Резус фактор определение – 18.Антигены системы резус. Группы системы резус. Клиническое значение. Методы определения антигенов резус и возможные ошибки.

Содержание

Определение резус-фактора

Под определением резус-фактора у пациента подразумевается определение только Rhо(D).Резус-отрицательными считаются лица, у которых RhоD не обнаружен.

В отличие от реципиентов, определение резус-принадлежности крови доноров проводится в два этапа: сначала определяется наличие Rhо(D), а затем, при его отсутствии — rh'(C) и rh»(E).

В число резус отрицательных доноров зачисляются только лица, кровь которых не содержит всех трех доминантных антигенов системы Резус: Rhо(D), rh'(C), rh»(E), то есть имеет фенотип Hro(d), hr'(c), hr»(e).

Поскольку антирезусные антитела обычно бывают неполными, в большинстве способов создаются дополнительные условия, облегчающие реакцию взаимодействия антиген-антитело — коллоидная среда, повышенная температура (см. Приложение).

Разработано несколько реагентов для определения Rh

o(D) фактора. В большинстве случаев эти реагенты лишены групповых антител системы АВО (не имеют групповой специфичности) и называются «универсальными».

До 70-х годов ХХ столетия определение Rhо(D) производилось с помощью«Сывороток антирезус» с групповой специфичностью (антирезусных сывороток). Использование их было весьма неудобным, поскольку необходимо было сначала определить группу крови по системе АВО, а затем подобрать совместимую сыворотку для определения резус-фактора:

Сыворотки антирезус изготовлялись из крови специально отобранных резус-отрицательных доноров, ранее сенсибилизированных к антигену Rh вследствие резус-конфликтных беременностей, переливания резус-положительной крови или специально иммунизированных малыми дозами одногруппной резус-положительной крови.

Поскольку изготовление реагентов для определения резус — принадлежности связано с риском для здоровья (сенсибилизацией) доноров, они не могут выпускаться большими партиями. Кроме того, определение резус-фактора с помощью антирезусных сывороток было длительным (10 мин) и трудоемким (на водяной бане).

В настоящее время в России повсеместно используется определение резус-принадлежности при помощи стандартного универсального реагента,содержащего антирезусную сыворотку группы АВ(IV), которая не содержит естественных агглютининов α и β и коллоидную среду (33% полиглюкин), необходимую для выявления неполных антител.

В целях экономии реагента в лечебных учреждениях первичное определение резус — принадлежности проводится централизовано в отделениях переливания крови или клинических лабораториях. В отделениях лечебных учреждений определение резус — принадлежности выполняется при контрольной проверке Rh- фактора донора (из контейнера с эритроцитами) и реципиента при проведении гемотрансфузий.

Определение резус — принадлежности при помощи стандартного универсального реагента (в пробирках без подогрева).

Реакция с ним происходит быстрее (3 мин), чем с антирезусными сыворотками, поэтому получила название «экспресс -реакции» или «экспресс-метода».

В пробирку вносят по 2 капли (0,1 мл) стандартного универсального реагента антирезус и 1 каплю (0,05 мл) исследуемой крови.

Содержимое пробирки перемешивают встряхиванием и затем медленно поворачивают по оси, наклонив почти до горизонтального положения так, чтобы содержимое растекалось по стенкам.

Через 3 минуты в пробирки добавляют по 2-3 мл изотонического раствора хлорида натрия и перемешивают 2-3-кратным переворачиванием пробирок, не встряхивая. Пробирки просматривают на свет.

При наличии агглютинации и просветлении раствора резус-фактор считают положительным, при отсутствии агглютинации и равномерном розовом окрашивании раствора — отрицательным.

Исследование других антигенов системы Резус проводится теми же способами специальными реагентами, содержащими соответствующие антитела.

Способы определения резус-фактора

Все методы определения резус-фактора делят на способы, применяемые в клинической практике, и лабораторные способы.

Способы определения Rh0(d) в клинической практике

В клинических условиях (в приёмном покое, хирургическом отделении, операционной), где нет специального лабораторного оборудования, используют экспресс-методы определения Rh

o(D) (D-фактора).

Экспресс-метод определения стандартным универсальным реагентом в пробирке без подогрева

Для исследования можно использовать свежую несвернувшуюся кровь, взятую из пальца (или вены) непосредственно перед исследованием, или консервированную кровь без предварительной обработки, а также эритроциты из пробирки после формирования сгустка и отстаивания сыворотки.

Методика проведения реакции. Исследование проводят в центрифужных пробирках объёмом не менее 10 мл. На дно пробирки вносят одну каплю стандартного универсального реагента, представляющего собой антирезусную сыворотку группы АВ(IV), разведённую 33% раствором декстрана (ср. мол. масса 50 000-70 000). Затем в неё добавляют одну каплю исследуемой крови (или эритроцитов). Круговым вращением пробирки содержимое размазывают по её внутренней поверхности таким образом, чтобы содержимое растеклось по стенкам. Это значительно ускоряет агглютинацию и делает её крупнолепестковой. Агглютинация на стенках пробирки наступает, как правило, в течение первой минуты, но для образования устойчивого комплекса антиген-антитело и чёткой агглютинации наблюдать следует не менее 3 мин. Затем для исключения неспецифической агрегации эритроцитов в пробирку добавляют 2-3 мл физиологического раствора и перемешивают путём одно-двукратного перевертывания пробирки (без взбалтывания!).

Трактовка результатов. Наличие агглютинации (крупные хлопья на фоне просветлённой жидкости) указывает на резус-положительную принадлежность исследуемой крови. Отсутствие агглютинации (в пробирке гомогенно окрашенная розовая жидкость) свидетельствует о резус-отрицательной принадлежности исследуемой крови.

Лабораторные способы определения резус-фактора

Для определения резус-принадлежности крови больного в условиях лаборатории применяют четыре основных метода.

Метод агглютинации в солевой среде

Используют специальные сыворотки, содержащие полные антитела анти-резус. Эритроциты в виде 2% взвеси в изотоническом растворе хлорида натрия соединяют в пробирках с антирезусной сывороткой. Пробирки помещают на 1 ч в термостат при температуре 37 °С, после чего осадок эритроцитов на дне пробирки рассматривают с помощью лупы и по его форме учитывают результат. При положительном результате (Rh+)осадок имеет характерный рисунок в виде нитей или зернистости. При отрицательном (Rh) осадок размещается равномерным слоем и имеет вид правильно очерченного круга.

Метод агглютинации в присутствии желатина

B две пробирки помещают по 0,02-0,03 мл осадка исследуемых эритроцитов. Затем в первую пробирку добавляют 2 капли (0,1 мл) 10% раствора желатина и 2 капли (0,1 мл) анти-резусной сыворотки, во вторую (контрольную) пробирку — 2 капли (0,1 мл) 10% раствора желатина и 2 капли (0,1 мл) физиологического раствора.

Содержимое осторожно перемешивают. Затем пробирки инкубируют в термостате при температуре 45-48 °С в течение 30 мин, после чего добавляют 5-8 мл физиологического раствора и переворачивают пробирки 1-2 раза для перемешивания.

Результат учитывают, просматривая пробирки на свет невооружённым глазом или через лупу. Если эритроциты резус-положительны, произойдёт их агглютинация. Отсутствие агглютинации свидетельствует о том, что испытуемая кровь резус-отрицательная. B контрольной пробирке агглютинация эритроцитов должна отсутствовать.

Непрямой антиглобулиновыи тест (реакция Кумбса)

Эта реакция наиболее чувствительна для выявления неполных антител к ауто- и изоантигенам эритроцитов. К ней, как правило, прибегают при возникновении трудностей в определении резус-принадлежности крови, связанных с нечёткими результатами, полученными при других методах исследования. Реакция основана на использовании антиглобулиновой сыворотки.

При обработке резус-положительных эритроцитов неполными антителами анти-Rh наступает их обволакивание, сенсибилизация по отношению к антиглобулиновой сыворотке, которая агглютинирует сенсибилизированные эритроциты, поскольку имеет антитела к глобулинам.

В пробирку вносят антирезусную сыворотку и отмытые физиологическим раствором эритроциты, помещают на 1 ч в термостат при температуре 37 °С, после чего эритроциты тщательно отмывают. Последующий этап реакции проводят на плоскости. Каплю взвеси эритроцитов смешивают с равным количеством антиглобулиновой сыворотки и учитывают результат. Наличие агглютинации — показатель того, что исследуемый образец крови резус-положительный. Если агглютинация отсутствует, то испытуемая кровь резус-отрицательная.

Реакция с анти-D-моноклональными антителами

На планшете смешивают большую каплю (0,1 мл) анти-D-моноклональных антител и маленькую каплю (0,01 мл) исследуемой крови.

За реакцией наблюдают в течение 3 мин. При смешивании анти- D-MKA с образцами резус-положительных эритроцитов отмечают быстро наступающую лепестковую агглютинацию. Если кровь резус-отрицательная, агглютинация отсутствует.

Способы определения резус-фактора

Все методы определения резус-фактора делятся на способы, применяемые в клинике: в условиях приемного покоя, в операционной, на отделении у постели больного и т. д., не требующие специального лабораторного оснащения, и лабораторные способы.

Способы определения резус-фактора в клинике. Используются два так называемых экспресс-метода: экспресс-метод со стандартным универсальным реагентом в пробирке без подогрева. Экспресс-метод на плоскости без подогрева.

Экспресс-метод определения Rh-фактора стандартным универсальным реагентом в пробирке без подогрева.

Для исследования может быть использована свежая несвернувшаяся кровь, взятая из пальца (из вены) непосредственно перед исследованием, или консервированная кровь без предварительной обработки, а также эритроциты из пробирки после формирования сгустка и отстаивания сыворотки.

Методика проведения реакции

Исследование проводят в центрифужных пробирках объемом не менее 10 мл. На дно пробирки вносят одну каплю стандартного универсального реагента, представляющего собой антирезусную сыворотку группы АВ (IV), содержащую 33% раствор полиглюкина. Затем в нее добавляют одну каплю исследуемой крови (или эритроцитов). Круговым вращением пробирки содержимое размазывают но ее внутренней поверхности таким образом, чтобы содержимое растеклось по стенкам. Это значительно ускоряет агглютинацию и делает ее крупнолепестковой. Агглютинация на стенках пробирки наступает, как правило, в течение первой минуты, но для образования устойчивого комплекса «антиген — антитело» и четкой агглютинации наблюдать следует не менее 3 минут. Затем для исключения неспецифической агрегации эритроцитов в пробирку добавляют 2-3 мл физиологического раствора и перемешивают путем одно-двукратного перевертывании пробирки (без взбалтывания!).

Наличие агглютинации (крупные хлопья на фоне просветленной жидкости) указывает на резус-положительную принадлежность исследуемой крови. Отсутствие агглютинации (в пробирке гомогенно окрашенная розовая жидкость) свидетельствует о резус-отрицательной принадлежности.

Лабораторные методы определения резус-фактора

Для определения резус-принадлежности крови больного в условиях лаборатории применяют четыре основных метода.

  1. Метод агглютинации в солевой среде

Используют специальные сыворотки, содержащие полные антитела анти-резус. Эритроциты в виде 2% взвеси в изотоническом растворе хлорида натрия соединяют в пробирках с антирезусной сывороткой. Пробирки помещают на 1 час в термостат при температуре 37°С, после чего осадок эритроцитов на дне пробирки рассматривают с помощью лупы и по его форме учитывают результат. При положительном результате (Rh+) осадок имеет характерный рисунок в виде нитей или зернистости. При отрицательном (Rh-) осадок размещается равномерным слоем и имеет вид правильно очерченного круга.

  1. Метод конглютинации с желатином

В пробирку помещают равные объемы исследуемых эритроцитов, антирезусной сыворотки и 10% раствора желатина. Пробирки инкубируют при температуре 45-48є C, после чего добавляют десятикратный объем физиологического раствора. Пробирки 2-3 раза переворачивают и учитывают результат по наличию агглютинации, видимой невооруженным глазом.

  1. Непрямой антиглобулиновый тест (реакция Кумбса)

Эта реакция является наиболее чувствительной для выявления неполных антител к ауто- и изоантигенам эритроцитов. К ней, как правило, прибегают при возникновении трудностей в определении резус-принадлежности крови, связанных с нечеткими результатами, полученными при других методах исследования. Реакция основана на использовании антиглобулиновой сыворотки (АГС). При обработке резус-положительных эритроцитов неполными антителами анти-Rh наступает их обволакивание (сенсибилизация) по отношению к АГС, которая и агглютинирует сенсибилизированные эритроциты, поскольку имеет антитела к глобулинам.

В пробирку вносят антирезусную сыворотку и отмытые физиологическим раствором эритроциты; помещают на 1 час в термостат при температуре 37°С, после чего эритроциты тщательно отмывают. Последующий этап реакции проводят на плоскости. Каплю взвеси эритроцитов смешивают с равным количеством антиглобулиновой сыворотки и учитывают результат. Наличие агглютинации является показателем того, что исследуемый образец крови резус- положительный. Если агглютинация отсутствует, испытуемая кровь — резус-отрицательная.

  1. Реакция с aнти-D-моноклональными антителами.

На планшете смешивают большую каплю (0,1 мл) анти-D-моноклональных антител (МКА) и маленькую каплю (0,01мл) исследуемой крови. За реакцией наблюдают в течение 2,5 мин. При смешивании анти-D-МКА образцами резус-положительных эритроцитов отмечается быстрое наступающая лепестковая агглютинация. Если кровь резус-отрицательная — агглютинация отсутствует.

Определение резус-фактора Антигенная система резус-фактора

В 1940 г. К. Ландштейнер и А. Винер обнаружили в эритроцитах человека совершенно новый антиген, названный ими резус-фактором (Rh). Резус-фактор присутствует в крови 85% людей, а у 15% отсутствует.

Система антигенов резус представлена пятью основными антигенами: D, C, с, Е, e (ранее считали, что их шесть, но позже было доказано, что аллельного гена d не существует). C и с, а также Е и e — аллельные антигены. Каждая из хромосом несёт только три гена из пяти: D, С или с, Е или е.

Номенклатура Dd, Cc, Ее была предложена Р. Фишером и Р. Рейсом. Другая номенклатура (Rh-Hr) была введена А. Винером. Он обозначил шесть резус-антигенов следующим образом: Rh0(D), rh'(C), rh»(E), Hro(d), hr'(c), hr»(e).

Указанные пять антигенов резус (исключая антиген d) встречают в эритроцитах в виде одного из 18 возможных сочетаний (табл. 6-5). Фенотипически каждый человек содержит 5, 4 или 3 антигена резус в зависимости от количества генов, по которым он гомозиготен. Однако генотипическую формулу изображают шестью буквами, например, cDE/CDe, обозначающими три гена резус, унаследованных с хромосомой одного из родителей, три — с хромосомой другого.

Наиболее активен из всех антигенов Rho(D) — резус-фактор. В зависимости от его наличия или отсутствия кровь людей делят на резус-положительную (Rh+)и резус-отрицательную (Rh).

Иначе подходят к оценке резус-принадлежности доноров. Необходимо дополнительное исследование крови доноров по факторам Е и С. Резус-отрицательными могут быть только доноры, в крови которых отсутствуют все три антигена (D, С, Е). Такой подход к оценке резус-принадлежности доноров позволяет исключить возможность сенсибилизации реципиента к любому из трёх основных антигенов:

Rho(D), rh'(C), rh»(E).

В повседневной практике переливания крови ограничиваются определением у реципиента только антигена Rho(D).

Таблица 6-5. Aнтигенные группы системы резус-фактор (по M.A. Умновой, 1983)

Существует подтип этого антигена Du, отличающийся по структуре и количеству экспрессируемых молекул на строме эритроцитов. Иммуногенность антигена Duзначительно снижена, и выявить его сложнее, чем резус-фактор. Подтип Duимеет существенное значение, так как приводит к синтезу особых антител. Они могут стать причиной развития резус-несовместимости крови донора и реципиента. При наличии Duкровь реципиента считают отрицательной, а кровь донора — положительной.

Aнтигены резус — липопротеиды. Они очень активны и способны вызывать образование иммунных антител. Резус-антитела, будучи иммунными (неполными, моновалентными, блокирующими), могут фиксироваться к резус-положительным эритроцитам, не вызывая их склеивания. Они агглютинируют эритроциты только в присутствии коллоидных растворов, протеолитических ферментов или под действием специально приготовленной антиглобулиновой преципитирующей сыворотки. Неполные антитела относят к иммуноглобулинам класса G.

Наличие резус-антигена выявляют у эмбриона начиная с 5-8-й нед, оно хорошо выражено на сроке гестации 3-4 мес. Существование антигенов системы резус в эритроцитах человека — физиологическое явление, антител к этим антигенам в организме людей с резус-положительными эритроцитами нет. Образование иммунных антител происходит при поступлении в организм человека чужеродного ему изоантигена. У сенсибилизированных людей с резус-отрицательными эритроцитами антитела анти-D содержатся не только в крови, но и в экссудате, транссудате, моче, слезе и других средах.

7. Методы и техника определения групп крови. Резус-фактор, методика его определения. Консервирование и хранение крови

Группы крови— нормальные иммуногенетические признаки крови людей, представляющие собой определенные сочетания групповых изоантигенов (агглютиногенов) в эритроцитах с соответствующими им антителами в плазме. Являются наследственными признаками крови, которые формируются в период эмбриогенеза и не изменяются в течение жизни человека.

    В эритроцитах каждого человека содержатся многочисленные групповые антигены, образующие независимые друг от друга групповые системы, которые состоят из одной или нескольких пар антигенов. Известно более 15 групповых систем крови — АВ0, резус-фактор, Келл, Кидд, Даффи, MNSs и др.

    Для групповой системы АВ0 постоянным признаком является наличие изоантигенов в эритроцитах и нормальных групповых антител (агглютининов) в плазме крови. Для других групповых систем характерно наличие только изоантигенов в эритроцитах; антител к этим изоантигенам в норме не бывает, однако они могут образоваться вследствие изоиммунизации, например при переливании несовместимой крови или в период беременности, если плод унаследовал от отца антиген, отсутствующий у матери. Чаще такая изоиммунизация бывает по отношению к основному антигену резус-фактора — Rh0(D).

    Значение отдельных групп крови в медицинской практике не одинаково; оно определяется наличием или отсутствием групповых антител, частотой групповых антигенов и сравнительной их активностью. Наибольшее значение имеет групповая система АВ0, в которую входят 2 изоантигена, обозначаемые буквами А и В, и два агглютинина — a (анти-А) и b (анти-В). Их соотношения образуют 4 группы крови (табл.).

Таблица Соотношение между изоантигенами в эритроцитах и групповыми антителами в плазме в группах крови по системе АВ0 и частота этих групп среди населения

Группы крови

Изоантигены в эритроцитах

Групповые антитела в плазме

Частота групп крови среди населения в %

0ab(I)

Отсутствуют

a, b

33,5

Аb(II)

А

b

37,8

Вa(II)

В

a

20,5

АВ0(IV)

А и В

Отсутствуют

8,1

Агглютинин a (b) является антителом по отношению к агглютиногену А (В), т. е. он агглютинирует эритроциты, содержащие соответствующий агглютиноген, поэтому одноименные антиген и агглютинин (А и a или В и b) не могут содержаться в крови одного и того же лица.

    Открытие групповой системы АВ0 дало возможность понять такие явления, как совместимость и несовместимость при переливании крови. Под совместимостью понимается биологически совместимое сочетание крови донора и реципиента по антигенам и антителам, что благоприятно сказывается на состоянии последнего. Для обеспечения совместимости требуется, чтобы кровь донора принадлежала к той же группе системы АВ0, что и кровь больного. Переливание крови другой группы при наличии в крови донора группового антигена, против которого в кровяном русле больного имеются антитела, приводит к несовместимости и развитию трансфузионного осложнения. В исключительных случаях допустимо переливание крови группы 0 (I) реципиенту с другой группой крови, но лишь в небольших дозах и только взрослым больным. Это ограничение связано с тем, что в крови группы 0 (I) содержатся a- и b-антитела, которые иногда могут быть очень активными и послужить причиной несовместимости при наличии у реципиента изоантигена А или В.

    На втором месте после системы АВ0 по значению в медицинской практике стоит система резус (Rh—Hr), которая включает 6 основных антигенов, образующих 27 групп крови. Наибольшее значение в трансфузиологии имеет антиген Rhg (D) — основной антиген в резус-факторе.

Насчитывается шесть основных антигенов Р.-ф. Для их обозначения используют две номенклатуры. Согласно первой, антигены Р.-ф. обозначают символами Rh0, rh’, rh”, Hr0, hr’, hr”; согласно второй, используют буквенные обозначения: D, С, Е, d, с, е. Нередко пользуются двумя номенклатурами одновременно. В этом случае символы одного из обозначений помещают в скобки.

Антиген (фактор) Rh0(D) — основной антиген в Р.-ф., имеющий наибольшее практическое значение. Он содержится в эритроцитах 85% людей, проживающих в Европе. Антиген Rh0(D) не является однородным, он включает в себя ряд более мелких субъединиц — RhA, RhB, RhC, RhD. На основании наличия в эритроцитах антигена Rh0(D) выделяют резус-положительную кровь. Кровь людей, эритроциты которых лишены этого антигена, относят к резус-отрицательному типу.

Методики определения групп крови системы АВ0. Определяют Г. к. системы АВ0 с помощью реакции агглютинации эритроцитов. Реакцию проводят при комнатной температуре на фарфоровой или любой другой белой пластинке со смачиваемой поверхностью. При этом необходимо хорошее освещение. Используют следующие реактивы: стандартные сыворотки групп 0ab(I), Аb(II), Вa(III), а также АВ (IV) — контроль; стандартные эритроциты групп А (II), В (III), а также 0 (I) — контроль.

    Для определения Г. к. применяют два способа. Первый способ позволяет с помощью стандартных сывороток установить, какие групповые антигены (А или В) находятся в эритроцитах исследуемой крови и на основании этого сделать заключение о ее групповой принадлежности. Кровь берут из пальца (у грудных детей — из пятки) или вены. На пластинку у предварительно написанных обозначений групп крови [0ab(I), Аb(II), Вa(III) и АВ (IV)] наносят по 0,1мл(по одной большой капле) стандартной сыворотки каждого образца двух разных серий каждой группы так, что образуются два ряда капель. Рядом с каждой каплей стандартной сыворотки пипеткой или стеклянной палочкой наносят по маленькой капле (0,01мл) исследуемой крови. Кровь тщательно перемешивают с сывороткой сухой стеклянной (или пластмассовой) палочкой, после чего пластинку периодически покачивают в течение 5мин,наблюдая за результатом в каждой капле. Наличие агглютинации оценивается как положительная реакция, отсутствие ее — как отрицательная. Для исключения неспецифичности результата по мере наступления агглютинации, но не ранее чем через 3мин в каждую каплю, в которой произошла агглютинация, добавляют одну каплю изотонического раствора хлорида натрия и продолжают наблюдение, покачивая пластинку, в течение 5мин.В тех случаях, когда агглютинация происходит во всех каплях, делают контрольное исследование, смешивая исследуемую кровь с сывороткой группы АВ (IV), которая не содержит антител и не должна вызывать агглютинацию эритроцитов. Если ни в одной из капель не произошло агглютинации, это значит, что исследуемая кровь не содержит групповых агглютиногенов А и В, то есть принадлежит к группе 0 (I). Если сыворотки группы 0ab(I) и Ba(III) вызвали агглютинацию эритроцитов, а сыворотка группы Ab(II) дала отрицательный результат, это означает, что исследуемая кровь содержит агглютиноген А, то есть принадлежит к группе А (II). Если сыворотки группы 0ab(I) и Аb(II) вызвали агглютинацию эритроцитов, а сыворотка группы Вa(III) дала отрицательный результат, из этого следует, что исследуемая кровь содержит изоантиген В, то есть принадлежит к группе В (III). Если сыворотка всех трех групп вызвала агглютинацию эритроцитов, но в контрольной капле с сывороткой группы АВ (IV) реакция отрицательная, это свидетельствует, что исследуемая кровь содержит оба агглютиногена — А и В, то есть принадлежит к группе АВ (IV).

    С помощью второго (перекрестного) способа, при котором одновременно используют стандартные сыворотки и стандартные эритроциты, определяют наличие или отсутствие групповых антигенов и, кроме того, устанавливают наличие или отсутствие групповых антител (a, b), что в итоге дает полную групповую характеристику исследуемой крови. При этом способе кровь берут заранее из вены в пробирку и исследуют после разделения на сыворотку и эритроциты.

    На пластинку у предварительно написанных обозначений, так же как при первом способе, наносят два ряда стандартных сывороток групп 0ab(I), Аb(II), Вa(III) и рядом с каждой каплей исследуемую кровь (эритроциты). Кроме того, на нижнюю часть пластинки наносят в три точки по одной большой капле сыворотки исследуемой крови, а рядом с ними — по одной маленькой капле (0,01мл) стандартных эритроцитов в следующем порядке слева направо: группа 0 (I), А (II) и В (III). Эритроциты группы 0 (I) являются контролем, т.к. они не должны агглютинироваться никакой сывороткой. Во всех каплях сыворотку тщательно смешивают с эритроцитами, наблюдают в течение 5мин при покачивании пластинки и добавлении изотонического раствора хлорида натрия.

    Сначала оценивают результат в каплях со стандартной сывороткой (два верхних ряда) таким же образом, как и при первом способе, затем — результат, полученный в нижнем ряду, т.е. в тех каплях, в которых исследуемая сыворотка смешана со стандартными эритроцитами. Если реакция со стандартными сыворотками свидетельствует о принадлежности крови к группе 0 (I), а сыворотка исследуемой крови агглютинирует эритроциты группы А (II) и В (III) при отрицательной реакции с эритроцитами группы 0 (I), это указывает на наличие в исследуемой группе антител a и b, то есть подтверждает принадлежность ее к группе 0ab(I). Если реакция со стандартными сыворотками выявляет принадлежность крови к группе А (II), а сыворотка испытуемой крови агглютинирует эритроциты группы В (III) при отрицательной реакции с эритроцитами группы 0 (I) и А (II), это говорит о наличии в исследуемой крови антител b, то есть подтверждает принадлежность ее к группе Ab(II), Если реакция со стандартными сыворотками указывает на принадлежность крови к группе В (III), в сыворотка исследуемой крови агглютинирует эритроциты группы А (II) при отрицательной реакции с эритроцитами групп 0 (I) и В (III), это свидетельствует о наличии в исследуемой крови антител a, то есть подтверждает принадлежность ее к группе Вa(III). Бели при реакции со стандартными сыворотками устанавливается принадлежность крови к группе АВ (IV), в сыворотка дает отрицательный результат со стандартными эритроцитами всех трех групп, это указывает на отсутствие групповых антител в исследуемой крове, т. е. подтверждает принадлежность ее к группе АВ (IV).

    К ошибочной оценке результатов может привести неправильный порядок распределения стандартных реактивов и нанесения их на пластинку, несоблюдение времени и температуры при проведении реакции, отсутствие контрольного исследования, загрязнение или применение мокрых пипеток, пластинок, палочек, а также использование недоброкачественных стандартных реактивов, например с истекшим сроком годности или загрязненных.

    Результаты определения Г. к. должны быть записаны лицом, производившим исследование, в установленном порядке в медицинский документ или документ, удостоверяющий личность граждан, с указанием даты и подписью лица, определившего группу крови.

Консервирование и хранение смотри в следующем вопросе…

Определение резус-фактора Антигенная система резус-фактора

В 1940 г. К. Ландштейнер и А. Винер обнаружили в эритроцитах человека совершенно новый антиген, названный ими резус-фактором (Rh). Резус-фактор присутствует в крови 85% людей, а у 15% отсутствует.

Система антигенов резус представлена пятью основными антигенами: D, C, с, Е, e (ранее считали, что их шесть, но позже было доказано, что аллельного гена d не существует). C и с, а также Е и e — аллельные антигены. Каждая из хромосом несёт только три гена из пяти: D, С или с, Е или е.

Номенклатура Dd, Cc, Ее была предложена Р. Фишером и Р. Рейсом. Другая номенклатура (Rh-Hr) была введена А. Винером. Он обозначил шесть резус-антигенов следующим образом: Rh0(D), rh'(C), rh»(E), Hro(d), hr'(c), hr»(e).

Указанные пять антигенов резус (исключая антиген d) встречают в эритроцитах в виде одного из 18 возможных сочетаний (табл. 6-5). Фенотипически каждый человек содержит 5, 4 или 3 антигена резус в зависимости от количества генов, по которым он гомозиготен. Однако генотипическую формулу изображают шестью буквами, например, cDE/CDe, обозначающими три гена резус, унаследованных с хромосомой одного из родителей, три — с хромосомой другого.

Наиболее активен из всех антигенов Rho(D) — резус-фактор. В зависимости от его наличия или отсутствия кровь людей делят на резус-положительную (Rh+)и резус-отрицательную (Rh).

Иначе подходят к оценке резус-принадлежности доноров. Необходимо дополнительное исследование крови доноров по факторам Е и С. Резус-отрицательными могут быть только доноры, в крови которых отсутствуют все три антигена (D, С, Е). Такой подход к оценке резус-принадлежности доноров позволяет исключить возможность сенсибилизации реципиента к любому из трёх основных антигенов:

Rho(D), rh'(C), rh»(E).

В повседневной практике переливания крови ограничиваются определением у реципиента только антигена Rho(D).

Таблица 6-5. Aнтигенные группы системы резус-фактор (по M.A. Умновой, 1983)

Существует подтип этого антигена Du, отличающийся по структуре и количеству экспрессируемых молекул на строме эритроцитов. Иммуногенность антигена Duзначительно снижена, и выявить его сложнее, чем резус-фактор. Подтип Duимеет существенное значение, так как приводит к синтезу особых антител. Они могут стать причиной развития резус-несовместимости крови донора и реципиента. При наличии Duкровь реципиента считают отрицательной, а кровь донора — положительной.

Aнтигены резус — липопротеиды. Они очень активны и способны вызывать образование иммунных антител. Резус-антитела, будучи иммунными (неполными, моновалентными, блокирующими), могут фиксироваться к резус-положительным эритроцитам, не вызывая их склеивания. Они агглютинируют эритроциты только в присутствии коллоидных растворов, протеолитических ферментов или под действием специально приготовленной антиглобулиновой преципитирующей сыворотки. Неполные антитела относят к иммуноглобулинам класса G.

Наличие резус-антигена выявляют у эмбриона начиная с 5-8-й нед, оно хорошо выражено на сроке гестации 3-4 мес. Существование антигенов системы резус в эритроцитах человека — физиологическое явление, антител к этим антигенам в организме людей с резус-положительными эритроцитами нет. Образование иммунных антител происходит при поступлении в организм человека чужеродного ему изоантигена. У сенсибилизированных людей с резус-отрицательными эритроцитами антитела анти-D содержатся не только в крови, но и в экссудате, транссудате, моче, слезе и других средах.

Определение резус-принадлежности.

В повседневной практике определение резус-фактора производится либо с помощью антирезусных сывороток (анти-Д) или моноклональными анти-Д антителами.

Определение резус-фактора антирезусной сывороткой анти-д экспресс-методом (в пробирках без подогрева).

Для проведения данного исследования используется универсальная антирезусная сыворотка для экспресс-метода (анти-Д). Исследуемая кровь берется из пальца или из флакона с консервированной кровью непосредственно перед исследованием. На дно пробирки наносят одну каплю стандартной антирезусной сыворотки для экспресс — метода и добавляют одну каплю исследуемой крови. После чего осторожными движениями добиваются, чтобы образовавшаяся жидкость растекалась по стеклу пробирки. Через 3 минуты после внесения эритроцитов добавляют в пробирку 2-3 мл физиологического раствора. Пробирку осторожно переворачивают 3 раза. Затем читают результат. Наличие глыбок агглютинатов свидетельствует о содержании в эритроцитах резус-фактора. В случае резус-отрицательной крови агглютинация не наблюдается.

Определение резус-фактора с помощью моноклонального реагента (цоликлон анти-d Супер).

На тарелку наносят большую каплю реагента (около 0,1 мл). Рядом помещают маленькую каплю (0,01-0,05 мл) исследуемой крови и смешивают кровь с реагентом. Реакция агглютинации начинает развиваться через 10 — 15 сек., а четко выраженная агглютинация наступает через 30 — 60 сек. Результаты реакции учитывают через 3 мин. Тарелку после смешивания реагента с кровью рекомендуется покачивать не сразу, а через 20 — 30 сек, что позволяет за это время развиться более полной крупнолепестковой агглютинации. Цоликлон анти-D Супер выпускается во флаконах по 2, 5 или 10 мл (1 мл содержит 10 доз). Срок хранения — 1 год в холодильнике при 2-8°С. Вскрытый флакон можно хранить в холодильнике в течение месяца в закрытом виде.

Проба на индивидуальную совместимость крови донора и реципиента по групповому фактору.

Проба на групповую совместимость крови донора и реципиента производится с каждым флаконом, непосредственно перед гемотрансфузией, одновременно с определением группы донора и реципиента при комнатной температуре (от +15о до +25о С). С помощью пробы на групповую совместимость устанавливают наличие или отсутствие в крови реципиента антител, направленных против донорской крови из данного флакона. Природа антител, если они обнаруживаются, этой пробой не устанавливается.

На тарелку наносят сыворотку реципиента, в нее помещают в 10 раз меньшую каплю донорской крови. Результат читают через 5 минут, при наличии агглютинации добавляют каплю физиологического раствора и продолжают наблюдение еще 2 минуты. При отрицательном результате агглютинация не наступает и капля остается равномерно окрашенной в красный цвет. Это означает, что в сыворотке реципиента антитела против эритроцитов донорской крови отсутствуют и противопоказаний к переливанию этой пробой не установлено.

Проба на индивидуальную совместимость крови донора и реципиента по резус-фактору Rho(d)

Эта проба дает возможность выяснить наличие или отсутствие антител системы резус в крови реципиента, направленных против эритроцитов донора. В пробирку помещают 2 капли сыворотки крови реципиента, 1 каплю 33% полиглюкина и 1 каплю донорской крови. в нее в 10 раз меньшую каплю крови донора. Содержимое пробирки перемешивают путем размазывания его по ее стенкам. Через 3 минуты в пробирку добавляют 3 мл физиологического раствора хлорида натрия и после перемешивания читают результат. При положительном результате видна агглютинация эритроцитов, выраженная в большинстве случаев неярко. При отрицательном результате агглютинация не наступает и содержимое остается равномерно окрашенной в розовый цвет. Положительный результат указывает на то, что в сыворотке реципиента содержатся антитела, вызывающие агглютинацию эритроцитов донора. Это значит, что кровь несовместима и ее переливать нельзя. Отрицательный результат — отсутствие агглютинации указывает и на то, что противопоказаний к переливанию данной пробой не выявлено. Постановка пробы на резус-совместимость может в отдельных случаях сопровождаться возникновением ложной реакции — псевдоагглютинации донорских эритроцитов в сыворотке реципиента. Дифференцировать истинную и псевдоагглютинацию можно только при рассмотрении под микроскопом свежеприготовленного мазка. Результат учитывается при малом увеличении микроскопа с окуляром .(х15). Истинная агглютинация дает глыбки агглютинатов в виде «тутовых ягод» или «гроздей винограда». При ложном положительном результате на фоне свободных эритроцитов видны разной длины цепочки эритроцитов, сложившихся в монетные столбики.

Следует помнить: проба на резус-совместимость не заменяет пробы групповой совместимости и ограничиваться ее проведением нельзя. Практика показывает, что в ряде случаев проба на резус-совместимость бывает отрицательной, в то время как на групповую совместимость дает четко положительный результат, что указывает на недопустимость переливания крови этого донора.

Leave a Reply

Добавить комментарий

Ваш адрес email не будет опубликован. Обязательные поля помечены *