пола в минимум 25.23 м 2 . Крупный рогатый скот мог свободно передвигаться в пределах конюшни. Животных кормили сбалансированным коммерческим рационом из гранул с высоким содержанием грубых кормов один раз в день, водой вволю давали автоматизированной системой поения, а конюшни и кормушки ежедневно чистили. Окружающая среда в конюшнях поддерживалась при относительной влажности ±35% и температуре ±23°C. Давление поддерживалось примерно на уровне -40 Па, а свет составлял ±600 люкс (автоматически включался около 06:00).м. и выходной около 18:00).

    Получение гомологичных вирусов для исследований после вакцинации

    Пять изолятов вируса (SAR 9/81/1; BOT 1/06/1; KNP 1/10/2; SAR 3/04/2 и KNP10/90/3), гомологичных вакцинным штаммам, были получены в виде культуры клеток суспензии вируса на основе известных инфекционных титров [50% инфекционная доза тканевой культуры (TCID50)/мл], с историей пассирования первичной почки свиньи 1 , Instituto Biologico Renal Suino-2 2 и почки детеныша хомячка 5 клетки (PK 1 IB-RS2 2 BHK 5 ), из собственной справочной лаборатории МЭБ по ящуру.Культуры вируса разбавляли до конечной концентрации 10 4 TCID50, и 0,2 мл (2000 TCID50) каждой суспензии вируса инокулировали внутридермолингвально двум коровам Nguni на штамм после седации 0,22 мг/кг ксилазина (Bayer, Германия). Адаптированные вирусы заражения крупного рогатого скота собирали из образовавшихся эпителиальных поражений языка и стоп (копыт) через 48 ч после инокуляции и использовали в качестве контрольных вирусов.

    Моновалентные вакцины PD50 (эффективность) Оценка

    Оценка PD50 проводилась в соответствии с Наземным руководством МЭБ (38).Вкратце, 17 животных для оценки эффективности моновалентной вакцины помещали в помещение для содержания животных BSL-3, им присваивали идентификационные номера с ушными бирками и случайным образом делили на три группы вакцинации и невакцинированную контрольную группу из двух животных. Три вакцинированные группы были вакцинированы внутримышечно с уменьшением объемов вакцины на моновалентную вакцину (таблица 1).

    Таблица 1 . Группировка крупного рогатого скота и введение моновалентных вакцин для теста на PD50 (эффективность).

    Мониторинг здоровья после вакцинации

    Общее состояние животных, включая ректальную температуру тела, контролировали ежедневно в течение 28 дней после вакцинации (dpv) для регистрации развития каких-либо побочных кожных реакций в месте инъекции вакцины и/или лихорадочного состояния. Образцы крови собирали каждые 7 дней до 28 дпв, как упоминалось ранее, из групп животных, вакцинированных дозой вакцины 2 мл, для оценки начала гуморального иммунного ответа.

    Вирусное заражение животных и клиническая оценка после заражения

    На 28-й день после вакцинации всем животным, включая невакцинированную контрольную группу, ввели седативное средство и заразили бычьим адаптированным гомологичным вирусом, как описано выше.Всех животных осматривали под седацией каждые 48 ч в течение 10 дней на наличие клинических признаков ящура после заражения. Ежедневно регистрировали ректальную температуру, а температуру ≥40°C классифицировали как лихорадку.

    Клинические признаки оценивались следующим образом: 1 для лихорадки, +1 для поражений языка независимо от тяжести, +2 для поражений на одной стопе (в дополнение к поражениям языка) и +1 для поражений на каждой дополнительной стопе. Животные потенциально могут набрать максимум семь баллов, если у них есть поражения на всех лапах, а также лихорадка и поражения языка.Животные с клиническим баллом >2 считались незащищенными, тогда как баллы ≤2 (лихорадка плюс поражение языка) считались защищенными. Метод Reed and Muench (39) 50% оценки конечной точки был использован для расчета значения PD50 каждой вакцины на основе количества защищенных от незащищенных животных после заражения.

    Оценка продолжительности иммунитета (гуморальный ответ и клиническая защита), вызванного мультивалентной вакциной

    Группы животных

    Всего в животноводческий комплекс BSL-3 было допущено 55 голов крупного рогатого скота.Животные были разделены на три группы режимов вакцинации, а именно: 1-я группа ( n = 25) для однократной первичной вакцинации в 0-й день, 2-я группа ( n = 20) для первичной вакцинации плюс две ревакцинации (1,5 и 6). месяцев после первичной вакцинации) и Группа 3 ( n = 10) для первичной вакцинации плюс одна ревакцинация (через 6 месяцев после первичной вакцинации). Из-за стабильных размеров в помещении для содержания животных BSL-3 животных содержали в семи подгруппах ( n = 5 или 10) при сохранении трех групп режима вакцинации, упомянутых выше.На основании графика заражения вирусом после вакцинации животных распределяли по подгруппам, обозначенным A–G, и обозначали номерами 1–10 в каждой подгруппе с помощью ушных бирок.

    Вакцинация и сбор проб После вакцинации

    Всех животных ( n = 55) вакцинировали внутримышечно дозой вакцины 2 мл (первичная вакцинация) и после этого разделили на вышеуказанные группы. Через 1,5 месяца (6 недель) животным 2-й группы была проведена первая ревакцинация в той же дозе, что и первичная вакцинация.Через шесть месяцев после первичной вакцинации животным группы 2 была проведена вторая ревакцинация, а животным группы 3 была проведена первая ревакцинация. Ежемесячно собирали образцы крови у всех животных, как указано выше, вплоть до 12 месяцев после вакцинации (MPV).

    Вирусная инфекция после вакцинации

    Десять дополнительных животных были помещены в помещение для содержания животных BSL-3 поэтапно, по два животных на фазу, в качестве невакцинированных контролей в течение периодов заражения вирусом 1.5, 3, 6, 9 и 12 микроавтобусов. Животных заражали, как описано выше, SAR 3/04/2 в каждый период заражения. Таким образом, пять животных в группе 1 заражали при 1,5 м.о., а затем по пять животных из групп 1 и 2 заражали при 3, 6, 9 и 12 м.о. Аналогичным образом, пять животных из группы 3 были заражены при 9 и 12 м.ч. после введения их первой бустерной дозы на 6 м.ч. Мониторинг животных после заражения проводили в течение 10 дней, как описано выше, после чего животных умерщвляли.

    Серологическое тестирование
    Возникновение гуморального иммунитета после вакцинации моновалентными вакцинами

    Для оценки возникновения гуморального иммунитета использовали группы животных, вакцинированных 2 мл пяти моновалентных вакцин. Иммуноферментный анализ с блокировкой жидкой фазы (LPBE) проводили в соответствии с Hamblin et al. (40), на образцах сыворотки, собранных до вакцинации, и каждые 7 дней до 28 дпв. Антигены, гомологичные вакцинным штаммам, использовали для определения количества антител (log10 титров), индуцированных против каждой моновалентной вакцины.Титры антител до вакцинации считались исходным гуморальным иммунным ответом, и в соответствии с предварительно установленной тенденцией титра отрицательного контроля теста образцы сыворотки с титрами ≥1,6 log10 рассматривались как показатель сероконверсии в соответствующий серотип (29). .

    Продолжительность гуморального иммунитета после вакцинации поливалентной вакциной

    Для оценки титров антител после вакцинации поливалентной вакциной образцы сыворотки, собранные до вакцинации и ежемесячно после вакцинации, тестировали на титры антител, нейтрализующих вирус SAT 2 (VN), в тесте VN.Тест проводился, как описано в Руководстве МЭБ по диагностическим тестам и вакцинам для наземных животных (41, 42). Вкратце, серийно разведенные образцы, а также известные положительные и отрицательные контроли инкубировали с 10 2 TCID50 SAR 3/04/2, гомологичным вакцинному штамму SAT 2B, в течение 1 часа при 37°C. Смесь переносили на монослои клеток BHK-21clone 13. Конечные титры рассчитывали как обратную величину последнего разведения образцов сыворотки для нейтрализации 100 TCID50 в 50% лунок после 72-часового периода инкубации в инкубаторе с диоксидом углерода при 37°C (43).Титры сыворотки до вакцинации считались исходным гуморальным иммунным ответом. Кроме того, образцы с титрами антител ≤ 1,6 log10 считались ненейтрализующими в соответствии с титром отрицательного контроля теста.

    Статистический анализ

    Предположение о нормальности для всех количественных исходных переменных было оценено путем расчета описательной статистики, построения гистограмм и выполнения теста Андерсона-Дарлинга на нормальность. Титры фермента, блокирующего жидкую фазу, и титры антител против VN представляли как среднее значение ± стандартное отклонение (SD) при 95% нижнем и верхнем доверительных интервалах, а сравнения проводили с использованием однофакторного дисперсионного анализа (ANOVA).Результаты теста на нейтрализацию вируса использовали для сравнения титров между вакцинированными группами на протяжении исследования иммунитета путем проведения непараметрических тестов Крускала-Уоллиса в каждой точке отбора проб после вакцинации. Все статистические процедуры выполнялись с использованием IBM SPSS Statistics (версия 27, International Business Machines Corp., Армонк, Нью-Йорк, США), а результаты интерпретировались на уровне значимости 5%.

    Результаты

    Тесты контроля качества вакцин

    Все инактивированные антигены соответствовали установленной законом кинетике инактивации, и в тесте на безвредность не было зарегистрировано остаточного живого вируса (таблица 2).Кроме того, во всех вакцинах (моновалентных и поливалентных) не было зафиксировано микробной контаминации, поэтому они прошли контроль качества на стерильность (табл. 2). Концентрация антигенов (частицы 146 S) в приготовленных вакцинах была эквивалентна той, которая использовалась при приготовлении вакцин (результаты не показаны).

    Таблица 2 . Сводные результаты контроля качества при производстве антигена для состава вакцины.

    Безопасность и формирование гуморального иммунитета пяти моновалентных вакцин

    Никакого отека или раздражения кожи не наблюдалось в месте инъекции вакцины в течение 28 дпв с пятью вакцинами (результаты не показаны).Кроме того, не было зарегистрировано лихорадки, хотя небольшое повышение (<39,0°C) ректальной температуры было зарегистрировано у некоторых вакцинированных животных всеми пятью вакцинами между 1 и 10 дпв, которое снизилось примерно до 38,5°С к 28 дпв (рис. 1). .

    Рисунок 1 . Средние (±SD) ректальные температуры тела (°C) групп животных, вакцинированных 2 мл пяти моновалентных вакцин [0–28 дней после вакцинации (dpv)] и после соответствующего заражения гомологичным вирусом [1–10 дней после вакцинации]. вызов (dpc)].Горизонтальная пунктирная линия представляет базовую температуру (38,5°C).

    Гомологичные титры антител к LPBE, вызванные дозой 2 мл пяти вакцин в течение 28 дпв, представлены на рисунке 2. Все животные, набранные, включая невакцинированные контроли, сообщили о средних титрах антител ≤ 1,6 log10 до вакцинации (день 0) и были признаны отрицательными по ящуру. Сероконверсия наблюдалась с 7 дпв для вакцин SAT 1B, SAT 2A и SAT 2B, когда средние (±SD) титры антител ≥2,0 log10 регистрировались и сохранялись до 28 дпв.Аналогичные титры были достигнуты после 14 dpv для вакцин SAT 1A и SAT 3 (фиг. 2).

    Рисунок 2 . Средние (±SD) титры антител (жидкофазный блокирующий ELISA), полученные при вакцинации полной дозой пяти моновалентных вакцин, отслеживаемые еженедельно в течение 28 dpv. Зеленая линия представляет пороговый титр 1,6 log10 на основе титров до вакцинации в день 0.

    Моновалентные вакцины PD50 после заражения гомологичными вирусами

    У всех животных, включая невакцинированных контролей, была лихорадка (ректальная температура ≥40.0°C) через день после заражения, которая сохранялась до 3-го дня после заражения и снижалась до 38,5°C между 6-м и 10-м днями после заражения (рис. 1).

    Классификация животных как клинически защищенных и незащищенных проводилась в соответствии с Руководством МЭБ по диагностическим тестам и вакцинам для наземных животных (POTENCY) (2018) (38). Соответственно, животные с поражением стоп (клиническая оценка >2) считались незащищенными. Клинические показатели отдельных животных регистрировали от 1 до 10 дней после заражения (dpc).

    В дополнение к лихорадке у всех вакцинированных и невакцинированных контрольных животных развились поражения языка, соответствующие заражению вирусом ящура, начиная со 2 dpc (начало клинических поражений не показано). У невакцинированных контрольных животных были обнаружены поражения копыт на трех или четырех ступнях, и, соответственно, им была присвоена совокупная клиническая оценка от 6 до 7 (Таблица 3).

    Таблица 3 . Клинические баллы после гомологичного заражения для оценки вакцин PD50.

    Доза вакцины 2 мл для всех пяти вакцин, а также 0.Доза 5 мл для вакцин SAT 1B, SAT 2A и SAT 3 и доза 0,1 мл для вакцин SAT 1B вызывала полную клиническую защиту от постгомологического заражения вирусом ящура (клиническая оценка ≤ 2). Однако защита животных начала снижаться с уменьшением введенной дозы вакцины (таблица 3).

    На основании количества защищенных и незащищенных животных после гомологичного заражения были назначены 12 и 32 PD50 для вакцин SAT 1A и SAT 1B, 10 и 4 для вакцин SAT 2A и SAT 2B и 20 для вакцин SAT 3, соответственно ( Таблица 4).

    Таблица 4 . Моновалентные вакцины PD50 после заражения гомологичным вирусом.

    Продолжительность иммунитета, вызванного поливалентной вакциной

    В общей сложности 15 из 55 животных в трех группах вакцинации умерли до того, как их удалось заразить гомологичным полевым вирусом SAT 2 (отчеты о вскрытии не показаны), и поэтому они были исключены из результатов. 12-месячный обзор клинических результатов после различных периодов заражения и их соответствующие титры антител к ВН до инокуляций заражения показаны в таблице 4, а ежемесячный отчет о поствакцинальном гуморальном ответе между тремя группами вакцинации показан в таблице 5 как а также на рисунке 3.

    Таблица 5 . Продолжительность иммунитета после трех групп вакцинации: титры антител к ВН во время заражения и клинические результаты после заражения.

    Рисунок 3 . Средние титры вируснейтрализующих (VN) антител (±SD) в течение 12 месяцев после применения трех схем вакцинации. Желтая линия представляет средние титры антител животных (≤ 1,6 log10) до вакцинации и стандартный титр отрицательного контроля теста VN.

    Продолжительность иммунитета более 12 месяцев после однократной первичной вакцинации (группа 1)

    Перед вакцинацией (0 mpv) у всех животных регистрировали средние (±SD) титры антител против ВН между 1.2 и 1,3 log10, что было признано исходным гуморальным ответом. На основании титров отрицательного контроля теста VN был назначен пороговый титр 1,6 log10, а титры >1,6 были признаны сероконверсией. Средние титры антител 2,1 log10 наблюдались до того, как первые пять животных были заражены 1,5 mpv (таблица 5). Через день после заражения у пяти вакцинированных животных и у двух невакцинированных контрольных животных развилась лихорадка (≥40°C) (результаты не показаны). Поражения языка и последующая эрозия эпителия языка, а также пенистое слюноотделение наблюдались со 2-го по 5-й дни после заражения у вакцинированных животных, в то время как поражения языка и стоп наблюдались у двух невакцинированных контрольных животных.Таким образом, 100% клиническая защита после однократной вакцинации была достигнута после периода заражения 1,5 mpv, так как не было зарегистрировано поражений подошвы.

    После этого наблюдалось снижение титра антител (0,3 log10), достигающее 1,8 log10 (±0,3 SD) на 3 mpv (рис. 3). У одного вакцинированного животного и у двух невакцинированных контрольных животных были обнаружены поражения как на языке, так и на лапах (общие клинические признаки). Клиническая защита была достигнута на семьдесят пять процентов ( n = 3/4) (таблица 5). От 3 до 6 м.п.в. наблюдалось дальнейшее снижение титров антител, достигая средних значений между 1.3 и 1,6 log10 (±0,3 SD). Впоследствии 60% ( n = 3/5) клиническая защита была зарегистрирована после периода заражения 6 mpv (таблица 5). Несмотря на то, что были зарегистрированы титры антител ≤ 1,6 log10 (±0,1 SD), 100% клиническая защита была достигнута после периода заражения 9 м.п.в. ( n = 3/3) и 12 м.п.в. ( n = 5/5).

    Продолжительность иммунитета более 12 месяцев после первичной вакцинации плюс две бустерные вакцинации (группа 2)

    животных этой группы ревакцинированы в 1.5 мпв и при этом не оспаривается. Средние титры антител 2,1 log10 были зарегистрированы перед контрольным заражением 3 mpv, и была достигнута 100% ( n = 4/4) клиническая защита (таблица 5). Однако уменьшение титров антител [до 1,5 log10 (±0,1 SD)] было зарегистрировано между 4 и 5 mpv, независимо от ревакцинации 1,5 mpv (рис. 3). При 6 mpv были зарегистрированы средние титры антител 1,8 log10 (таблица 5), и, как и у животных группы 1, в тот же период заражения была достигнута только 60% ( n = 3/5) клиническая защита.Увеличение титров антител наблюдалось через 7 м.п. после введения бустерной вакцины с 6 м.п., достигая максимума 2,7 log10 (среднее, ±0,3 SD) (рис. 3). В последующие месяцы животные в этой группе сохраняли средние титры антител ≥2,2 log10 до конца исследования (12 м.о.), что совпадало со 100% ( n = 3/3) клинической защитой после 9 и 12 м.о. 5).

    Продолжительность иммунитета более 12 месяцев после первичной вакцинации плюс одна ревакцинация (группа 3)

    10 животных в Группе 3 были ревакцинированы только через 6 месяцев после первичной вакцинации и, таким образом, заражены только после 9 и 12 MPV.В общей сложности шесть животных погибли до инокуляционного заражения. Средние титры антител 2,4 log10 (±0,4 SD) и 2,8 log10 (±0,2 SD) (рис. 3), соответственно, были зарегистрированы при 9 и 12 м. об., что соответствует 100% ( n = 2/2) клинической защите после задача (таблица 5). Невакцинированные контрольные группы показали генерализованные поражения.

    Статистический (ежемесячный) анализ поствакцинальной гуморальной реакции трех режимов вакцинации

    Средние титры антител после вакцинации (±SD) при каждом интервале отбора проб в течение 12 месяцев для трех групп вакцинации (общее количество животных в группе) представлены в Таблице 6.Снижение средних титров антител наблюдалось на 3 м.п.о. в группах животных (группы 1 и 3) без бустерной вакцинации 1,5 м.п.о. От 6 до 12 mpv наблюдалось увеличение титров антител после введения ревакцинации 6 mpv (группы 2 и 3), тогда как титры группы 1 (без ревакцинации) спорадически снижались. ANOVA выявил разницу между тремя группами вакцинации ( p < 0,01). Попарное сравнение групп показало, что существует достоверная разница между 1-й и 2-й группами ( p < 0.01) и между группой 1 и группой 3 ( p < 0,01), в то время как между группой 2 и группой 3 достоверной разницы не было ( p > 0,05) (рис. 4).

    Таблица 6 . Сравнение титров антител между тремя группами вакцинации в каждом интервале после вакцинации.

    Рисунок 4 . Сравнение между вакцинированными группами средних титров log10 VN (независимые образцы, тест Крускала-Уоллиса).

    Обсуждение

    Хотя уровень смертности от инфекций ящура довольно низок (16, 44), это заболевание имеет большое общественное и политическое значение из-за экономической нагрузки на страну, столкнувшуюся с эпидемией (45).Эмбарго на торговлю скотом и продуктами животноводства, наложенное на страну, столкнувшуюся со вспышкой, имеет более серьезные финансовые последствия, чем стратегии борьбы с болезнями, применяемые для смягчения последствий возможных вспышек (46). Ликвидация болезни в эндемичных районах, таких как СА, невозможна из-за постоянной угрозы заражения домашнего скота из-за перманентно зараженных ящуром стад буйволов в КНП и прилегающих трансграничных районах (10). Таким образом, стратегии борьбы в значительной степени зависят от подготовки эффективных вакцин, применение которых на основе научных данных может способствовать снижению частоты вспышек (47).Это, в свою очередь, может снизить уровень торговых эмбарго на скот и продукты животноводства, наложенных на ЮАР из-за повторяющихся вспышек.

    Внутритиповые вариации внутри штаммов ящура, характеризующиеся полным отсутствием или частичной перекрестной защитой среди гетерологичных штаммов, представляют проблему для успешных кампаний вакцинации (48). Эти вариации заметны в серотипах SAT в SADC по сравнению с евроазиатскими серотипами (7). Таким образом, желательно, чтобы вирусные штаммы, отобранные для приготовления вакцины против ящура, обеспечивали широкую антигенную перекрестную защиту с местными гетерологичными полевыми штаммами.Это одна из причин, по которой профилактические ящурные вакцины обычно готовят как поливалентные вакцины, содержащие до семи штаммов вируса, поскольку невозможно предсказать, какие серотипы/топотипы будут ответственны за следующую вспышку (11, 31).

    Пять штаммов, представляющих три серотипа SAT, циркулирующих в странах Африки к югу от Сахары, были ранее отобраны для приготовления поливалентной вакцины для кампаний профилактической и экстренной вакцинации. Эффективность вакцин от ящура рекомендуется демонстрировать в исследованиях с контрольным заражением животных, при этом эффективность вакцины, определяемая снижением клинической экспрессии после заражения, должна составлять >75% по сравнению с невакцинированными контрольными животными (38).Целью нашего исследования было продемонстрировать эффективность пяти местных штаммов типа SAT в сочетании с адъювантом Montanide™ ISA 206 VG DOE у крупного рогатого скота нгуни. Таким образом, оценивали активность, начало антигенспецифического гуморального ответа и безопасность отдельных штаммов в качестве моновалентных вакцин. Впоследствии продолжительность гуморального иммунитета и клинической защиты оценивали в течение 12 месяцев после приготовления пяти штаммов в виде поливалентной вакцины, чтобы имитировать применение вакцины в полевых условиях.

    Тесты контроля качества, проведенные на всех рецептурах вакцин, показали, что процесс приготовления вакцин не приводил к введению нежелательных контаминирующих агентов и потерям антигена.В последующем введение самой высокой дозы вакцины 2 мл, использованной для оценки безопасности пяти моновалентных прививок, не вызывало побочных кожных реакций в местах инъекций или поствакцинального лихорадочного состояния и, таким образом, считалось безопасным. Начало антигенспецифического гуморального иммунитета после вакцинации моновалентной вакциной в дозе 2 мл (обозначенной титрами антител ≥2,0 log10) наблюдалось между 7 и 14 дпв. В связи с сообщениями о том, что индукция нейтрализующих антител обычно считается важным индикатором защитного иммунитета против ящура (49), эти титры антител считались показателем хорошего иммунологического ответа.

    Защита, опосредованная вакцинацией полной дозой (2 мл) всех пяти моновалентных вакцин, была полной, о чем свидетельствовало отсутствие генерализованных поражений. Тем не менее, наблюдалось дозозависимое снижение защиты (у животных наблюдалось поражение подошвы как минимум на одной лапе), за исключением вакцины SAT 1B (в составе штамма BOT 1/06/1), которая давала полную клиническую защиту с показателем 0,125. -мл дозы вакцины. Быстрое начало (7 dpv) гуморального иммунитета, индуцированного после вакцинации 2 мл двух моновалентных вакцин SAT 2, было связано с более высокими нагрузками антигена (6 мкг/мл), использованными во время приготовления вакцины, по сравнению с иммунизацией при вакцинации.3 мкг/мл, используемые для моновалентных вакцин SAT 1 и 3. Этот ответ будет полезен во время чрезвычайных вспышек, поскольку вирусы SAT 2 ответственны за большинство вспышек, имевших место в СА (50). Достаточно упомянуть, что аналогичные титры антител были достигнуты с вакциной SAT 1B (BOT 1/06/1), хотя и с половинной (3 мкг/мл) полезной антигенной нагрузкой.

    Вакцины против ящура классифицируются как «стандартные» или «более сильные» вакцины (38). В соответствии с этой классификацией вакцины со стандартной эффективностью представляют собой вакцины, содержащие антигены в концентрациях, обеспечивающих минимальный уровень активности 3 PD50, и, таким образом, пригодные для профилактических вакцинаций.Кроме того, вакцинация интактных животных для борьбы со вспышками требует приготовления вакцин с более высокой активностью (≥6 PD50). Оценка активности пяти моновалентных вакцин показала, что 3-6 мкг инактивированных BEI антигенов SAT приводят к значениям эффективности выше, чем стандартные 3 PD50 (от 4 до 32 PD50), и к быстрому возникновению иммунитета. Таким образом, полную дозу можно успешно использовать как для профилактической, так и для экстренной вакцинации без увеличения полезной нагрузки антигена.

    Дополнительным преимуществом использования высокоэффективных вакцин является то, что они преодолевают трудности, связанные с антигенными вариациями внутри штаммов вируса одного и того же серотипа, и, таким образом, могут защищать от клинического ящура в случае плохого соответствия вакцины циркулирующему полевому штамму (51, 52). .Таким образом, ожидается, что мультивалентная вакцина, составленная из пяти штаммов, потенциально может обеспечить адекватную защиту от гетерологичных полевых штаммов, особенно во время чрезвычайных вспышек, когда данные о совместимости вакцины in vitro недоступны. Лазарус и др. (53) сообщили об эффективности этой мультивалентной вакцины у коз после гетерологичного заражения SAT 1.

    Данные гуморального иммунитета после вакцинации поливалентной вакциной показали, что однократная доза 2 мл вызывала титры антител ≥1.8 log10 от 1,5 mpv, что совпадает с полной клинической защитой необработанного крупного рогатого скота после гомологичного заражения SAT 2. Бустерная вакцинация в дозе 1,5 м.о.о. привела к дальнейшему увеличению титра антител до 3 м.о. и полной клинической защите. Однако без этой бустерной вакцинации наблюдалось снижение титра антител (<1,6 log10, отрицательный порог) и снижение клинической защиты (75%). Польза (клиническая защита) бустерной вакцинации 1,5 mpv не наблюдалась, когда животных заражали через 6 месяцев после первичной вакцинации.Подобно животным, которые не подвергались буст-иммунизации, 60% ( n = 3/5) клиническая защита была зарегистрирована в группе животных, подвергшихся ревакцинации, даже несмотря на то, что были зарегистрированы титры антител, превышающие исходный уровень (день 0). Таким образом, невозможно провести корреляцию между антителами до заражения и клинической защитой после заражения.

    Введение ревакцинации 6 MPV в качестве первой или второй ревакцинации первичной вакцины увеличивало титры антител (≥2 log10) начиная с 7 MPV, превышая те, которые наблюдались после 1.Ревакцинация 5 MPV. Во время первичной вакцинации несколько голов крупного рогатого скота скончались от острой геморрагической фибринонекротической пневмонии, которая была связана со стрессом окружающей среды. Нескольких животных строго лечили антибиотиками, и они выздоровели. Поэтому предполагается, что низкие гуморальные иммунные ответы, наблюдаемые после бустерной дозы 1,5 mpv, были обусловлены неадекватными иммунными реакциями у больных животных. В отличие от этого, при ревакцинации 6 mpv все подопытные животные полностью выздоровели от болезни и приспособились к условиям окружающей среды в своих загонах.Таким образом, наблюдалась 100% клиническая защита после заражения при 9 и 12 mpv, хотя количество зараженных животных уменьшилось из-за гибели нескольких животных. Улучшение клинической защиты также наблюдалось у животных, которых никогда не ревакцинировали после первичной вакцинации, даже если их титры антител были ≤ 1,6 log10. Эта непредвиденная клиническая защита может быть связана с комбинацией нескольких факторов, включая роль сильнодействующих вакцин (54), клеточно-опосредованный иммунитет (55, 56) и вклад адъюванта DOE, используемого для приготовления вакцины (27).

    Двойная масляная эмульсия Вакцины Montanide™ ISA 206 VG с адъювантом от ящура вызывают более длительный иммунитет по сравнению с вакцинами с адъювантом гидроксида алюминия (27–29), особенно при частых ревакцинациях (26). Это связано с тем, что вакцина составлена ​​таким образом, что антиген легко доступен в первой непрерывной водной фазе эмульсии для индукции краткосрочного иммунитета после инъекции, а затем долговременный иммунитет запускается вторичной водной фазой, инкапсулированной внутри капли масла первой водной фазы (33).

    Одним из ограничений этого исследования является то, что в нем оценивалась эффективность вакцины с использованием защиты от генерализованной ящурной инфекции, без оценки выделения вируса и развития состояния носительства у вакцинированных животных. Этот подход предполагал вероятность защиты, при которой 75% защита считалась достаточной для поддержки применения вакцин в восприимчивых группах населения (19). Тем не менее, это не умаляет общего вывода, который можно сделать из полученных результатов.Предыдущие исследования на крупном рогатом скоте показали, что, хотя вирус можно было выделить на сроке до 57 (57) или 98 (58) дпс от вакцинированных и зараженных животных, вирус не передавался наивному крупному рогатому скоту после прямого контакта с этими животными-носителями. Кроме того, живой вирус невозможно было выделить после заражения у крупного рогатого скота, вакцинированного в течение 7 дней или дольше коммерческой вакциной Министерства энергетики США с использованием инактивированного очищенного штамма O Manisa вируса ящура с 3 PD50 (57). Таким образом, можно разумно предположить, что вакцинация будет иметь заметный эффект предотвращения передачи ящура за счет снижения клинических проявлений болезни, даже если стерилизующий иммунитет не будет достигнут.

    Из соображений стоимости в исследовании оценивалась продолжительность иммунитета против заражения SAT 2, поскольку этот серотип является причиной большинства вспышек в SA (50). Таким образом, эмпирически нельзя сделать вывод о том, что поливалентная вакцина может защитить от вспышек SAT 1 и 3 у крупного рогатого скота. Однако недавнее исследование, проведенное на козах с использованием той же поливалентной вакцины, которая использовалась в текущем исследовании, показало, что ни у одного из животных, вакцинированных полной одной третьей и одной шестой дозой, не было признаков вирусной РНК, обнаруженной в мазках из ротоглотки, носа и прямой кишки. образцы от 0 до 6 dpc (53).В другом исследовании эффективность термостабилизированной вакцины SAT 2 показала, что защита, опосредованная адъювантом DOE Montanide ISA 206, вызывала более высокие титры нейтрализующих SAT 2 антител и системные ответы IFN-γ на 14 и 28 дпк (59).

    На основании этих данных мы рассматриваем пять вакцинных штаммов-кандидатов, подходящих для успешной местной профилактической вакцинации и в других странах мира, где встречаются антигенно родственные серотипы SAT. Мы ожидаем, что благодаря высокой активности поливалентная вакцина объемом 2 мл также может быть успешно использована во время чрезвычайных вспышек.ANOVA между тремя режимами поливалентной вакцинации выявил незначительную ( p > 0,05) иммунологическую разницу между применением одной или двух ревакцинаций. Тем не менее, мы рекомендуем введение 2 мл дозы первичной вакцинации 6-месячному наивному крупному рогатому скоту с последующей бустерной вакцинацией в дозах 1,5 и 6 MPV в связи со снижением гуморального ответа и клинической защиты, зарегистрированным через 3 месяца после первичной вакцинации у животных. которые не были усилены 1.5 мпв. Поэтому мы ожидали, что эта схема вакцинации потенциально может поддерживать 100% защиту стада в течение 12-месячного периода.

    Заявление о доступности данных

    Оригинальные вклады, представленные в исследовании, включены в статью/дополнительный материал, дальнейшие запросы можно направлять соответствующему автору/ам.

    Заявление об этике

    Исследование на животных было рассмотрено и одобрено 1. Ветеринарным институтом Ондерстепорта — Комитетом по этике животных, 2.Министерство сельского хозяйства, земельной реформы и развития сельских районов Южной Африки, раздел 20 Закона о болезнях животных 35 от 1984 г., Управление охраны здоровья животных и 3. Научно-исследовательский комитет Университета медицинских наук Сефако Макгато.

    Вклад авторов

    FP: концептуализация, методология, исследование, обработка данных и описание (первоначальный проект). МС: статистический анализ. PB и PM: методология и обработка данных. NV: технический надзор и обработка данных. JO и MS: академический надзор.LH: администрирование проекта, надзор и курирование данных. Все авторы внесли свой вклад в статью и одобрили представленную версию.

    Финансирование

    Авторы выражают признательность Национальному казначейству Южной Африки за всеобъемлющее финансирование проекта модернизации завода по производству вакцин от ящура, предоставленного Совету по сельскохозяйственным исследованиям.

    Конфликт интересов

    PB и NV были наняты компанией Private Consultants, Boxmeer.

    Остальные авторы заявляют, что исследование проводилось при отсутствии каких-либо коммерческих или финансовых отношений, которые могли бы быть истолкованы как потенциальный конфликт интересов.

    Примечание издателя

    Все претензии, изложенные в этой статье, принадлежат исключительно авторам и не обязательно представляют претензии их дочерних организаций или издателя, редакторов и рецензентов. Любой продукт, который может быть оценен в этой статье, или претензии, которые могут быть сделаны его производителем, не гарантируются и не поддерживаются издателем.

    Дополнительный материал

    Дополнительный материал к этой статье можно найти в Интернете по адресу: https://www.frontiersin.org/articles/10.3389/fvets.2021.750223/full#supplementary-material

    Каталожные номера

    2. Han L, Xin X, Wang H, Li J, Hao Y, Wang M, et al. Клеточный ответ на стойкую вирусную инфекцию ящура связан со специфическими типами изменений в транскриптоме клетки-хозяина. Научный представитель (2018) 8:1–13. doi: 10.1038/s41598-018-23478-0

    Резюме PubMed | Полный текст перекрестной ссылки | Академия Google

    3. Александерсен С., Моват Н.Ящур: круг хозяев и патогенез. В: Mahy BW, редактор. Вирус ящура. Актуальные темы микробиологии и иммунологии , Vol. 288. Берлин, Гейдельберг: Springer (2005), с. 9–42.

    Академия Google

    4. Арцт Дж., Джулефф Н., Чжан З., Родригес Л.Л. Патогенез ящура I: вирусные пути у крупного рогатого скота. Transbound Emerg Dis. (2011) 58: 291–304. doi: 10.1111/j.1865-1682.2011.01204.x

    Резюме PubMed | Полный текст перекрестной ссылки | Академия Google

    5.Lefabran Y, Gerbier G. Обзор состояния ящура и подходов к контролю/искоренению в Европе и Центральной Азии. Rev Sci Tech. (2002) 21:477–92. doi: 10.20506/rst.21.3.1345

    Резюме PubMed | Полный текст перекрестной ссылки | Академия Google

    6. Vosloo W, Bastos AD, Kirkbride E, Esterhuysen JJ, van Rensburg DJ, Bengis RG, et al. Персистентная инфекция африканского буйвола ( Syncerus caffer ) вирусами ящура SAT-типа: скорость фиксации мутаций, антигенные изменения и межвидовая передача. J Генерал Вирол. (1996) 77:1457–67. дои: 10.1099/0022-1317-77-7-1457

    Резюме PubMed | Полный текст перекрестной ссылки | Академия Google

    7. Мари Ф.Ф., Касанга С.Дж., Скотт К.А., Опперман П.А., Сангула А.К., Саллу Р. и соавт. Проблемы и перспективы борьбы с ящуром: взгляд Африки. Vet Med Rep. (2014) 5:119–38. DOI: 10.2147/VMRR.S62607

    Резюме PubMed | Полный текст перекрестной ссылки | Академия Google

    10. Barsa M, Catley A, Macchuchu D, Laqua H, Pout E, Tap Kot D, et al.Вакцинация против ящура в Судане: анализ выгод и затрат и влияние на средства к существованию. Transbound Emerg Dis. (2008) 55:339–51. doi: 10.1111/j.1865-1682.2008.01042.x

    Резюме PubMed | Полный текст перекрестной ссылки | Академия Google

    11. Паттнаик Б., Сураманиам С., Саньял А., Мохапатра Дж. К., Даш Б., Ранджан Р. и соавт. Ящур: глобальный статус и будущая дорожная карта для контроля и профилактики в Индии. Сельскохозяйственная рез. (2012) 1:132–47. doi: 10.1007/s40003-012-0012-z

    Полнотекстовая перекрестная ссылка | Академия Google

    12.Брито Б.П., Джори Ф., Дварка Р., Мари Ф.Ф., Хит Л., Перес А.М. Передача вирусов ящура SAT2 на стыке диких животных и домашнего скота в двух крупных трансграничных заповедных зонах в Южной Африке. Фронт микробиол. (2016) 7:528. doi: 10.3389/fmicb.2016.00528

    Резюме PubMed | Полный текст перекрестной ссылки | Академия Google

    14. Knight-Jones TJD, Bulut AN, Gubbins S, Stärk KDC, Pfeiffer DU, Sumption KJ, et al. Ретроспективная оценка эффективности вакцины против ящура в Турции. Вакцина. (2014) 32:1848–55. doi: 10.1016/j.vaccine.2014.01.071

    Резюме PubMed | Полный текст перекрестной ссылки | Академия Google

    15. ДАФФ. Ветеринарное уведомление о процедуре борьбы с ящуром в Южной Африке . Южно-Африканская Республика: Управление здоровья животных Министерства сельского, лесного и рыбного хозяйства (DAFF) (2014 г.). стр. 1–73.

    Академия Google

    16. Томсон Г.Р. Ящур. В: Coetzer JAW, Thomson GR, Tustin RC, редактор. Инфекционные болезни домашнего скота с особым упором на юг Африки . Кейптаун: Издательство Оксфордского университета (1994). п. 825–52.

    Академия Google

    17. Айер А.В., Гош С., Сингх С.Н., Дешмукх Р.А. Оценка трех готовых рецептур масляных адъювантов для производства вакцины против ящура. Вакцина. (2001) 19:1097–105. doi: 10.1016/S0264-410X(00)00337-6

    Резюме PubMed | Полный текст перекрестной ссылки | Академия Google

    18.Лайонс Н.А., Лиоо Ю.С., Кинг Д.П., Патон Д.Дж. Проблемы поддержания защитного иммунного ответа, индуцированного вакциной, против вируса ящура у свиней. Front Vet Sci. (2016) 3:102. doi: 10.3389/fvets.2016.00102

    Резюме PubMed | Полный текст перекрестной ссылки | Академия Google

    20. Китчинг П., Хаммонд Дж., Гегго М., Чарльстон Б., Патон Д., Родригес Л. и др. Глобальный контроль ящура – ​​вариант? Вакцина. (2007) 25:5660–4. doi: 10.1016/j.vaccine.2006.10.052

    Резюме PubMed | Полный текст перекрестной ссылки | Академия Google

    23.Мари Ф.Ф., Нсамба П., Мутовембва П., Ротерхэм Л.С., Эстерхуйсен Дж., Скотт К. Внутрисеротипная химерная вакцина против ящура SAT2 защищает крупный рогатый скот от заражения ящуром. Вакцина. (2015) 33:2909–16. doi: 10.1016/j.vaccine.2015.04.058

    Резюме PubMed | Полный текст перекрестной ссылки | Академия Google

    26. Френкель С., Барендрегт Л.Г., Клоостерман Э.Г., Талмон Ф.П. Серологический ответ телят на вакцину против ящура в виде геля гидроксида алюминия с сапонином или без него. В: Влияние генетических различий на эту реакцию [презентация конференции] 16-я конференция по ящуру Международное эпизоотическое бюро .Париж (1982).

    Академия Google

    27. Моват Г.Н. Сравнение адъювантных эффектов сапонина и масляной эмульсии в вакцинах против ящура для крупного рогатого скота. Bul Off Int des Epiz. (1974) 81:1319–30.

    Академия Google

    28. Хантер П. Производительность южных африканских территорий серотипов антигена ящура в вакцинах с масляным адъювантом. Rev Sci Tech. (1996) 15:913–22. doi: 10.20506/rst.15.3.954

    Резюме PubMed | Полный текст перекрестной ссылки | Академия Google

    29.Cloete M, Dungu B, Van Staden LI, Ismail-Cassim N, Vosloo W. Оценка различных адъювантов для вакцины против ящура, содержащей все серотипы SAT. Onderstepoort J Vet Res. (2008) 75:11–25. дои: 10.4102/ojvr.v75i1.84

    Резюме PubMed | Полный текст перекрестной ссылки | Академия Google

    31. Вослоо В., Томсон Г.Р. Естественная среда обитания, в которой сохраняются вирусы ящура. В: Собрино Ф., Доминго Э., редакторы. Вирус ящура Текущие исследования и новые тенденции .Норфолк: Caister Academic Press (2017). п. 179–210. дои: 10.21775/97819101

    .09

    Полнотекстовая перекрестная ссылка | Академия Google

    32. Capstick PB, Telling RC, Chapman WG, Stewart DL. Рост клонированного штамма клеток почек хомяка в суспензионной культуре и их чувствительность к вирусу ящура. Природа . (1962) 195:1163–4. дои: 10.1038/1951163a0

    Резюме PubMed | Полный текст перекрестной ссылки | Академия Google

    33. Банеманн Х.Г. Инактивация вирусных антигенов для приготовления вакцин с особым упором на применение бинарного этиленимина. Вакцина. (1990) 4: 299–303. дои: 10.1016/0264-410X(90)

    -X

    Резюме PubMed | Полный текст перекрестной ссылки | Академия Google

    35. ЭДКМ. Вакцина против ящура (жвачных) (СТЕРИЛЬНОСТЬ) (0063). Европейская фармакопея (PhEur) 9 (01/2017:0063). (2017).

    Академия Google

    36. Бартелинг С.Дж., Мелоен Р.Х. Простой метод количественного определения 140 S частиц вируса ящура. Arch Gesam Virusforsch. (1974) 45:362–4. дои: 10.1007/BF01242879

    Резюме PubMed | Полный текст перекрестной ссылки | Академия Google

    37. Доэль Т.Р., Моват Г.Н. Международное совместное исследование методов анализа вируса ящура 2 Количественное определение частиц 146 S. J Биол Стенд. (1985) 13: 335–44. doi: 10.1016/S0092-1157(85)80048-2

    Резюме PubMed | Полный текст перекрестной ссылки | Академия Google

    39. Reed LJ, Muench H. Простой метод оценки пятидесятипроцентных конечных точек. Амер Дж. Хиг. (1938) 27:493–7. doi: 10.1093/oxfordjournals.aje.a118408

    Полнотекстовая перекрестная ссылка | Академия Google

    40. Hamblin C, Barnett IT, Hedger RSA. Новый твердофазный иммуноферментный анализ (ИФА) для выявления антител к вирусу ящура I. Разработка и метод ИФА. J Immunol Methods. (1986) 93:115–21. дои: 10.1016/0022-1759(86)-2

    Резюме PubMed | Полный текст перекрестной ссылки | Академия Google

    42.Sirdar MM, Fosgate GT, Blignaut B, Gummow B, Shileyi B, Lazarus DD, et al. Новый метод сопоставления антигенной вакцины против ящура в отсутствие гомологичного вируса. Вакцина. (2019) 37:5023–34. doi: 10.1016/j.vaccine.2019.07.002

    Резюме PubMed | Полный текст перекрестной ссылки | Академия Google

    43. Рвейемаму ММ. Антигенная изменчивость при ящуре: исследования, основанные на реакции нейтрализации вируса. J Биол Стенд. (1984) 12:323–37.doi: 10.1016/S0092-1157(84)80013-X

    Резюме PubMed | Полный текст перекрестной ссылки | Академия Google

    45. Brückner GK, Vosloo W, Du Plessis BJA, Kloeck PELG, Connoway L, Ekron MD, et al. Ящур: опыт Южной Африки. Rev Sci Tech. (2002) 21:751–64. doi: 10.20506/rst.21.3.1368

    Резюме PubMed | Полный текст перекрестной ссылки | Академия Google

    46. Knight-Jones TJD, Rushton J. Экономические последствия ящура – ​​каковы они, насколько они велики и где они происходят? Предотвратить мед. (2013) 112:163–74. doi: 10.1016/j.prevetmed.2013.07.013

    Резюме PubMed | Полный текст перекрестной ссылки | Академия Google

    47. ФАО. Руководство по мониторингу вакцинации против ящура . Рим: ФАО (2016).

    Академия Google

    48. Ludi AB, Horton DL, Li Y, Mahapatra M, King DP, Knowles NJ, et al. Антигенная вариация вируса ящура серотипа А. J Gen Virol. (2014) 95:384–92. doi: 10.1099/vir.0.057521-0

    Резюме PubMed | Полный текст перекрестной ссылки | Академия Google

    49.Маккалоу К.С., Де Симоне Ф., Брокки Э., Капуччи Л., Кроутер Дж. Р., Ким У. Защитный иммунный ответ против ящура. Дж Вирол. (1992) 66:1835–40. doi: 10.1128/jvi.66.4.1835-1840.1992

    Резюме PubMed | Полный текст перекрестной ссылки | Академия Google

    51. Waters R, Ludi AB, Fowler VL, Wilsden G, Browning C, Gubbins S, et al. Эффективность высокоэффективной мультивалентной вакцины против ящура у крупного рогатого скота против гетерологичного заражения полевым вирусом новой линии A/ASIA/G-VII. Вакцина. (2018) 36:1901–7. doi: 10.1016/j.vaccine.2018.02.016

    Резюме PubMed | Полный текст перекрестной ссылки | Академия Google

    52. Brehm KE, Kumar N, Thulke HH, Haas B. Высокоэффективные вакцины индуцируют защиту от гетерологичного заражения вирусом ящура. Вакцина. (2008) 26:1681–7. doi: 10.1016/j.vaccine.2008.01.038

    Резюме PubMed | Полный текст перекрестной ссылки | Академия Google

    53. Lazarus DD, Peta F, Blight D, Van Heerden J, Mutowembwa PB, Heath L, et al.Эффективность вакцины против ящура против заражения гетерологичным вирусом SAT1 у коз. Вакцина. (2020) 38:4005–15. doi: 10.1016/j.vaccine.2020.04.014

    Резюме PubMed | Полный текст перекрестной ссылки | Академия Google

    54. Barnett PV, Statham RJ, Vosloo W, Haydon D. Проверка активности вакцины против ящура: определение и статистическая проверка модели с использованием серологического подхода. Вакцина. (2003) 21:3240–8. doi: 10.1016/S0264-410X(03)00219-6

    Резюме PubMed | Полный текст перекрестной ссылки | Академия Google

    55.Patch JR, Pedersen LE, Toka FN, Moraes M, Grubman MJ, Nielsen M, et al. Индукция уничтожения специфичных для вируса ящура цитотоксических Т-клеток путем вакцинации. Клин Вакцина Иммунол. (2010) 18:280–8. doi: 10.1128/CVI.00417-10

    Резюме PubMed | Полный текст перекрестной ссылки | Академия Google

    56. Скотт К.А., Ратогва Н.М., Капоццо А., Мари Ф.Ф. Оценка иммунных ответов стабилизированных антигенов SAT2 ящура крупного рогатого скота. Вакцина. (2017) 35:5426–33.doi: 10.1016/j.vaccine.2017.02.003

    Резюме PubMed | Полный текст перекрестной ссылки | Академия Google

    57. Golde WT, Pacheco JM, Duque H, Doel T, Penfold B, Ferman GS, et al. Вакцинация против вируса ящура обеспечивает полную клиническую защиту в течение 7 дней и частичную защиту в течение 4 дней: использование при реагировании на вспышку чрезвычайной ситуации. Вакцина. (2005) 23:5775–82. doi: 10.1016/j.vaccine.2005.07.043

    Резюме PubMed | Полный текст перекрестной ссылки | Академия Google

    58.Парида С., Андерсон Дж., Кокс С.Дж., Барнетт П.В., Патон Д.Дж. Секреторный IgA как индикатор репликации вируса ротоглоточного ящура и как инструмент поствакцинального надзора. Вакцина. (2006) 24:1107–16. doi: 10.1016/j.vaccine.2005.09.006

    Резюме PubMed | Полный текст перекрестной ссылки | Академия Google

    59. Ратогва Н.М., Скотт К.А., Опперман П., Терон Дж., Мари Ф.Ф. Эффективность вакцины против ящура SAT, содержащей монтанид ISA 206B и сапониновые адъюванты quil-A. Вакцина. (2021) 9:996. doi: 10.3390/vaccines

    96

    Резюме PubMed | Полный текст перекрестной ссылки | Академия Google

    Антибактериальная активность тимохинона, активного начала Nigella sativa, и его способность предотвращать образование бактериальной биопленки | BMC Complementary Medicine and Therapies

    Организмы и химические вещества

    В этом исследовании антибактериальная активность TQ была проверена на 11 патогенных штаммах человека, включая грамотрицательные бациллы: Escherichi coli ATCC 35218, Salmonella enterica ATCC 35218, Salmonella enterica , серовары Typhimurium 804C1402 Pseudomonas aeruginosa ATCC 27853, Vibrio Alginolyticus ATCC 33787, Vibrio paraheamolyticus ATCC 17802; Грамм положительные бациллы: Bacillus Cereus ATCC 14579, Listeria Monocytogene ATCC 19115 и грамм 40005 Cocci: Enterococcus Faecalis ATCC 29212, Micrococcus Luteus NCIMB 8166, Staphylococcus aureus ATCC 25923, Staphylococcus Epidermidis CIP 106510 Таблица 1).

    Таблица 1 Антибактериальная активность тимохинона в отношении штаммов патогенов человека

    TQ, гентамицин и эритромицин были приобретены у Sigma (Sigma-Aldrich, Швейцария).

    Определение минимальной ингибирующей концентрации

    Метод микроразведений в бульоне использовали для определения минимальной ингибирующей концентрации (МИК) и минимальной бактерицидной концентрации (МБК) TQ (от 0 до 512 мкг/мл), гентамицина (от 0 до 256 мкг/мл) и эритромицин (от 0 до 256 мкг/мл), как рекомендовано Национальным комитетом института клинических лабораторных стандартов [25].

    Ночную культуру (37°C) тестируемых штаммов разбавляли в 10 раз свежим триптически-соевым бульоном (TSB) и инкубировали (37°C) до достижения экспоненциальной фазы роста. Серийные двукратные разведения TQ в бульоне Мюллера-Хинтона (MH) (Biorad, Франция) готовили в 96-луночном планшете (190 мкл на лунку).

    Инокулят (10 мкл), содержащий 5,10 6 КОЕ/мл каждого эталонного штамма, добавляли в каждую лунку и тестируемое соединение. В каждом планшете было зарезервировано несколько лунок для проверки контроля стерильности среды (без добавления инокулята) и жизнеспособности инокулята (без добавления соединения).

    После инкубации в течение 24 ч при 37°С рост бактерий оценивали по наличию помутнения и осадка на дне лунки. МИК определяли как концентрацию, полностью ингибирующую видимый рост клеток в течение 24-часового периода инкубации при 37°C

    Определение минимальной бактерицидной концентрации

    видимый рост не удаляли и инокулировали в чашки MH. Через 24 ч инкубации при 37°С определяли количество выживших микроорганизмов.МБК определяли как самую низкую концентрацию, при которой погибало 99% бактерий. Каждый эксперимент повторяли не менее двух раз [26].

    Влияние тимохинона на образование биопленки

    Анализ кристаллического фиолетового

    TQ был протестирован на предмет его способности предотвращать образование биопленки четырех эталонных штаммов (таблица 2). TQ добавляли в питательную среду во время инокуляции, и клеткам давали возможность образовывать биопленки [6]. Предотвращение образования биопленки с помощью TQ исследовали с помощью микроразбавления, аналогично анализу MIC для планктонных клеток.Двукратное серийное разведение готовили в 96-луночных полистироловых планшетах для тканевых культур, содержащих бульон TSB с 2% глюкозы (масса/объем), с конечными концентрациями TQ в диапазоне от 0 до 512 мкг/мл.

    Таблица 2 Антибиопленочный эффект тимохинона против четырех положительных штаммов биопленки

    Среду без TQ использовали в качестве необработанной лунки, а среду с TQ использовали в качестве контрольного бланка. Аликвоты бактериальной суспензии (10 мкл) инокулировали в лунки планшета для тканевых культур (5,10 4 КОЕ/мл, конечная концентрация).После инкубации при 37°C в течение 24 часов культуральные супернатанты из каждой лунки декантировали и удаляли планктонные клетки путем трехкратной промывки фосфатно-солевым буфером (7 мМ Na 2 HPO 4 , 3 мМ NaH 2 PO 4 и 130 мМ NaCl при рН 7,4). Клетки в биопленке фиксировали метанолом в течение 15 мин, высушивали на воздухе и окрашивали 1% кристаллическим фиолетовым [27]. Образование биопленки количественно оценивали путем измерения поглощения при 595 нм с помощью устройства для считывания микропланшетов (GIO. DE VITA EC, Италия).

    Чтобы оценить способность TQ предотвращать образование биопленки, процент ингибирования биопленки рассчитывали по уравнению [(OD контроль роста _ OD образец)/OD контроль роста] × 100 [6]. Каждый анализ повторяли трижды.

    Минимальная концентрация ингибирования биопленки (MBIC50) была определена как самая низкая концентрация TQ, которая показала 50% ингибирование образования биопленки.

    Оценка метаболической активности биопленки с использованием анализа восстановления ХТТ

    Метаболическую активность клеток в биопленке оценивали с помощью ХТТ -карбоксанилида] в соответствии с методами, описанными ранее [6, 28], которые измеряют восстановление соли тетразолия метаболически активными клетками до окрашенного водорастворимого производного формазана, которое можно легко количественно определить колориметрически.

    Двукратное серийное разведение TQ (конечные концентрации от 0 до 512 мкг/мл) готовили в 96-луночных полистироловых планшетах для тканевых культур, содержащих бульон TSB с 2% глюкозы (масса/объем). Затем чашки инокулировали так же, как описано для анализа кристаллического фиолетового.

    XTT (Sigma-Aldrich, Швейцария) раствор (1 мг/мл) готовили в PBS, стерилизовали фильтрованием и хранили при -80°C. Раствор менадиона (Sigma-Aldrich, Швейцария) (1 мМ) готовили в ацетоне и стерилизовали непосредственно перед каждым анализом.

    После инкубации биопленки сначала пять раз промывали PBS, а затем в каждую предварительно промытую лунку и контрольную лунку добавляли 100 мкл PBS и 12 мкл раствора XTT-менадиона (12,5:1 по объему). Затем планшет инкубировали в течение 3 ч в темноте при 37°С. После инкубации 100 мкл раствора переносили в свежие лунки и измеряли изменение цвета раствора с помощью мультискан-ридера при 492 нм. Затем значения поглощения для контролей вычитали из значений тестируемых лунок, чтобы исключить ложные результаты из-за фоновых помех.

    Процент ингибирования биопленки рассчитывали по уравнению [(контроль роста OD _ образец OD)/контроль роста OD] × 100. Каждый анализ повторяли три раза.

    Методы микроскопии

    Предотвращение образования биопленки с помощью TQ было подтверждено методом микроскопии. Вкратце, штаммам давали возможность расти на предметных стеклах с круглыми крышками (диаметр 1 см), помещенных в 24-луночные полистироловые планшеты (Greiner Bio-One, Франция) с добавлением TQ (0, МИК, 2 × МИК), инкубировали в течение 24 ч при 37°С и окрашивали раствором 1/20 по Гимзе (Sigma, Швейцария) (об/об) в течение 20 мин при комнатной температуре.Кусочки цветного стекла помещали на предметные стекла биопленкой вверх и исследовали с помощью световой микроскопии при увеличении в 100 раз.

    Статистический анализ

    Статистический анализ выполнен с помощью статистического программного обеспечения SPSS v.17.0. Статистические различия и значимость оценивали с помощью одностороннего теста ANOVA и критерия знаковых рангов Уилкоксона, в зависимости от ситуации, для оценки ингибирования биопленки в зависимости от типа штаммов и добавки TQ.

    Leave a Reply

    Добавить комментарий

    Ваш адрес email не будет опубликован.

    2022 © Все права защищены.