Стрептококк mitis: Стрептококк. Симптомы, причины, виды, анализы и лечение стрептококковой инфекции — Детский сад №220 ОАО РЖД

Содержание

Страница статьи : Российский педиатрический журнал

Баранов А.А., Брико Н.И., Намазова-Баранова Л.С., Ряпис Л.А. Стрептококки и пневмококки. Ростов н/Д: Феникс, 2013.

Doern CD, Burnham CA. It’s not easy being green: the viridans group streptococci, with a focus on pediatric clinical manifestations. J Clin Microbiol. 2010; 48(11): 3829-35. doi: 10.1128/JCM.01563-10.

Brenciani A, Tiberi E, Tili E, Mingoia M, Palmieri C, Varaldo PE, et al. Genetic determinants and elements associated with antibiotic resistance in viridans group streptococci. J Antimicrob Chemother. 2014; 69(5): 1197-204. doi: 10.1093/jac/dkt495.

Facklam R. What happened to the streptococci: overview of taxonomic and nomenclature changes. Clin Microbiol Rev. 2002; 15(4): 613-30.

Spellerberg B, Brandt C. Streptococcus. In: Versalovic J, Carroll KC, Funke G, Jorgensen JH, Landry ML and Warnock DW (ed.

), Manual of Clinical Microbiology, 10th ed., ASM Press, Washington, DC, 2011; 331-49.

Póntigo F, Moraga M, Flores SV. Molecular phylogeny and a taxonomic proposal for the genus Streptococcus. Genet Mol Res. 2015; 14(3): 10905-18. doi: 10.4238/2015.

Маянский Н.А., Калакуцкая А.Н., Мотузова О.В., Ломинадзе Г.Г., Крыжановская О.А., Катосова Л.К. MALDI-TOF масс-спектрометрия в рутинной работе микробиологической лаборатории. Вопросы диагностики в педиатрии. 2011; 3(5): 20-5.

Angeletti S, Dicuonzo G, Avola A, Crea F, Dedej E, Vailati F. et al. Viridans Group Streptococci clinical isolates: MALDI-TOF mass spectrometry versus gene sequence-based identification. PLoS One. 2015; 10(3):e0120502. doi: 10.1371/journal.pone.0120502.

Harju I, Lange C, Kostrzewa M, Maier T, Rantakokko-Jalava K, Haanperä M. Improved Differentiation of Streptococcus pneumoniae and Other S. mitis Group Streptococci by MALDI Biotyper Using an Improved MALDI Biotyper Database Content and a Novel Result Interpretation Algorithm. J Clin Microbiol. 2017; 55(3): 914-22. doi: 10.1128/JCM.01990-16.

Su TY, Lee MH, Huang CT, Liu TP, Lu JJ. The clinical impact of patients with bloodstream infection with different groups of Viridans group streptococci by using matrix-assisted laser desorption ionization-time of flight mass spectrometry (MALDI-TOF MS). Medicine (Baltimore). 2018; 97(50):e13607. doi: 10.1097/MD.0000000000013607.

Ioannidou S, Papaparaskevas J, Tassios PT, Foustoukou M, Legakis NJ, Vatopoulos AC. Prevalence and characterization of the mechanisms of macrolide, lincosamide and streptogramin resistance in viridans group streptococci. Int J Antimicrob Agents. 2003; 22(6): 626-9.

Ergin A, Ercis S, Hasçelik G. Macrolide resistance mechanisms and in vitro susceptibility patterns of viridans group streptococci isolated from blood cultures. J Antimicrob Chemother. 2006; 57(1): 139-41.

Chun S, Huh HJ, Lee NY. Species-specific difference in antimicrobial susceptibility among viridans group streptococci. Ann Lab Med. 2015; 35(2): 205-11. doi: 10.3343/alm.2015.35.2.205.

Маянский Н.А., Кварчия А.З., Пономаренко О.А., Лазарева А.В., Куличенко Т.В. Носительство оральных стрептококков, устойчивых к пенициллину и эритромицину, у детей с острыми респираторными инфекциями. Российский педиатрический журнал. 2018; 21(6): 337-44. DOI: http://dx.doi.org/10.18821/1560-9561-2018-21-6-337-44.

Mayanskiy N, Alyabieva N, Ponomarenko O, Pakhomov A, Kulichenko T, Ivanenko A. et al. Bacterial etiology of acute otitis media and characterization of pneumococcal serotypes and genotypes among children in Moscow, Russia. Pediatr Infect Dis J. 2015; 34(3): 255-60. doi: 10.1097/INF.0000000000000554.

CLSI M100 ED29:2019 — Performance Standards for Antimicrobial Susceptibility Testing, 29th Edition.

Маянский Н.

А., Алябьева Н.М., Пономаренко О.А., Куличенко Т.В., Артемова И.В., Лазарева А.В. и др. Динамика распространенности серотипов и антибиотикорезистентности носоглоточных пневмококков, выделенных у детей в 2010-2016 гг.: результаты ретроспективного когортного исследования. Вопросы современной педиатрии. 2017; 16 (5): 413-23. doi: 10.15690/vsp.v16i5.1806).

Rodriguez-Avial I, Rodriguez-Avial C, Culebras E, Picazo JJ. Distribution of tetracycline resistance genes tet(M), tet(O), tet(L) and tet(K) in blood isolates of viridans group streptococci harbouring erm(B) and mef(A) genes. Susceptibility to quinupristin/dalfopristin and linezolid. Int J Antimicrob Agents. 2003; 21(6): 536-41.

Smith A, Jackson MS, Kennedy H. Antimicrobial susceptibility of viridans group streptococcal blood isolates to eight antimicrobial agents. Scand J Infect Dis. 2004; 36(4): 259-63.

Rozkiewicz D, Daniluk T, Sciepuk M, Zaremba ML, Cylwik-Rokicka D, Luczaj-Cepowicz E et al. Prevalence rate and antibiotic susceptibility of oral viridans group streptococci (VGS) in healthy children population. Adv Med Sci. 2006; 51 Suppl 1: 191-5.

Nielsen MJ, Claxton S, Pizer B, Lane S, Cooke RP, Paulus S, Carrol ED. Viridans Group Streptococcal Infections in Children After Chemotherapy or Stem Cell Transplantation: A 10-year Review From a Tertiary Pediatric Hospital. Medicine (Baltimore). 2016; 95(9): e2952. doi: 10.1097/MD.0000000000002952.

Süzük S, Kaşkatepe B, Çetin M. Antimicrobial susceptibility against penicillin, ampicillin and vancomycin of viridans group Streptococcus in oral microbiota of patients at risk of infective endocarditis. Infez Med. 2016; 24(3): 190-3.

Hakenbeck R, Brückner R, Denapaite D, Maurer P. Molecular mechanisms of β-lactam resistance in Streptococcus pneumoniae. Future Microbiol. 2012; 7: 395-410.

Chi F, Nolte O, Bergmann C, Ip M, Hakenbeck R. Crossing the barrier: evolution and spread of a major class of mosaic pbp2x in S. pneumoniae, S. mitis and S oralis. Int J Med Microbiol. 2007; 297: 503-12. https://doi.org/10.1016/j.ijmm.

Jensen A, Valdorsson O, Frimodt-Moller N, Hollingshead S, Kilian M. Commensal streptococci serve as a reservoir for beta-lactam resistance genes in Streptococcus pneumoniae. Antimicrob Agents Chemother.2015; 59: 3529 -40. https://doi.org/10.1128/AAC.00429-15.

Leclercq R. Mechanisms of resistance to macrolides and lincosamides: nature of the resistance elements and their clinical implications. Clin Infect Dis. 2002; 34: 482-92.

Schroeder MR, Stephens DS. Macrolide Resistance in Streptococcus pneumoniae. Front Cell Infect Microbiol. 2016; 6: 98.

van der Linden M, Otten J, Bergmann C, Latorre C, Liñares J, Hakenbeck R. Insight into the Diversity of Penicillin-Binding Protein 2x Alleles and Mutations in Viridans Streptococci. Antimicrob Agents Chemother. 2017; 61(5). pii: e02646-16. doi: 10.1128/AAC.02646-16.

Катосова Л.К., Лазарева А.В., Хохлова Т.А., Пономаренко О.А., Алябьева Н.М. Распространение и механизмы устойчивости к макролидам Streptococcus pyogenes, выделенных у детей. Антибиотики и химиотерапия. 2016; 61(3-4): 23-9.

Shaikh N, Leonard E, Martin JM. Prevalence of streptococcal pharyngitis and streptococcal carriage in children: a meta-analysis. Pediatrics. 2010; 126(3): e557-64. doi: 10.1542/peds.2009-2648.

%PDF-1.6 % 1 0 obj > endobj 4 0 obj /CreationDate (D:20161026120750+03’00’) /Keywords /ModDate (D:20161026120750+03’00’) /Subject >> endobj 2 0 obj > stream application/pdf

  • Актуальные вопросы инфекционной патологии : 6-й съезд инфекционистов Республики Беларусь, Витебск, 29-30 мая 2014 г.
  • УО «ВГМУ»
  • Библиотека УО «ВГМУ»
  • Библиотека УО «ВГМУ»2016-10-26T12:07:50+03:002016-10-26T12:07:50+03:002016-10-26T12:07:50+03:00uuid:be565ded-f683-4456-bdf4-29bb837b3ea0uuid:7a2adc1c-1358-43bf-a6f5-fb555861d302 endstream endobj 3 0 obj > endobj 5 0 obj > /ExtGState > /Font > /ProcSet [/PDF /Text] /XObject > >> /Rotate 0 /TrimBox [0.
    JdSPpȍ/ v D._-_»G`仩Hu Rk}Sms[}nC1)Q=&:sjcF;%\ApwuRre6&unn|y_v

    Стрептококк — это… Что такое Стрептококк?

    Стрептококк
    Научная классификация
    Класс:  Бациллы
    Порядок:  Lactobacillales
    Семейство:  Streptococcaceae
    Род:  Стрептококк
    Международное научное название

    Streptococcus Rosenbach, 1884

    Типовой вид
    Виды
    • Streptococcus agalactiae
    • Streptococcus anginosus
    • Streptococcus bovis
    • Streptococcus canis
    • Streptococcus constellatus
    • Streptococcus dysgalactiae
    • Streptococcus equi
    • Streptococcus equinus
    • Streptococcus iniae
    • Streptococcus intermedius
    • Streptococcus mitis
    • Streptococcus mutans
    • Streptococcus oralis
    • Streptococcus parasanguinis
    • Streptococcus peroris
    • Streptococcus pneumoniae
    • Streptococcus pyogenestypus
    • Streptococcus ratti
    • Streptococcus salivarius
    • Streptococcus thermophilus
    • Streptococcus sanguinis
    • Streptococcus sobrinus
    • Streptococcus suis
    • Streptococcus uberis
    • Streptococcus vestibularis
    • Streptococcus viridans
    • Streptococcus zooepidemicus

    Стрептококк (лат.  Streptococcus) — род шаровидных или овоидных аспорогенных грамположительных хемоорганотрофных факультативно-анаэробных бактерий из семейства Streptococcaceae. Паразиты животных и человека. Обитают в дыхательных и пищеварительных путях, особенно в полости рта, носа, в толстом кишечнике.

    Структура

    Отношение суммы гуанина и цитозина к общему весу оснований в молекуле ДНК равен 33—42 мол%. Типичные клетки менее 1 мкм в диаметре, располагаются попарно или цепочками, неподвижны, кроме штаммов группы D. Образуют капсулу, легко превращаются в L-форму. Питательные потребности сложные. Обычно растут на средах с добавлением крови, сыворотки крови, асцитической жидкости, углеводов. Температурный оптимум — 37°, pH 7,2-7,4. На плотных средах формируют мелкие плоские сероватые колонии, на жидких средах дают крошковатый пристеночный и придонный рост, на кровяном агаре — зоны альфа- или бетагемолиза. Встречаются и негемолитические штаммы. Ферментируют углеводы с образованием кислоты, расщепляют аминокислоты (аргинин, серин). Представители групп В и D продуцируют пигменты красного и желтого цвета. На питательных средах и в организме хозяина синтезируют внеклеточные стрептодорназу, стрептолизины, стрептокиназу, лейкоцидин, бактериоцины. Генетический обмен происходит трансформацией и трансдукцией, но не конъюгацией. Стрептококки погибают при пастеризации и действии рабочих растворов многих дезинфектантов, антисептиков, они чувствительны к пенициллину, тетрациклинам, аминогликозидам и др. препаратам. Устойчивость вырабатывается медленно.

    Принята классификация рода на основании специфического полисахарида С и поверхностных антигенов белковой природы (по Р. Лендсфилд). По С-полисахариду выделяют серогруппы A, В, С, D … О. Экстракты С-полисахарида получают автоклавированием культуры при 1,1 атм 15 мин, обработкой её горячей соляной кислотой, азотной кислотой, формамидом, пепсином, трипсином. Серологическая специфичность связана с аминосахарами. У S. группы А, дающих матовые или слизистые колонии, на поверхности находится М-белок, который детерминирует типовую специфичность. В группе А по этому признаку выделяют 55 варов, определяемых с помощью реакции агглютинации или реакции преципитации с типоспецифическими сыворотками. М-белок обладает актифагоцитарной активностью, выраженными протективными свойствами. Вспомогательную роль в дифференциации играют также поверхностные Т и R антигены. Т-антиген термолабилен, устойчив к пепсину, трипсину и кислотам.

    Виды стрептококков

    • Streptococcus pyogenes (прежнее название Streptococcus haemolyticus) — бета-гемолитические стрептококки группы А. Диаметр клеток — 0,6—1 мкм, многие штаммы образуют капсулу. Капсульные штаммы растут в виде слизистых колоний, при стоянии переходящих в матовые; бескапсульные штаммы формируют блестящие глянцевидные колонии. Не растут при 10 и 45°, в бульоне с 6,5 % хлорида натрия, при рН 9,6, в молоке с 0,1 % метиленового синего. Ферментируют глюкозу, лактозу, сахарозу, салицин, трегалозу, не ферментируют инулин, сорбит, глицерин, гиппурат натрия. Большинство штаммов продуцируют стрептолизины, стрептокиназу, стрептодорназу, некоторые — эритрогенный токсин. Обитают у человека в глотке в норме и могут вызывать различные заболевания;
    • 2) Streptococcus pneumoniae — объединяют в группу пневмококковых инфекций. Возбудитель представляет собой кокки с вытянутым полюсом, располагаются попарно или короткими цепочками, неподвижны, спор не формируют, при обитании в организме образуют капсулу, хемоорганотрофы, факультативные анаэробы. Паразит дыхательных путей человека. Встречается в норме при различных заболеваниях. Вызывает острые пневмонии и бронхит у детей и взрослых;
    • 3—4) Streptococcus faecalis, Streptococcus faecies — стрептококк группы D, которые обычно объединяются в группу энтерококков, вызывают септические процессы;
    • 5—8) Streptococcus sanguis, Streptococcus salivarius, Streptococcus mitis, Streptococcus mutans — гемолитические и негемолитические стрептококки различных серогрупп, продуцирующие полисахариды и принимающие участие в образовании зубных бляшек, предполагается их этиологическая роль при кариесе;
    • 9) Streptococcus lactis (переведен в род Lactococcus) — молочнокислый стрептококк, молочнокислая бактерия.

    Заболевания, вызываемые стрептококками

    См. также

    Литература

    • Красильников А.П. Микробиологический словарь-справочник. — Мн: «Беларусь», 1986. — С. 288-289.

    Примечания

    Мікрофлора ротової порожнини

    Наименование микроорганизмов

    Норма м/о

    Пограничная зона

    Дисбактериоз

    Нормальная микрофлора

    Зеленящие стрептококки:

    Str.mitis

    106-108

    104-105

    103-0

    Негемолитический стрептококк: S. angemolyticus

    106-108

    104-105

    103-0

    Непатогенные нейссерии (Neisseria)

    105-107

    103-104

    <103-0

    Факультативная флора

    β-гемолитические стрептококки: Str.pyogenesStr. anginosus

    0-103

    104-105

    106-108

    Рневмококк:Str.pneumoniae

    0-103

    104-105

    106-108

    Гемофилы:Haemophilus

    0-103

    104-105

    106-108

    Staphylococcus aureus

    0-103

    104-105

    106-108

    Staphylococcus epidermidis

    0-103

    104-105

    106-108

    Staphylococcus saprophyticus

    0-101

    103-105

    <105

    Corinebacteriumкоринебактерии

    0-103

    104-105

    106-107

    НГОБ: AcinetobacterPseudomonas идр.

    0

    0

    101-103

    Moraxella

    0-103

    104-105

    106-108

    Энтеробактерии:

    Escherichia coli

    Klebsiella

    Citrobacter

    Enterobacter

    Serratia

    Morganella и др.

    0

    0

    101-103

    Enterococcus

    Энтерококки

    0

    0

    101-103

    Грибы рода Candida

    0-101

    102-103

    <103

    Анализ на стрептококк группы В, Streptococcus agalactiae, посев с антибиотикограммой

    Общая характеристика

    Стрептококк группы В (СГВ, GBS, Streptococcus agalactiae) — это грамположительная бактерия (кокк), которая в организме человека может колонизировать ротоглотку, анальную область прямой кишки, влагалище (чаще преддверие влагалища), урогенитальный тракт, кожу. СГВ является комменсалом микробиоты кишечника человека.
    СГВ вызывает тяжело протекающие заболевания у новорожденных детей — ранние неонатальные инфекции, такие как сепсис, менингит, пневмония, остеомиелит, артрит и пиелонефрит, частота которых в разных странах колеблется от 0,2 до 5 и более на 1000 живорожденных детей и поздние неонатальные инфекции. СГВ представляет опасность и для определенных пациентов других возрастных групп. В акушерской практике со стрептококком группы В связывают бактериемию, инфекции мочевых путей, хориоамнионит, преждевременное излитие околоплодных вод, преждевременные роды, послеродовой эндометрит и др.

    Показания для назначения

    1. Пренатальный скрининг 35-37 недель
    2. При проведении дифференциальной диагностики:
    Кожа / мягкие ткани
    • Целлюлит
    • Диабетическая инфекция стопы
    • Инфицированная рана
    • Некротический фасциит
    Системные симптомы
    • Менингит
    • Сепсис (неонатальный, материнский)
    • Остеомиелит
    • Бактериальная пневмония
    • Септический артрит
    • Инфекционный эндокардит
    • Эпидуральный абсцесс
    Беременность
    • Инфекции мочевых путей, женщины
    • Хориоамнионит

    Маркер

    Маркер заболеваний, вызванных СГВ

    Клиническая значимость

    1. При выявлении СГВ у беременной в 35-37 недель рекомендовано проводить антибиотикопрофилактику с началом родовой деятельности.
    Предупреждение ранней заболеваемости новорожденного СГВ возможно:
    — В 89% случаев, если первая доза антибиотикопрофилактики была дана за 2 часа до рождения ребенка;
    — В 72% случаев, если первая доза антибиотикопрофилактики была дана менее чем за 2 часа до рождения ребенка, или интранатально была лихорадка

    2.В случае выявления СГВ при проведении дифференциальной диагностики, назначение антибиотиков с учетом их чувствительности к возбудителю.


    Состав показателей:

    Определение стрептокока группы В (Streptococcus agalactiae) с чувствительностью к антибиотикам
    Метод: Микробиологический
    Диапазон измерений: 0-0

    Референтные значения:

    Возраст

    Комментарии

    Выполнение возможно на биоматериалах:

    Биологический материал

    Условия доставки

    Контейнер

    Объем

    соскоб из вагины и ректума

    Условия доставки:

    48 час. при температуре от 20 до 25 градусов Цельсия

    Контейнер:

    Гелевая транспортная среда Amis (Женская)

    Правила подготовки пациента

    Стандартные условия подготовки (если иное не определено врачом): За 24 часа Прекратить прием местных антибактериальных и антисептических препаратов. Непосредственно перед обследованием не проводить туалет наружных половых органов.

    Вы можете добавить данное исследование в корзину на этой странице

    Интерпретация:

    • Пренатальный скрининг в сроке 35-37 недель проводится с целью выявления инфицированных беременных на стрептококк группы В (СГВ) для определения необходимости проведения в / в антибиотикопрофилактики с началом родовой деятельности, позволяет предупредить неонатальные осложнения (сепсис, пневмония и менингит новорожденных).
    • Стрептококк группы В не обнаружен при проведении пренетального скрининга в сроке 35-37 недель и отсутствуют акушерские фаторы риска — нет показаний к проведению антибиотикопрофилактики с началом родовой деятельности.

    Стрептококк Митис / Streptococcus Mitis in русском — Товар

  • Безопасно ли управлять или эксплуатировать тяжелую технику при использовании этого продукта?

    Если вы чувствуете сонливость, головокружение, гипотонию или головную боль при приеме Стрептококк Митис / Streptococcus Mitis, то вам, возможно, стоит отказаться от управления автомобилем и тяжелым промышленным оборудованием. Вы должны отказаться от управления автомобилем, если прием препарата вызывает у вас сонливость, головокружение или гипотонию. Врачи рекомендуют отказаться от употребления алкоголя с такими препаратами, т.к. алкоголь значительно усиливает побочные эффекты и сонливость. Пожалуйста, проверьте реакцию вашего организма при приеме Стрептококк Митис / Streptococcus Mitis. Обязательно обратитесь к вашему лечащему врачу для получения консультаций с учетом особенностей вашего организма и общего состояния здоровья.

  • Вызывает ли данный медикамент (товар) привыкание или зависимость?

    Большинство препаратов не вызывают привыкания или зависимости. В большинстве случаев государство относит препараты, которые могут вызвать привыкание, к препаратам контролируемого отпуска. Например, график H или X в Индии и график II-V в США. Пожалуйста, изучите информацию на упаковке препарата, чтобы убедиться, что данный препарат не относится к категории контролируемых. Кроме того, не занимайтесь самолечением и не приучайте ваш организм к медикаментам без консультации с вашим лечащим врачом.

  • Могу ли я немедленно прекратить использование этого продукта или мне нужно медленно отменить его использование?

    Прием некоторых препаратов необходимо прекращать постепенно из-за наличия эффекта восстановления. Обязательно обратитесь к вашему лечащему врачу для получения консультаций с учетом особенностей вашего организма, общего состояния здоровья и других медицинских препаратов, которые вы принимаете.

  • Стрептококковый агар

    Mitis Salivarius Agar
    Стрептококковый агар

    M259

     

    Эту среду рекомендуют для выделения из смешанных культур стрептококков, особенно Streptococcus mitis, Streptococcus salivarius, Enterococcus faecalis, которые дают на кровяном агаре альфа-гемолиз или относятся к негемолитическим.
     

     

    Рост Streptococcus mitis на стрептококковом агаре (M259)

     

     

    Состав**:

    Ингредиенты

    грамм/литр

    Гидролизат казеина

    15,00

    Пептический перевар животной ткани

    5,00

    Глюкоза

    1,00

    Сахароза

    50,00

    Калия гидрофосфат

    4,00

    Трипановый синий

    0,075

    Кристаллический фиолетовый

    0,0008

    Агар-агар

    15,00

    Конечное значение рН (при 25°С) 7,0 ± 0,2

     

    ** Состав выверен и доведен до соответствия необходимым параметрам

    Приготовление:

    Размешать 90,0 г порошка в 1000 мл дистиллированной воды. Прокипятить для полного растворения частиц. Разлить в соответствующие емкости. Стерилизовать автоклавированием при 1,1 атм (121°С) в течение 15 мин. Остудить до 50-55°С и асептично добавить 1 мл 1%-ного раствора теллурита калия (FD052). После добавления теллурита калия НЕ НАГРЕВАТЬ СРЕДУ.

    Принцип и оценка результата:

    Эта среда готовится по прописи Чепмен (1) для выделения из смешанных культур стрептококков, которые дают альфа-гемолиз или относятся к негемолитическим. На этой высокоселективной среде (при добавлении 1% теллурита калия) можно выделять стрептококки из обильно контаминированного материала, например, различных экссудатов, фекалий и пр. На ней подавляется рост широкого круга бактерий. Некоторые авторы для подавления роста таких грамотрицательных бактерий, как протеи, рекомендуют использовать азид натрия (2).

    Гидролизат казеина и пептический перевар животной ткани служат источником азотистых питательных веществ (аминокислот, пептидов), витамина В1, микроэлементов и других веществ, необходимых для роста микроорганизмов. Глюкоза и сахароза являются источником ферментируемых углеводов. Фосфат обеспечивает буферные свойства среды. Трипановый синий является кислым синим диазокрасителем, кристаллический фиолетовый – щелочным красителем и бактериостатическим средством, которое подавляет рост многих грамположительных микроорганизмов.

    Контроль качества:

    Внешний вид порошка:

    Гомогенный сыпучий порошок светло-голубого цвета.

    Плотность готовой среды:

    Образуется среда, соответствующая по плотности 1,5%-ному агаровому гелю.

    Цвет и прозрачность готовой среды:

    Среда имеет темно-синюю окраску, прозрачна или слегка опалесцирует, если в чашках Петри формируется гель.

    Кислотность среды:

    При 25°С водный раствор (9,0 вес/об) имеет рН 7,0 ± 0,2.

    Культуральные свойства:

    Ростовые характеристики референс-штаммов через 18-48 ч при 35-37°С.

    Штаммы микроорганизмов (АТСС)

    Рост

    Цвет колоний

    Streptococcus pyogenes (19615)

    Хороший
    или обильный

    Синий

    Streptococcus mitis (9895)

    Хороший
    или обильный

    Синий

    Streptococcus salivarius

    Хороший
    или обильный

    Голубой

    Escherichia coli (25922)

    Подавляется

    Staphylococcus aureus (25923)

    Подавляется

    Ссылки:

    1. Chapman, 1946, Am. J. Digestive Diseases, 13 : 105.
    2. Snyder and Lichstein, 1940, J. Infect. Dis., 67 : 113.
    3. Lichstein and Snyder, 1941, J. Bact., 42 : 653.

    Условия и сроки хранения:

    Порошок хранить при температуре ниже +25°С. Использовать до даты, указанной на этикетке. Готовую среду хранить при температуре +2…8°С.

     

    Необычный возбудитель инфекции мочевыводящих путей

    Дж. Врачи лаборатории. 2013 июль-декабрь; 5 (2): 144–145.

    Бичитрананда Суэйн

    Отделение микробиологии, Институт медицинских наук и Госпиталь SUM, Университет Сикша О Анусандхан (S ”O” A), Бхубанешвар, Одиша, Индия

    Сарита Отта

    Отдел микробиологии, Институт медицинских наук и Больница SUM, Университет Сикша О Анусандхана (S ”O” A), Бхубанешвар, Одиша, Индия

    Отделение микробиологии, Институт медицинских наук и больница SUM, Университет Сикша О Анусандхана (S ”O” A), Бхубанешвар, Одиша, Индия

    Авторские права: © Журнал лабораторных врачей

    Это статья в открытом доступе, распространяемая в соответствии с условиями Creative Commons Attribution-Noncommercial-Share Alike 3. 0 Unported, что разрешает неограниченное использование, распространение и воспроизведение на любом носителе при условии правильного цитирования оригинальной работы.

    Эта статья цитируется в других статьях в PMC.

    Sir,

    Инфекция мочевыводящих путей (ИМП) — одна из частых бактериальных инфекций, наблюдаемых в клинической практике, и обычно вызывается членами семейства Enterobacteriaceae, в частности Escherichia coli и грамположительными кокками, такими как Enterococcus spp . и Staphylococcus spp .[1] Но мы столкнулись со случаем ИМП, вызванной необычным патогеном — Streptococcus mitis , членом группы Streptococci (VGS) viridans. 55-летняя женщина с диабетом обратилась в гинекологическое отделение нашей больницы с периодическим жгучим мочеиспусканием, субфебрильной температурой и болями в нижней части живота с одного месяца. В связи с этим она эмпирически лечилась ципрофлоксацином, но без улучшения. При осмотре у нее было обнаружено уретроцеле, из-за которого затруднялось опорожнение мочевого пузыря, что привело к циститу. У нее был диабет, вирус иммунодефицита человека (ВИЧ) серо-отрицательный, ее гематологические и биохимические показатели были в пределах нормы, за исключением нейтрофильного лейкоцитоза. Микроскопическое исследование ее образцов мочи в течение двух дней подряд выявило большое количество гноя и следы альбумина, в то время как аэробная культура обоих образцов показала значительный рост бактерий (количество колоний> 10 5 КОЕ / мл) на агаре CLED. Изолированные организмы представляли собой грамположительные кокки, в основном цепочечные, каталазно-отрицательные, желчные эскулин-отрицательные даже через 48 часов, не показали роста на питательном агаре и были негемолитическими на 5% агаре с овечьей кровью.Эта бактерия была далее идентифицирована как S. mitis системой VITEK-2 с GP-67card. Изолят был чувствителен к амоксициллин-клавулановой кислоте, цефтриаксону, гентамицину и ванкомицину, но устойчив к ампициллину, азитромицину, ципрофлоксацину и офлоксацину. Перед выдачей результатов чувствительности была проведена перекрестная проверка с помощью полосок Hicomb MIC. Пациент успешно лечился амоксициллин-клавулановой кислотой в течение одной недели вместе с физиотерапией. Хотя VGS является известным комменсальным организмом в слизистой оболочке ротовой полости, верхних дыхательных путей, женских половых путей и желудочно-кишечного тракта; Документально подтверждено, что он является частой причиной эндокардита, менингита, пневмонии и бактериемии, особенно у пациентов с иммунодепрессивными состояниями.[2,3] Время от времени поступают сообщения о мочеполовой инфекции, вызванной VGS, но ИМП, вызванная S. mitis , встречается редко. [4] В нашем случае факторами риска этой инфекции были диабет и уретроцеле. Пациент не имел симптомов после надлежащего лечения антибиотиками и контроля уровня сахара в крови. Хотя секвенирование гена 16S рРНК является самым надежным методом идентификации S. mitis , система VITEK-2 также является одним из важных помощников в условиях нехватки ресурсов. Таким образом, изоляция и знание S.mitis как возбудитель ИМП поможет избежать неправильного распознавания его как простого контаминанта и обеспечить соответствующее лечение.

    СПРАВОЧНАЯ ИНФОРМАЦИЯ

    1. Warren JW. Клинические проявления и эпидемиология инфекции мочевыводящих путей. В: Mobley HL, Warren JW, редакторы. Инфекции мочевыводящих путей — молекулярный патогенез и клиническое ведение. Вашингтон, округ Колумбия: Американское общество микробиологии Press; 1996. С. 3–27. [Google Scholar] 2. Дуглас К.В., Хит Дж., Хэмптон К.К., Престон Ф.И. Идентичность стрептококков viridans, выделенных при инфекционном эндокардите.J Med Microbiol. 1993; 39: 179–82. [PubMed] [Google Scholar] 3. Westling K, Ljungman P, Thalme A, Julander I. Streptococcus viridans septicemia: сравнительное исследование у пациентов, поступивших в отделения инфекционных болезней и гематологии университетской больницы. Scand J Infect Dis. 2002; 34: 316–9. [PubMed] [Google Scholar] 4. Чжоу Ю.С., Хорнг К.Т., Хуанг Х.С., Ху СК, Чен Дж.Т., Цай М.Л. Реактивный артрит, вызванный инфекцией мочевыводящих путей Streptococcus viridians . Ocul Immunol Inflamm.2010; 18: 52–3. [PubMed] [Google Scholar]

    Streptococcus Mitis — обзор

    ДЫХАТЕЛЬНЫЙ ПУТЬ

    Рот и ротоглотка содержат несколько уникальных мест обитания микробов. Виридансные (альфа-гемолитические и негемолитические) стрептококки являются наиболее известными комменсалами и включают S. mutans, S. sanguis , S. salivarius , Streptococcus milleri и Streptococcus mitis . 97, 138, 159 Флора десневой щели включает разнообразную коллекцию факультативных и анаэробных организмов.Более распространенные изоляты включают S . mitis, S. mutans, Actinomyces, Fusobacterium, Treponema, Veillonella и Peptostreptococcus . Bacteroides spp., S. sanguis и S. mitis являются первыми колонизаторами поверхности зуба. Зубной налет образуется, когда S. mutans и Actinomyces, Fusobacterium, Treponema и Veillonella spp. Вместе с другими организмами прикрепляются к начальному слою бактериальных клеток и друг к другу. 127, 180 Слизистая оболочка щек, язык и слюна наиболее сильно заселены S . salivarius, S. mitis и Veillonella, Gemella, Granulicatella и Lactobacillus spp. 1 Уровень бессимптомного глоточного носительства стрептококков группы А у детей колеблется от 3 до 50 процентов, причем самые высокие показатели распространенности связаны со вспышками фарингита в школе. 35, 45, 53, 78, 130, 154, 157, 7, 182

    По сравнению с флорой ротовой полости и ротоглотки микробная флора нос и носоглотка менее разнообразны.Коагулазонегативные стафилококки, viridans streptococci, Corynebacterium spp. И S. aureus являются наиболее распространенными изолированными штаммами. Носовые ставки S . aureus в среднем от 20 до 35 процентов, а распространенность метициллин-устойчивого S . aureus носовая колонизация увеличивается, оцениваясь в диапазоне от 0,2 до 22 процентов, в зависимости от демографических характеристик. 2, 3, 31, 77, 85, 98, 150 158, 170 Колонизация детей Neisseria, Haemophilus, Moraxella spp., и S. pneumoniae — обычное явление.

    Пневмококковая колонизация носоглотки обычно носит временный характер и в среднем длится от 1 до 4 месяцев. 51, 66 Рост колонизации наблюдается с возрастом, перенаселенностью, посещением детских садов, зимним сезоном и воздействием табачного дыма. Частота носоглоточного носительства S. pneumoniae в среднем составляет от 40 до 50 процентов у детей и от 20 до 30 процентов у взрослых. 59 Колонизация носоглотки происходит даже при введении пневмококковой белковой конъюгированной вакцины; несколько исследований указывают на изменение распределения серотипов с увеличением присутствия штаммов, устойчивых к лекарствам. 54, 83, 86 Несмотря на присутствие потенциальных патогенов в носоглотке, нет убедительных доказательств, подтверждающих использование посевов из носоглотки для прогнозирования этиологии острого среднего отита, пневмонии или синусита. 58, 173

    Пазухи и нижние дыхательные пути обычно считаются стерильными. На самом деле бактерии изо рта и носа, вероятно, достигают этих областей ежедневно, но быстро уничтожаются местными защитными механизмами. 138

    В течение первой недели жизни ротоглотка новорожденного обычно заселяется материнской вагинальной флорой, в первую очередь Lactobacillus spp. и Streptococcus viridans . 28, 119 Эти бактерии постепенно замещаются флорой ротовой полости матери и опекунов. S . salivarius и S . преобладают мититы . Анаэробы, S . mutans и S . sanguis — необычные находки до прорезывания зубов. 97 Уреаплазма spp. и Mycoplasma spp. из материнского влагалища легко колонизируют дыхательные пути новорожденного. 160 Они являются предполагаемой, но еще не установленной причиной хронических заболеваний легких у недоношенных детей. 75, 124, 176 Кишечные палочки могут быть извлечены из глотки более чем у половины здоровых младенцев старше 2 месяцев. 7

    Streptococcus Mitis, Бактериемия и эндокардит: ранний Si…: Официальный журнал Американского колледжа гастроэнтерологии

    Тезисы: ПРИНЯТО: КЛИНИЧЕСКИЕ ВИГНЕТТЫ / СЛУЧАЙНЫЕ СЛУЧАИ — КОЛОН

    Sharma, Anuj MD 1 ; Masood, Umair MD 1 ; Kahlon, Arunpreet MBBS 2 ; Pattar, Sundeep MD 3 ; Икбал, Шайган, MD 1

    Информация об авторе

    1. Медицинский университет штата Нью-Йорк, штат Нью-Йорк, Сиракузы, штат Нью-Йорк;

    2.Медицинский центр государственного университета Нью-Йорка, Сиракузы, штат Нью-Йорк;

    3. Госпиталь при университете штата Нью-Йорк, Сиракузы, штат Нью-Йорк.

    Streptococcus Mitis — нормальный обитатель флоры ротовой полости и желудочно-кишечного тракта человека. Аденокарцинома толстой кишки при бактериемии / эндокардите Streptococcus bovis или Streptococcus viridians является хорошо известным явлением. Однако ассоциация других видов стрептококков с аденокарциномой толстой кишки встречается не так часто.Это особенно важно там, где бактериемия и эндокардит таких видов могут указывать на ранние признаки рака толстой кишки, наблюдаемые у нашего пациента. Женщина 69 лет с историей болезни остеоартрита и застойной сердечной недостаточности обратилась с основной жалобой на общее недомогание, которое длилось в течение месяца. Сопутствующие симптомы включали перемежающуюся лихорадку и озноб. При поступлении обнаружен сепсис. Сделан рентген грудной клетки по поводу пневмонии. Были получены культуры крови, на которых вырос стрептококк.При физикальном обследовании у пациента был отмечен систолический шум 4/6 степени. Учитывая бактериемию и новый шум, пациенту была проведена чрескожная хирургия, которая показала вегетацию митрального клапана, имеющую отношение к эндокардиту. В дальнейшем пациенту была проведена колоноскопия для определения этиологии стрептококкового митита. Колоноскопия выявила множественные полипы (23), были выполнены полипэктомии. Биопсия показала множественную зубчатую аденому и тубуловиллезную аденому. Пациенту был назначен шестинедельный курс пенициллина с исчезновением бактериемии и вегатацией при контрольной ТЭЭ.Бактериемия Streptococcus mitis — одно из редких проявлений аденокарциномы толстой кишки. Хотя взаимосвязь между стрептококковыми виридианами, такими как бактериемия и аденокарцинома толстой кишки, хорошо известна, она не часто связана с ранними предраковыми полипами толстой кишки. Трудно прокомментировать точную степень, природу и основу этой связи, но можно с уверенностью предположить, что стрептококковая виридиоподобная бактериемия демонстрирует умеренную связь с доброкачественным поражением кишечника, одновременно демонстрируя сильную связь со злокачественным заболеванием кишечника. .Независимо от характера поражения, мы рекомендуем пациентам, у которых развивается бактериемия, вызванная стрептококком, пройти скрининговую колоноскопию для определения основной этиологии.

    © Американский колледж гастроэнтерологии, 2016. Все права защищены.

    Streptococcus mitis Хориоамнионит после удаления зубного камня и орального секса

    Предпосылки . Постулируется, что оральный секс является фактором риска попадания бактерий в амниотическую полость. Распространенные ротоглоточные бактерии были причастны к сообщениям о хориоамнионите во втором триместре через восходящую вагинальную передачу после орального секса. Удаление зубного камня также может привести к попаданию этих патогенов в кровоток, что способствует гематогенному распространению оральных патогенов в фетоплацентарное отделение у беременных пациенток. Корпус . Мы сообщаем о случае хориоамнионита Streptococcus mitis на 21 неделе и 5 днях беременности у пациентки, единственными факторами риска которой были недавнее удаление зубного камня и недавний оральный секс с партнером, у которого, как известно, имеется заболевание пародонта. Заключение . Бактериальный хориоамнионит следует учитывать при дифференциальной диагностике преждевременных родов.Оральный секс и стоматологические процедуры могут быть факторами риска хориоамнионита.

    1. Введение

    Streptococcus mitis ( S. mitis ), стрептококк группы viridans, представляет собой нормальную микрофлору ротоглотки человека. Для большинства людей S. mitis имеет доброкачественный характер. Однако он может вызывать множество инфекций, от кариеса зубов до бактериального инфекционного эндокардита, бактериемии, менингита, глазных инфекций и пневмонии [1].

    Наличие с.Mitis при хориоамнионите редко упоминается в литературе. Гематогенное распространение, ятрогенное введение через амниоцентез и восходящая вагинальная передача — все это были постулированы как потенциальные механизмы. Есть только один случай, который продемонстрировал связь между оральным сексом, хориоамнионитом и видами стрептококков viridans, выделенными из околоплодных вод, полученных амниоцентезом [2]. В этом случае посевы плодных и материнских поверхностей плаценты не проводились и плацента не подвергалась патологии.

    Другие бактерии полости рта также могут быть причиной хориоамнионита. Четыре таких случая указывают на тесную временную связь между восприимчивым оральным сексом и хориоамнионитом [3–6]. Хотя гематогенное распространение вполне вероятно, не было зарегистрировано случаев хориоамнионита, вызванного бактериями полости рта после удаления зубного камня.

    2. Случай

    43-летняя женщина, беременность 4, параграф 3, поступила с активными преждевременными родами на 21 неделе и 5 днях беременности. Шейка матки была расширена на 4-5 см, амниотический мешок выпирал во влагалище.Мембраны не разорваны. У нее была лихорадка без каких-либо инфекционных симптомов.

    Она родила мальчика примерно через 9 часов после начала схваток. Младенец весил 510 граммов и умер примерно через 1 час после родов. Неонатолог оценил состояние новорожденного в послеродовом периоде и определил, что он соответствует гестационному возрасту примерно 22 недели.

    Ее дородовой анамнез ничем не примечателен. У нее было три нормальных УЗИ во время беременности: нормальное УЗИ для датирования на 7 неделе беременности, нормальная полупрозрачность воротниковой зоны, равная 1.0 мм на 12 неделе беременности и нормальная анатомия плода на 20 неделе беременности. Длина шейки матки на сонографических изображениях была нормальной. Кроме того, забор проб ворсинок хориона проводили на 12 неделе и 5 днях беременности, и был получен нормальный мужской кариотип (46XY). За 14 дней до родов пациенту было проведено обычное удаление зубного камня. В анамнезе не было заболеваний десен или кариеса, но она замечала неприятный запах изо рта. У ее мужа было заболевание пародонта, и пара занималась оральным сексом примерно за 10 дней до родов.

    Было проведено культивирование амниотической мембраны, выделившее S. mitis . При патологии плаценты наблюдались признаки острого хориоамнионита, включая острое воспаление хориона плацентарной пластинки и острый фунизит трехсосудистой пуповины.

    3. Обсуждение

    Стрептококки группы Viridans были вовлечены как причина преждевременных родов, внутриутробной гибели плода, неонатального сепсиса и менингита [2]. S . mitis , член группы стрептококков viridans, представляет собой грамположительные факультативные анаэробные и каталазонегативные бактерии, входящие в состав микрофлоры ротоглотки.Он использует различные стратегии для эффективной колонизации ротоглотки человека. К ним относятся модуляция иммунной системы хозяина и экспрессия адгезинов, протеаз иммуноглобулина А и токсинов. Эти стратегии могут действовать как факторы вирулентности, способствующие развитию оппортунистических инфекций [1].

    Присутствие S. mitis в околоплодных водах встречается редко и предполагает гематогенную, восходящую или ятрогенную передачу. Насколько нам известно, было два предыдущих сообщения о S.mitis хориоамнионит. Waites et al. сообщили о случае S. mitis , выделенного из околоплодных вод, полученных при амниоцентезе на 16 неделе беременности, у пациента, у которого развились признаки хориоамнионита и последующего мертворождения [7]. Schmiedel et al. описали второй случай, когда S. mitis было выделено из интраоперационных мазков, взятых с плодных оболочек у пациента с молниеносным хориоамнионитом. Когда образцы анализировали с флуоресцентной гибридизацией in situ, , S.mitis был изолирован только из поверхностных слоев плодных оболочек и не присутствовал в самой плацентарной ткани [8]. Это подтверждает восходящий путь заражения, который, как предполагается, более вероятен после куннилингуса.

    Гигиена полости рта является самым сильным предиктором заболевания десен, но существуют и другие факторы риска, вызванные различиями в микрофлоре зубного налета и иммунной функции хозяина. Беременность, использование оральных контрацептивов, курение и диабет связаны с повышенной восприимчивостью к заболеваниям десен [9].Harville et al. обнаружили, что оральный секс был связан с заболеванием десен [10]. Авторы предположили, что оральный секс может привести к попаданию микробов и / или механических травм в полость рта. Также возможно, что оральный секс может распространить инфекцию из полости рта на половые пути.

    Безопасность орального секса во время беременности неизвестна. Было несколько сообщений об опасных для жизни осложнениях после орального секса во время беременности, таких как венозная воздушная эмболия. Еще одним возможным осложнением является хориоамнионит, вызванный обычными ротоглоточными бактериями, хотя в литературе он описан только в пяти предыдущих случаях [2–6].Наш пациент поступал так же, как пациенты, описанные в этих случаях. В каждом случае у женщин рождались преждевременные роды на сроке от 21 до 26 недель. Все пациенты признались, что занимались оральным сексом в период от двух недель до одного дня до появления симптомов. Обычные ротоглоточные бактерии, такие как Fusobacterium nucleatum , Capnocytophaga sp., Eikenella corrodens и виды стрептококков viridans, были выделены из околоплодных вод или плацентарных культур.По крайней мере, в двух из пяти случаев у партнера было отмечено плохое состояние пародонта.

    Гематогенная передача S. mitis также возможна, о чем сообщалось после стоматологических процедур [11]. Заболевания пародонта также считаются фактором риска неблагоприятных исходов беременности, включая гестационный диабет, преэклампсию, преждевременные роды и низкий вес при рождении. Было высказано предположение, что патогенные бактерии полости рта, происходящие из биопленки десны, могут напрямую инфицировать плаценту после бактериемии или что медиаторы воспаления, секретируемые с поверхности слизистой оболочки десны, переносятся в плаценту, где вызывают воспалительную реакцию [12].Несмотря на то, что наш пациент признал хорошее здоровье полости рта, возможно, что удаление зубного камня, выполненное за 14 дней до этого, могло способствовать возникшей инфекции.

    Мы подчеркиваем, что на момент обращения у нее не было симптомов без признаков материнской инфекции. Субклинический хориоамнионит при патологии плаценты был подтверждением предлагаемой нами теории о том, что S. mitis был приобретен либо в результате посева из ее ротовой полости после удаления зубного камня, либо в результате восходящей инфекции, связанной с оральным приемом.На сегодняшний день мы не обнаружили в литературе другого случая хориоамнионита S. mitis после удаления зубного камня.

    Предшествующая колонизация влагалища S. mitis также может привести к восходящей инфекции и последующему хориоамниониту. Хотя мы не можем исключить такую ​​возможность у нашей пациентки, S. mitis не является частью нормальной микрофлоры влагалища. Вполне вероятно, что она могла заразиться этим возбудителем, если бы она регулярно занималась оральным сексом со своим партнером, который, как известно, страдает активным заболеванием пародонта.

    У пациентов с преждевременными родами следует учитывать бактериальную колонизацию околоплодных вод. Недавний оральный секс и удаление зубного камня в анамнезе могут быть связаны с хориоамнионитом. Целесообразно изучить эти факторы риска в анамнезе пациента с преждевременными родами без какой-либо другой этиологии. Безопасность орального секса во время беременности не может быть оценена из-за небольшого количества зарегистрированных случаев осложнений.

    Согласие

    Женщина, история которой рассказывается в этом отчете, дала письменное согласие на его публикацию.

    Конфликты интересов

    Конфликты интересов или раскрытие финансовой информации отсутствуют.

    Авторские права

    Авторские права © 2020 Бошра Сара Хоссейни и Дженнифер Хант. Это статья в открытом доступе, распространяемая по лицензии Creative Commons Attribution License, которая разрешает неограниченное использование, распространение и воспроизведение на любом носителе при условии правильного цитирования оригинальной работы.

    Оральный комменсальный Streptococcus mitis активирует арилуглеводородный рецептор в эпителиальных клетках ротовой полости человека

    Штаммы бактерий

    Ночные культуры S.mitis CCUG 31611 T получали из исходных глицериновых смесей путем инокуляции 10 мкл исходных материалов в 10 мл свежего триптон-соевого бульона (TSB) (ThermoFisher, Waltham, MA, USA) и инкубировали при 37 ° C и 5% насыщении CO 2 . Четыре миллилитра ночных культур разводили в 25 мл свежего, предварительно нагретого (37 ° C) TSB и выращивали до OD 600 0,460 (6 × 10 7 бактерий на мл). Бактерии осаждали в количестве 10000 г в течение 10 мин и ресуспендировали в бессывороточной среде с пониженным содержанием кератиноцитов (K-SFM) (ThermoFisher, Waltham, MA, USA) (без добавок и антибиотиков) до концентрации 3 × 10 7 бактерий на мл.Для приготовления бактериальных лизатов суспензию бактерий в средней логарифмической фазе (OD 600 0,6) осаждали при 10000 г в течение 10 минут и ресуспендировали в 800 мкл фосфатно-солевого буфера (PBS) (Sigma-Aldrich, St Луис, Миссури, США) перед тремя циклами замораживания-оттаивания по 30 минут при -150 ° C, а затем 10 минут при 37 ° C. После последнего цикла суспензию очищали центрифугированием при 13 000 g в течение 30 минут и определяли количество белка в супернатанте (Bio-Rad, Геркулес, Калифорния, США) перед замораживанием при -20 ° C для последующего использования.Экстракт бактериальных клеток не был дополнительно определен и содержал не охарактеризованные факторы.

    Streptococcus gordonii (S. gordonii) CCUG 25608 T и Streptococcus mutans (S. mutans) ATCC 700610 выращивали, как описано для целых клеток S. mitis .

    Кератиноциты ротовой полости человека

    Исследование было одобрено Региональным этическим комитетом здравоохранения (РЭК Юго-Восток) и проводилось в соответствии с принципами биомедицинских исследований Хельсинкской декларации.Письменное информированное согласие было получено от всех доноров.

    Нормальные кератиноциты ротовой полости человека были выделены из биоптатов слизистой оболочки, полученных во время экстракции третьих моляров. Биопсии транспортировали в IMDM (Sigma-Aldrich) с добавлением 100 Ед · мл -1 пенициллин-стрептомицин-фунгизон (Lonza, Портсмут, Нью-Хэмпшир, США). После ферментного переваривания в течение ночи в IMDM с добавлением 2,2 U · m L -1 диспазы (ThermoFisher) при 4 ° C, эпителий отделяли и переносили в новый контейнер для механического и ферментативного расщепления с использованием 10 × трипсин-этилендиаминтетрауксусной кислоты (EDTA) раствор (Sigma-Aldrich) для получения суспензий одноклеточных.Активность трипсина останавливали добавлением одного объема фетальной бычьей сыворотки (FBS) (Sigma-Aldrich) перед тем, как клетки осаждали при 1000 об / мин -1 в течение 5 минут. Затем клетки ресуспендировали в 5 мл полного K-SFM, составляющего K-SFM с L-глутамином, 1 нг · мл -1 эпидермального фактора роста, 25 мкг · мл -1 экстракта гипофиза крупного рогатого скота (оба от ThermoFisher) и 100 Ед · мл -1 пенициллин-стрептомицин-фунгизон и равномерно распределены в культуральной колбе размером 25 см 2 (VWR, Radnor, PA, USA).Субконфлюэнтные колбы (~ 80%) пропускали на 1/3 или 1/4 путем отделения фермента с использованием 0,25% раствора трипсина-ЭДТА (Sigma-Aldrich) и двух объемов FBS для ингибирования фермента. Все инкубации проводили при 37 ° C и насыщении 5% CO 2 , и культуры использовали между третьим и пятым пассажами.

    Клеточная линия плоскоклеточной карциномы полости рта PE / CA-PJ-49, клон E10 (далее J49; ECACC, Солсбери, Великобритания), из плоскоклеточной карциномы языка у 57-летнего пациента мужского пола, была выращена в полной среде. составляющие IMDM с добавлением 10% фетальной бычьей сыворотки (FBS; оба от Sigma-Aldrich), 2 мМ глутамина (Lonza) и 100 Ед · мл -1 пенициллин-стрептомицин-фунгизон.Клетки отделяли при ~ 80% слиянии путем отделения фермента с использованием 0,25% раствора трипсин-ЭДТА (Sigma-Aldrich) и двух объемов FBS для ингибирования фермента перед центрифугированием и повторным посевом в колбы T75 при плотности 4-7 клеток на см. 2 . Все инкубации проводили при 37 ° C и насыщении 5% CO 2 .

    Стимуляции

    Для микроматричного анализа клетки J49 собирали и 5 × 10 5 клеток высевали в колбы Т75 и оставляли для инкубации в течение ночи.На следующий день клетки промывали PBS для удаления неприкрепленных клеток перед добавлением свежей культуральной среды, содержащей 10 мкг · мл -1 бактериального лизата S. mitis . Затем клетки инкубировали в течение 24 часов. После инкубации клетки собирали, как описано выше, и лизировали в буфере RLT (Qiagen, Валенсия, Калифорния, США) с добавлением 1% 2-меркаптоэтанола (Qiagen) для экстракции РНК.

    Для анализа продукции цитокинов и активности AhR с помощью полимеразной цепной реакции с обратной транскрипцией (RT-PCR) в реальном времени 5 × 10 5 клеток высевали в шестилуночные планшеты в полных K-SFM и инкубировали при 37 °. C и 5% CO 2 насыщения.Через 4 часа все лунки промывали PBS и дополнительно инкубировали в течение ночи с пониженным содержанием K-SFM. Перед стимуляцией все лунки промывали PBS и предварительно инкубировали в течение 1 ч в восстановленном K-SFM с или без 10 мкмоль · л -1 AhR ингибитора CH-223191 (Sigma-Aldrich). После предварительной инкубации весь объем среды заменяли 2 мл бактериальной суспензии (3 × 10 7 бактерий на мл; множественность инфекции (MOI) 1:60) с ингибитором или без него и инкубировали в течение 90 мин (реальная -размерная ОТ-ПЦР) или 6 часов (иммуноферментный анализ на простагландин E2 (PGE2) (ELISA)).После стимуляции супернатанты центрифугировали при 10 000 g в течение 10 минут при 4 ° C для удаления остаточных бактериальных клеток и переносили в новые пробирки перед их замораживанием при -20 ° C для последующего использования в PGE2 ELISA. Клетки промывали PBS и отделяли трипсин-EDTA перед тем, как их собирали в двух объемах FBS. После осаждения при 5000 г в течение 3 мин осадки разрушали в 350 мкл буфера RLT с 1% 2-меркаптоэтанолом (Sigma-Aldrich) и немедленно замораживали при -80 ° C до дальнейшей обработки.

    Массив гранул Illumina

    Полногеномный транскрипционный анализ выполняли с использованием метода массива гранул Illumina (Сан-Диего, Калифорния, США) Norwegian Microarray Consortium в Осло, Норвегия (номер проекта: NMC-OSLO-0182).

    Используя набор для амплификации РНК Illumina TotalPrep-96, меченную биотином кРНК синтезировали из 500 нг тотальной РНК путем обратной транскрипции первой и второй цепей с последующей транскрипцией кРНК in vitro . Количество РНК определяли с помощью спектрофотометра NanoDrop, а размер и целостность РНК определяли с помощью биоанализатора Agilent 2100 (Agilent Technologies, Санта-Клара, Калифорния, США) и значений числа целостности РНК (RIN).Значения выше 7 были признаны приемлемыми. Все образцы имели значения RIN выше 8. 750 нг меченной биотином кРНК анализировали с использованием HumanHT-12 v4 Expression BeadChip (Illumina, Сан-Диего, Калифорния, США), каждый из 12 массивов состоял из более чем 47000 50-мерных элементов. специфичные для генов зонды с бусинками, каждая из которых содержит сотни тысяч зондов с одинаковой последовательностью. Данные с микрочипа фильтровали и обрабатывали с использованием программ TIBCO Spotfire (Бостон, Массачусетс, США) и Ingenuity pathway analysis (Qiagen).

    Экстракция

    РНК и ОТ-ПЦР в реальном времени

    Суммарную РНК экстрагировали с использованием QIAcube и стандартного QIAcube RNeasy mini с протоколом расщепления ДНКазой для набора RNeasy mini (оба от Qiagen). Полную РНК элюировали 30 мкл свободной от нуклеаз H 2 O, и количество и чистоту РНК (значения OD 260 / OD 280 ) определяли с помощью спектрофотометра NanoDrop (NanoDrop Technologies, Уилмингтон, Делавэр, США).

    Комплементарная ДНК

    (кДНК) была синтезирована с использованием набора для обратной транскрипции (BioNordica, Осло, Норвегия) в соответствии с протоколом производителя и системы GeneAMP PCR 9700 (Applied Biosystems, Уолтем, Массачусетс, США).Программа термоцикла была установлена ​​на 25 ° C в течение 10 минут, 48 ° C в течение 30 минут и 95 ° C в течение 5 минут, и кДНК поддерживали при 4 ° C до тех пор, пока она не была разбавлена ​​свободной от нуклеаз H 2 0. Реальный- Время ОТ-ПЦР выполняли с использованием предварительно разработанных праймеров KiCqStart (человеческие CYP1A1, CXCL1, CXCL2, CXCL8 и RPS26; все от Sigma-Aldrich), SYBR green (Biotool, Хьюстон, Техас, США) и системы Stratagene MX 3005P PCR (Stratagene , Ла Хойя, Калифорния, США). После 40 циклов амплификации ампликон проверяли с помощью одного цикла анализа диссоциации путем повышения температуры на 1 ° C за 30 с от заданной температуры до 95 ° C.Программа MxPro (Agilent Technologies, Санта-Клара, Калифорния, США) использовалась для настройки ПЦР и анализа данных перед расчетами кратного изменения экспрессии гена относительно гена домашнего хозяйства S26 .

    Иммуноцитофлуоресценция

    Кератиноциты выращивали на предметных стеклах в 24-луночных планшетах. После 20-минутного воздействия S. mitis (MOI 1:60) клетки дважды промывали PBS, фиксировали и повышали проницаемость при -25 ° C в течение 5 минут, используя ледяной раствор метанол: ацетон (7: 3).Для блокирования добавляли 1% бычий сывороточный альбумин без IgG (Jackson Immunoresearch, Ньюмаркет, Великобритания) в PBS и оставляли на 30 мин при комнатной температуре перед инкубированием с поликлональными козьими антителами против IgG человека AhR (Санта-Крус, Даллас, Техас, США). , 1: 150) в течение 2 ч при 4 ° С. После двукратного промывания Cy2-конъюгированные ослиные вторичные поликлональные антитела против козьего IgG (Джексон, 1: 150) добавляли в каждую лунку и оставляли для инкубации в течение 1 ч перед добавлением DAPI и помещением слайдов на покровные стекла.

    ELISA

    Уровни простагландина E2 в супернатантах кератиноцитов полости рта, подвергнутых воздействию S.mitis в течение 6 часов определяли с использованием конкурентного набора для анализа параметров простагландина E2 ELISA (R&D Systems, Миннеаполис, Миннесота, США). Вкратце, супернатант клеточной культуры добавляли в поставляемый планшет, предварительно покрытый PGE2-специфическими мышиными моноклональными антителами. После промывания добавляли PGE2, меченный пероксидазой хрена (HRP), для связывания незанятых антител в лунках. Затем активность HRP определяли после добавления субстрата по поглощению при 450 нм и использовали для обратной корреляции концентрации PGE2 в экспериментальном образце.

    Статистический анализ

    Данные были проанализированы с использованием одностороннего дисперсионного анализа для повторных измерений с последующей поправкой Холма – Сидака для множественных сравнений. Чтобы соответствовать требованиям нормальности и равенства дисперсии, значения, полученные для транскрипции (ОТ-ПЦР в реальном времени), были преобразованы в логарифм перед статистической оценкой. Статистический анализ проводился с использованием SigmaPlot (v13; Systat Software, Чикаго, Иллинойс, США).

    Платформа геномных ресурсов и анализа группы орального Streptococcus mitis

    Abstract

    Стрептококки полости рта — это сферические грамположительные бактерии, относящиеся к типу Firmicutes , которые являются одними из наиболее частых возбудителей бактериального инфекционного эндокардита (ИЭ), а также являются важными агентами сепсиса у пациентов с нейтропенией.Группа Streptococcus mitis состоит из 13 видов, включая некоторых из наиболее распространенных оральных колонизаторов человека, таких как S . митис , S . Oralis , S . sanguinis и S . gordonii , а также такие виды, как S . тигуринус , S . oligofermentans и S . australis , которые только недавно были классифицированы и плохо изучены в настоящее время.Мы представляем StreptoBase, которая представляет собой специализированный бесплатный ресурс, посвященный геномному анализу оральных видов из группы мититов. В настоящее время он содержит 104 S . mitis групповых геномов, включая 27 новых штаммов группы mitis, которые мы секвенировали с использованием высокопроизводительной технологической платформы Illumina HiSeq, и предоставляет полный набор геномных последовательностей для анализа, в частности сравнительного анализа и визуализации как межвидовых, так и перекрестных характеристик штаммов S . mitis группа бактерий. StreptoBase включает в себя сложные веб-инструменты биоинформатики собственной разработки, такие как инструмент парного сравнения генома (PGC) и инструмент патогеномного профилирования (PathoProT), которые упрощают сравнительный анализ патогеномики штаммов Streptococcus . Приведены примеры, демонстрирующие, как StreptoBase можно использовать для сравнения структуры генома разных S . mitis объединяет бактерии и гены предполагаемой вирулентности в несколько штаммов стрептококков.В заключение, StreptoBase предлагает доступ к ряду геномных ресурсов стрептококков, а также к инструментам анализа и станет бесценной платформой для ускорения исследований стрептококков. URL базы данных : http://streptococcus.um.edu.my.

    Образец цитирования: Zheng W, Tan TK, Paterson IC, Mutha NVR, Siow CC, Tan SY, et al. (2016) StreptoBase: Oral Streptococcus mitis Group Genomic Resource and Analysis Platform. PLoS ONE 11 (5): e0151908. https: // doi.org / 10.1371 / journal.pone.0151908

    Редактор: Индранил Бисвас, Медицинский центр Канзасского университета, США

    Поступила: 25 ноября 2015 г .; Одобрена: 6 марта 2016 г .; Опубликован: 3 мая 2016 г.

    Авторские права: © 2016 Zheng et al. Это статья в открытом доступе, распространяемая в соответствии с условиями лицензии Creative Commons Attribution License, которая разрешает неограниченное использование, распространение и воспроизведение на любом носителе при условии указания автора и источника.

    Доступность данных: Данные доступны на StreptoBase. Номера доступа можно найти в файлах вспомогательной информации.

    Финансирование: Этот проект финансировался Университетом Малайи и Министерством образования (MOHE) Малайзии в рамках гранта на высокоэффективные исследования (HIR) UM.C / HIR / MOHE / 08 и исследовательского гранта UM (UMRG) [Счет № UMRG: RG541-13HTM]. Финансирующая организация оказывала поддержку в виде заработной платы нескольким авторам, но не играла никакой дополнительной роли в дизайне исследования, сборе и анализе данных, принятии решения о публикации или подготовке рукописи.

    Конкурирующие интересы: Конкретные роли этих авторов сформулированы в разделе «Авторский вклад». Все авторы внесли существенный вклад в рукопись и одобрили окончательную версию. Нет никакого реального или предполагаемого конфликта интересов. Это не влияет на соблюдение авторами политики PLOS ONE в отношении обмена данными и материалами.

    Введение

    Streptococcus — основной род сферических грамположительных бактерий, принадлежащих к типу Firmicutes .Стрептококки классифицируются как альфа-гемолитические, бета-гемолитические или гамма-гемолитические в зависимости от их появления на кровяном агаре. Альфа-гемолиз включает обесцвечивание гемового железа перекисью водорода стрептококков (H 2 O 2 ), что приводит к зеленоватому оттенку кровяного агара [1]. Альфа-гемолитические стрептококки раньше были известны как «группа Viridans» из-за зеленоватого цвета, вызванного гемолизом. Однако альфа-гемолиз не полностью согласуется между различными штаммами отдельных видов Streptococcal, и поэтому термин «Viridans» несколько вводит в заблуждение и больше не используется.Эти организмы теперь более известны как оральные стрептококки. В целом стрептококки делятся на шесть групп, а именно группы Mitis, Anginosus, Salivarius, Mutans, Bovis и Pyogenic, с использованием анализа последовательности гена 16S рРНК или группы генов домашнего хозяйства [2–4]. В 2002 году Facklam предложил схему фенотипической идентификации, которая включала дополнительный новый кластер, названный Sanguinis [5]. Этот кластер, содержащий S . sanguinis , S . gordonii и S . sinensis иногда включают в группу мититов.

    Стрептококки ротовой полости человека представляют собой комменсалы, которые часто обитают в желудочно-кишечном тракте и мочеполовых путях, а также на слизистой оболочке полости рта и поверхностях зубов. У здоровых людей стрептококки могут составлять более 50% микробиоты полости рта [6], и эти бактерии обычно обладают низким патогенным потенциалом. Однако оральные стрептококки могут проникать в кровоток и потенциально вызывать инфекционный эндокардит (ИЭ) или постантинеопластическую септицемию у пациентов с нейтропенией и гематологическим заболеванием.Сообщалось также о других заболеваниях, ассоциированных с Streptococcus , включая одонто-лицевые инфекции, абсцессы головного мозга и инфекции брюшной полости [7]. Более того, недавние исследования показали, что S . mitis бактерии группы играют важную роль в обострении инфекции гриппа, особенно среди лиц с ослабленным иммунитетом; Streptococcus oralis и S . Было обнаружено, что mitis продуцирует нейраминидазу (NA), жизненно важную мишень противогриппозных препаратов.Активность NA, проявляемая этими бактериями полости рта, стимулирует высвобождение вируса гриппа, повышает уровни экспрессии вирусного белка M1 и активирует клеточный сигнальный путь ERK, потенциально усиливая вирусные инфекции [8].

    Группа мититов включает 13 известных видов, в том числе S . Австралийский , S . cristatus (ранее S . crista ), S . gordonii , S . Infantis , S . митис , S . oligofermentans , S . Oralis , S . parasanguinis (ранее S . parasanguinis ), S . перорис , S . pneumoniae , S . pseudopneumoniae , S . sanguinis (ранее S . sanguis ) и последний сгруппированный вид S . tigurinus .В настоящее время представлены полные геномные последовательности 7 видов этой группы мититов ( S , pneumoniae , S , pseudopneumoniae , S , mitis , S , oralis , S . gordonii , S , sanguinis и S . parasanguinis ) хранятся на FTP-сайте Национального центра биотехнологической информации (NCBI).

    Здесь мы представляем StreptoBase, которая предоставляет бесценные ресурсы и аналитическую платформу для исследовательских сообществ.С помощью этой платформы и предоставленных собственных инструментов анализа пользователи могут получить представление о биологии, филогении, генетической изменчивости и вирулентности конкретных штаммов или представляющих интерес видов. Кроме того, мы включили 27 недавно секвенированных, собранных и аннотированных геномов новых штаммов шести различных видов S . mitis group из нашей лаборатории в StreptoBase. Эти новые геномы включают новые последовательности генома недавно классифицированного вида S . oligofermentans и S . tigurinus . Конечная цель StreptoBase — предоставить удобный ресурс базы данных и платформу для анализа. Пользователи могут искать, просматривать, визуализировать, загружать и анализировать геномы группы мититов, в частности, проводить сравнительный анализ всего генома на лету, используя наши собственные передовые инструменты биоинформатики, которые предназначены для поддержки расширяющегося сообщества исследователей рода Streptococcus .

    Материалы и методы

    Наборы данных

    Семьдесят семь последовательностей генома S . бактерий группы mitis были загружены из общедоступной базы данных NCBI. Мы также включили 27 новых штаммов / геномов S . Группа mitis , полученная в нашей лаборатории в рамках проекта секвенирования. Все 27 штаммов были клиническими изолятами от людей с зубным налетом или инфекционным эндокардитом из разных географических регионов (Таблица 1). Из этих штаммов 14 штаммов были выделены в Соединенном Королевстве, 10 — в США, 2 — в Австралии и 1 — в Дании (Таблица 1). S . sanguinis NCTC 7863 также известен как ATCC 10556, а S . gordonii Блэкберн и Ченнон имеют обозначения NCTC 10231 и NCTC 7869 соответственно. Дополнительно ряд таких S . mitis штаммы группы , включая JPIIBBV4, JPIIBV3, JPIBVI, LRIIBV4, DGIIBVI и DOBICBV2, были описаны ранее [9]. Выделение штамма M99 описано при изучении механизмов агрегации тромбоцитов оральными стрептококками [10].Два других пероральных изолята, SK120 и SK184, также были описаны Могенсом Килианом и его коллегами-исследователями в их таксономическом исследовании Streptococci «Viridans», проведенном в 1989 г. [11].

    Если коротко, то 27 S . Геномы группы mitis секвенировали с использованием платформы Next-Generation Sequencing Illumina HiSeq2000. Предварительная обработка данных была выполнена методом обрезки (оценка Phred Q20) и собрана с использованием CLC Genomic Workbench V6.5 (CLC BIO Inc., Орхус, Дания).В целом, эти сборки показали высокие значения N50 и низкие числа контигов, что указывает на высокое качество сборки генома. Собранные геномы группы мититов содержат среднее содержание GC от 35% до 45% и со средним размером генома приблизительно 2 МБ (таблица 2).

    Аннотации генома

    StreptoBase в настоящее время включает в себя 104 S . mitis групповых геномов (коллекция геномов записей генома ресурсов NCBI плюс наши 27 изолированных штаммов) 11 видов: S . Австралийский , S . cristatus , S . gordonii , S . Infantis , S . митис , S . oligofermentans , S . Oralis , S . parasanguinis , S . перорис , S . sanguinis и S . tigurinus (таблица 3).

    Для облегчения сравнительного анализа различных S . mitis групповые геномы, последовательность в аннотации важна. Поэтому мы аннотировали все 104 последовательности генома, используя конвейер Rapid Annotation using Subsystem Technology (RAST), который является хорошо зарекомендовавшим себя и полностью открытым веб-механизмом, поддерживающим аннотацию как полных, так и черновых геномов [12]. Конвейер RAST позволяет идентифицировать геном набора отдельных компонентов генома, включая гены, кодирующие белки, рибосомные РНК (рРНК) и транспортные РНК (тРНК), псевдогены, предсказание функции генов.Аннотации генома RAST работают путем сопоставления набора генов с соответствующими подсистемами, а также их метаболических реконструкций. Более того, он предсказывает назначение функциональных белков в соответствии с их родством в подсистемах базы данных FIGfams. Используя конвейер RAST, мы предсказали 213268 кодирующих последовательностей (CDS), 5140 РНК и 4542 тРНК во всех 104 геномах в геномах группы mitis.

    Для систематического прогнозирования субклеточной локализации каждого гена, предсказанного RAST, мы использовали последний инструмент субклеточной локализации PSORTb (версия 3.0) программа [13]. PSORTb — это эффективный инструмент с открытым исходным кодом, который поддерживает высокую точность предсказания в масштабе протеома и точную локализацию подкатегорий. Предсказанные сайты субклеточной локализации были вычислены с помощью вычислений на основе значений переменных признаков, которые определяют характеристики последовательностей. Затем каждое из сгенерированных значений было отсортировано по соответствующим сайтам-кандидатам с помощью их предполагаемой относительности. Помимо информации о субклеточной локализации, мы также запустили собственный Perl-скрипт для оценки содержания GC, гидрофобности и молекулярной массы каждого белка или гена.

    Структура, состав и реализация базы данных

    StreptoBase был разработан для предоставления широкого спектра полезной информации и функций (рис. 1). Например, StreptoBase предоставляет пользователям некоторую справочную информацию о S . mitis группа видов. На домашней странице StreptoBase есть сводное поле, которое содержит информацию о геноме, хранящуюся в базе данных, такую ​​как количество видов, штаммов, количество CDS, количество РНК и количество тРНК (таблица 4), которые могут быть полезны пользователям. перейти к дальнейшим деталям генома и последующему анализу.

    Рис. 1. Структура и состав StreptoBase.

    (A) Блок-схема функциональной аннотации геномов Streptococcus . (B) Схема веб-сервера StreptoBase. (C) Веб-интерфейс карты сайта StreptoBase.

    https://doi.org/10.1371/journal.pone.0151908.g001

    Кроме того, мы собрали и собрали информацию из различных источников по S . mitis групповых видов, например, новости и конференции, блоги и информация, а также недавно опубликованные статьи, которые доступны на домашней странице StreptoBase.Нажав на меню «Обзор», пользователи увидят список из 11 S . mitis группирует виды вместе с соответствующим количеством черновых и полных геномов, при этом каждая кнопка «Просмотр штаммов» позволяет пользователям визуализировать все доступные геномы Streptococcus любого конкретного вида, соответственно. На странице «Обзор штаммов» сводное описание генома, которое включает в себя размер генома (Mbp), содержание GC (%), а также список контигов, генов и рРНК этого штамма конкретного вида сведены в таблицу и отображаются.Кнопка «Подробности» позволяет пользователям получить доступ к более подробным и дополнительным данным этого конкретного штамма, таким как полный список ORF в геноме, их соответствующие функции, начало и конец хромосомных позиций каждой ORF / гена на странице «Обзор ORF». . Чтобы отобразить всю информацию об ORF или гене, пользователи могут щелкнуть кнопку «Подробности», связанную с ORF. Откроется страница «Подробная информация о ORF», на которой будет отображаться такая информация, как тип гена, начальное и конечное положения, длина нуклеотидов, аминокислотные последовательности, функциональная классификация, подсистема SEED (если доступна), направление транскрипции (цепь), субклеточная локализация, будут отображаться гидрофобность (pH), а также молекулярная масса (Da).

    Обозреватель генома Streptococcus (SGB).

    StreptoBase оснащен интерактивным браузером генома Streptococcus (SGB), работающим в режиме реального времени, который был настроен из хорошо зарекомендовавшего себя браузера генома, JBrowse [14], быстрого и современного браузера генома на основе JavaScript, который выполняет навигацию по аннотации генома и визуализация расположения генов и фланкирующих геномных областей / генов выбранного штамма Streptococcus . Этот интерактивный SGB позволяет пользователям плавно и быстро просматривать гены или области генома с помощью графического движения.SGB ​​преодолевает прерывистые переходы и обеспечивает эффективное панорамирование и масштабирование определенной области генома в каждом геноме Streptococcus . Кроме того, пользователи могут удаленно включать или выключать треки ДНК, РНК и CDS во время процесса навигации, обеспечивая гибкость в настройке того, что следует просматривать в средстве просмотра SGB. Мы также реализовали функцию «Поиск» на странице браузера генома, позволяющую пользователям быстро искать ген по ключевому слову или идентификатору ORF, который не предоставляется JBrowse.

    Система поиска по ключевым словам в реальном времени.

    Учитывая тот факт, что StreptoBase будет содержать большое количество генов и их аннотации, и эта информация будет периодически увеличиваться, возможность быстрого поиска гена в базе данных имеет решающее значение. Чтобы решить эту проблему, мы внедрили поисковую систему в реальном времени в StreptoBase с использованием технологии AJAX. Эта поисковая машина в режиме реального времени была разработана для поддержки асинхронной связи между веб-интерфейсом и базой данных MySQL, что позволяет избежать необходимости обновлять веб-страницу и обеспечивает беспрепятственную визуализацию результатов поиска.Поисковая машина в реальном времени получает список предлагаемых функциональных классификаций генов, связанных с введенным ключевым словом, после того, как ключевое слово введено.

    Реализация базы данных.

    Веб-интерфейс StreptoBase был разработан с использованием языка разметки гипертекста (HTML), препроцессора гипертекста (PHP), JavaScript, jQuery, каскадных таблиц стилей (CSS) и AJAX. StreptoBase поддерживается архитектурой Linux, Apache, MySQL и PHP (LAMP).

    Веб-сервер Apache оснащен ОС Linux для управления исчерпывающими геномными данными Streptococcus , хранящимися в StreptoBase.Интерфейс PHP-фреймворка CodeIgniter версии 2.1.3 был реализован, чтобы предлагать модель-представление-контроллер (MVC), разделяя данные приложения, логику представления и фоновую логику и процесс на три отдельных модуля. Благодаря этой расширенной функции все коды источников и биологические данные Streptococcus упорядочены в ясной и организованной форме, что облегчает будущее обновление новых геномов Streptococcus в существующей системе баз данных. Для хранения и управления биологическими данными Streptococcus мы использовали MySQL версии 14.12, чтобы хранить обширную информацию о геноме Streptococcus в хорошо продуманной схеме и таблицах базы данных. Внутренний процесс StreptoBase контролируется сценарием Perl, сценарием Python и сценарием R, которые поддерживают эффективность и функциональность наших интегрированных инструментов биоинформатики.

    Кроме того, пользователи могут загрузить все последовательности генома Streptococcus , детали аннотации ORF в табличном формате, последовательности ORF, РНК и CDS, а также нуклеотидные и аминокислотные последовательности через меню «Загрузить».

    Результаты

    Функции баз данных и встроенные инструменты биоинформатики

    Модель S . Виды группы mitis являются важными колонизаторами ротовой полости и иногда связаны с серьезными инфекциями [15]. Кроме того, недавно было высказано предположение, что эти организмы играют важную роль в патогенезе гриппа [8]. Таким образом, геномное исследование различных S . mitis группа бактерий необходима для понимания того, как эти микроорганизмы переходят от комменсального образа жизни во рту к последующему патогенезу.Однако для широкого спектра S не существует специализированной базы данных генома. mitis групповые геномы для сравнительной геномики. Хотя большинство баз данных биологических геномов сосредоточены только на содержании генома и генетической изменчивости, мы выявили необходимость в создании функциональных инструментов биоинформатики для исследования детерминант вирулентности в геномах посредством сравнительной патогеномики, а также для сравнения содержания генома и генетической изменчивости в пределах S . mitis группа бактерий.

    Инструмент парного сравнения генома (PGC).

    Мы разработали и настроили веб-инструмент PGC для S . mitis группирует бактерии, что позволяет пользователям выбирать и проводить попарные сравнения между двумя выбранными пользователем геномами Streptococcus . Список геномов Streptococcus доступен в инструменте PGC StreptoBase, что позволяет пользователям выбрать два генома Streptococcus для сравнения между штаммами или видами.Кроме того, пользователи могут загрузить свои собственные последовательности генома, нуклеотидов или белков, и сравнить их с геномами Streptococcus в StreptoBase.

    Вкратце, конвейер PGC поддерживается NUCmer, который разработан для выравнивания полногеномных последовательностей, и Circos, который является хорошо зарекомендовавшим себя инструментом для визуализации генома. После того, как пользователи отправят свои задания на наш сервер, PGC вызовет программу NUCmer для выравнивания выбранных пользователем геномов, и внутренние сценарии будут использоваться для обработки выходных данных выравнивания генома и создания входных файлов, проанализированных в Circos, чтобы сгенерировать макет круговой идеограммы выравнивания.В отличие от обычного линейного отображения выравниваний, круговая компоновка показывает взаимосвязь между парами позиций с кариотипами и связями, кодирующими положение, размер и ориентацию связанных геномных элементов.

    В веб-интерфейсе PGC предусмотрены три определяемых пользователем параметра, включая минимальный процент идентичности (%), порог слияния (bp) и порог связи (bp). Граница минимального процента идентичности определяет гомологичную область (представленную связями / лентами на графике Circos) между двумя сравниваемыми геномами.Порог слияния позволяет объединить две ссылки / ленты, расстояние между которыми находится в пределах определенного пользователем порога, а порог связи позволяет пользователям исключать любые сопоставленные / гомологичные области, размер генома которых меньше заданного пользователем порогового значения. Дорожка гистограммы добавляется во внешнем кольце кругового графика, чтобы указать процент сопоставленных областей, что позволяет пользователям быстро идентифицировать потенциальные отступы (обозначенные белыми промежутками) и области сопоставления (обозначенные зелеными диаграммами) между двумя выровненными геномами.Реализация конвейера PGC управляется с помощью сценариев Perl. Этот конвейер производит два типа выходных данных: результаты выравнивания NUCmer и высококачественный график Circos (формат SVG). Пользователи могут бесплатно загрузить эти результаты для публикации или дальнейшего анализа на странице результатов PGC.

    Существующий инструмент сравнения генома микробов (MGC) использует метод вычитания генома in silico для идентификации генетических элементов, специфичных для группы штаммов [16]. В то время как инструмент PGC использует файлы генома и NUCmer для выполнения попарного выравнивания генома, инструмент MGC использует in silico фрагментированные последовательности генома и выполняет BLASTN по группам запросов.Напротив, браузер VISTA, хорошо известный своим биологическим применением, может выполнять предварительно вычисленные попарные и множественные выравнивания генома с использованием как глобального, так и локального выравнивания [17]. В отличие от круговых графиков и гистограмм, которые генерируются инструментом PGC, результаты выравнивания, сгенерированные VISTA Browser, отображаются с использованием трека VISTA в формате графика, чтобы показать сохраненные области. Кроме того, основанный на Java инструмент сравнения Artemis (ACT) с открытым исходным кодом требует, чтобы пользователи генерировали файл сравнения, который идентифицирует области гомологии между сборочным и эталонным геномом с помощью таких программ, как BLASTN, TBLASTX или Mummer, которые должны быть загружены в ACT [18].Сравнительная визуализация ACT выполняется с использованием компонентов Artemis. Напротив, наш инструмент PGC обеспечивает однопоточный процесс попарного выравнивания генома и мгновенное отображение графика Circos сравнительного выравнивания.

    Чтобы продемонстрировать полезность PGC, мы сравнили S . mitis B6 (полный геном) и 17/34 (черновой вариант генома) в качестве примера на рис. 2.

    Рис. 2. Попарное сравнение генома между S . mitis B6 и S . mitis 17/34 с использованием инструмента PGC, встроенного в StreptoBase.

    50% идентичности последовательностей и 50% покрытия последовательностей использовали для сравнения штаммов с использованием инструмента PGC. A и B выделяют отступы от попарного сравнения генома между S . mitis B6 и S . митис 17/34.

    https://doi.org/10.1371/journal.pone.0151908.g002

    Параметры были установлены как 80% от минимального процента, значение по умолчанию — порог ссылки 1000bp и порог слияния 2000bp. S . mitis B6 был выделен в Германии, а S . mitis 17/34 был выделен из уретры российского пациента с уретритом. На основе сгенерированного графика PGC оба значения S . Геномы mitis в целом обладали высоким сходством, так как большинство их геномных областей могли быть выровнены (рис. 2). Одной из особенностей графика PGC является его способность быстро определять предполагаемые отступы посредством визуализации пробелов в графике, что подтверждается информацией, отображаемой на дорожке гистограммы.Например, два разрыва (рис. 2) указывают на отсутствие геномных областей в S . mitis 17/34 геном. Внешняя круглая полоса графика показывает измерения размера генома, которые составляют примерно 2 МБ для обоих S . mitis геномов. На основании разрыва, наблюдаемого на фиг. 2 (индекс «А»), потеря гена произошла вблизи позиции 400 000 п.н.

    Затем мы исследовали гены, расположенные в индексе «A» в S . mitis B6 (рис. 2) путем визуализации этой области с помощью SGB.Мы идентифицировали множество генов, связанных с фагами, связанных с этой областью. Для дальнейшего изучения этой области мы использовали PHAST (PHAge Search Tool) для аннотирования и идентификации последовательностей профагов, обнаруженных в S . mitis B6 геном (You Zhou et al., 2011). Интактный профаг размером 56 КБ с 82 CDS и содержанием GC 39,9% был обнаружен с 390 924 до 446 969 пар оснований. Начиная с S . mitis B6 — это полный геном, поэтому мы можем указать положение пары оснований непосредственно в нашем файле аннотации B6.Согласно результатам PHAST, это интактный профаг S . mitis B6 содержал фаг-ассоциированные гены, включая белок фаговой интегразы, фаговый CI-подобный репрессор, фаг-связывающий белок, фаговый портальный белок, белок морфогенеза фаговой головки семейства SPP1 и белки фагового капсида. Поэтому мы предлагаем S . mitis B6, возможно, недавно приобрел этот интактный профаг. Графическое изображение интактного профага с различными типами фаг-связанных генов показано на рисунке 3.

    На основании инделя «B», обнаруженного на графике PGC на рис. 2, мы выявили неполный профаг размером 24 КБ с содержанием GC 39,17%, расположенный в положениях от 1356040 по 1380128 пар оснований. Интересно, что эта область содержит полный оперон атр и , регулируемый Белок CcpA в этом неполном профаге S . mitis геном B6. Гены оперона atp показаны в таблице 5. Эти гены, кодирующие АТФ-синтазы, обычно используются стрептококками полости рта для адаптации к кислой среде хозяина за счет создания более щелочной внутренней системы.

    Этот защитный механизм особенно важен для гликолитических ферментов, чувствительных к стрептококковой кислоте [19]. Следовательно, возможно, что приобретение этого оперона atp осуществляется неполным профагом S . mitis B6 посредством горизонтального переноса генов способствовал его комменсальному статусу в поддержании оптимального уровня pH для биоэнергетических процессов S . mitis B6 клеток.

    Инструмент патогеномического профилирования (PathoProT).

    PathoProT был разработан для прогнозирования генов вирулентности путем сравнения аминокислотных последовательностей Streptococcus с базой данных факторов вирулентности (VFDB) [20]. PathoProT использует автономные инструменты BLAST, загруженные с веб-сайта NCBI. VFDB (версия 2012) в настоящее время содержит набор из 19775 экспериментально подтвержденных генов вирулентности, происходящих от широкого спектра различных видов бактерий, что обеспечивает полезный ресурс для поиска гомологии последовательностей. Пользователи могут выбрать список из штаммов Streptococcus для сравнительного анализа и установить пороговое значение, например, идентичность генома и полноту для поиска BLAST через нашу предоставленную онлайн-форму.Параметры по умолчанию для конвейера PathoProT установлены на 50% идентичности последовательностей и 50% полноты последовательности для поиска и идентификации генов ортологичной вирулентности в выбранных геномах Streptococcus . Однако пользователи могут применять желаемые отсечки для поиска гомологии, чтобы достичь оптимальных уровней строгости в своих анализах.

    Вкратце, конвейер PathoProT в основном реализован с использованием Perl. Собственные сценарии Perl будут обрабатывать выходные данные BLAST (сгенерированные путем поиска этих последовательностей запросов в VFDB) для каждого предсказанного RAST белка (последовательности запроса) в выбранных пользователем геномах и определять предполагаемую вирулентность на основе заданных пользователем параметров.Отфильтрованные результаты BLAST объединяются и организуются в матричную таблицу, содержащую информацию о наличии или отсутствии генов вирулентности (строки) и названия штаммов Streptococcus (столбцы). Наконец, PathoProT передаст и обработает этот вывод с помощью наших собственных сценариев R для иерархической кластеризации (алгоритм полной связи) и создания тепловой карты для визуализации. Штаммы Streptococcus будут отсортированы на основе их профилей генов вирулентности (рис. 4), и будет построено филогенетическое дерево, пользователи смогут оценить взаимосвязи между близкородственными S . mitis групповых видов / штаммов, а также соответствующие им гены вирулентности образуют заметные кластеры на дендрограммах. Таким образом, этот сравнительный анализ патогеномики может дать отличное представление о профилях генов вирулентности у разных видов Streptococcus . Например, не существует инструмента биоинформатики, который выполняет те же функции, что и PathoProT, а именно прогнозирует и позволяет сравнивать гены вирулентности в геномах разных видов бактерий.

    Рис. 4. Блок-схема PathoProT.

    PathoProT в основном реализован с использованием сценариев Perl и R. Входными данными PathoProT будут списки генов для выбранных штаммов / геномов, и конвейер будет генерировать тепловую карту в конце процесса.

    https://doi.org/10.1371/journal.pone.0151908.g004

    Чтобы продемонстрировать особенности или функциональные возможности PathoProT, мы представляем сравнительное исследование патогеномики S . mitis группируют бактерии, используя порог в 50% как для идентичности последовательностей, так и для покрытия, чтобы получить представление об их профилях генов вирулентности.На основании созданной тепловой карты PathoProT ряд предполагаемых генов вирулентности, по-видимому, сохраняется среди всех видов группы мититов (рис. 5). Консервативные гены hasC (hasC1 или SMU . 322c) , которые кодируют UTP-глюкозо-1-фосфат уридилилтрансферазу (или UDP-пирофосфорилазу глюкозы) (M6Spy1871), участвуют в синтезе капсулы гиалуроновой кислоты (HA) вдоль с двумя соседними генами: hasA и hasB внутри имеет оперон .[21]. Фактически, это Streptococcus pneumoniae , наиболее патогенный вид из S . Группа mitis обладает полисахаридной капсулой, которая способствует бактериальному патогенезу [22]. В Streptococcus HA обнаруживается, поскольку материал капсулы стрептококка у некоторых видов является важным фактором вирулентности, эффективно маскируя бактерии от распознавания иммунной системой хозяина [23,24], а также защищая их от реактивных оксидов, выделяемых лейкоцитами [25] ].Кроме того, возможно, что ГК играет значительную роль в прикреплении стрептококков группы мититов и колонизации эпителиальных клеток, что приводит к устойчивости бактерий против фагоцитоза макрофагами [26–28].

    Рис. 5. Информативная тепловая карта, созданная инструментом PathoProT.

    (A) Список консервативных генов вирулентности, переносимых всеми видами группы mitis, и (B) гены, связанные с синтезом RGP, которые могут дифференцировать M Clade и S Clade. Наличие гена вирулентности было отмечено красным цветом, а отсутствие генов вирулентности было отмечено черным.

    https://doi.org/10.1371/journal.pone.0151908.g005

    Другой консервативный ген вирулентности, slrA , кодирует стрептококковую липопротеин ротамазу А, которая является одним из основных поверхностных белков, экспрессируемых S . пневмония . Этот ген является важным циклофилином, который модулирует биологическую функцию белков вирулентности на первой стадии пневмококковой инфекции [29]. Вероятно, что ген slrA способствует инвазии клеток-хозяев и облегчает колонизацию пневмококков и присоединение к ним в S . mitis группа бактерий [30,31]. Кроме того, сообщалось, что дефицит slrA снижает вирулентность бактерий из-за его влияния на адгезию и интернализацию эпителиальными и эндотелиальными клетками [29]. Точно так же консервативный ген lmb кодирует ламинин-связывающий белок, который впервые был идентифицирован у Streptococcus agalactiae [32]. Практически идентичные адгезины позже были обнаружены как у Streptococcus suis [33], так и у Streptococcus pyogenes [34,35].Было предложено, что адгезины lmb помогают в бактериальном патогенезе посредством инвазии поврежденного эпителия [36]. В целом, многие поверхностные липопротеины и адгезины, которые важны для вирулентности и патогенных инфекций, являются высококонсервативными в S . mitis группа бактерий.

    Согласно филогенетическому дереву, сгенерированному в левой части тепловой карты PathoProT (рис.5), группу мититов можно четко разделить на две категории: S Clade ( S . sanguinis , S . gordonii , S . parasanguinis , S . Австралийский , S . cristatus и S . oligofermentans ) и M Clade ( S , mitis , S , infantis , S , tigurinus , S , oralis и S , peroris ). Это филогенетическое родство S . mitis Группа видов указывает на близкое родство между видами в M Clade и между видами в S Clade. Интересно, что мы обнаружили, что гены rgp могут использоваться для дифференциации двух разных кладов на тепловой карте. Например, эти маркерные гены присутствуют у всех видов S Clade, но отсутствуют у всех видов M Clade.

    Кластер генов rgp (B, C, D, F и G) отвечает за синтез полисахарида рамнозы-глюкозы (RGP) в Streptococcus mutans .Примечательно, что подобные гены участвуют в синтезе рамнана в Escherichia coli [37]. Фактически предполагалось, что E . coli и S . mutans имеют общий путь синтеза рамнана, основанный на их сходстве в синтезе RGP [37]. Функция rgpB заключается в переносе второго остатка рамнозы на остаток рамнозы на N -ацетилглюкозамин, связанный с липидным носителем, за которым следует rgpF , который позже катализирует перенос третьего остатка рамнозы на вторую рамнозу. остаток полученного гликолипидного носителя.Как rgpB , так и rgpF предположительно должны работать попеременно при удлинении цепи рамнана. Гомологичные рамнозилтрансферазы rgpB и rgpF были обнаружены у Streptococcus thermophilus (STER1436) и Streptococcus gordonii (SGO1022). С другой стороны, гены rgpC и rgpD кодируют предполагаемые переносчики ABC, специфичные для RGP (гомологичный STER1434 в S , thermophilus и гомологичный SGO1024 в S . gordonii ), которые играют роль в экспорте полисахаридов [37]. Ген rgpG (гомолог S . gordonii SGO1723) инициирует синтез RGP путем переноса N -ацетилглюкозамин-1-фосфата на липидный носитель [38].

    Гены rgp также вовлечены в патогенез нескольких видов Streptococcus . Например, rgp играет важную роль в бактериальной вирулентности, а также вызывает воспалительную реакцию в S . suis [39]. Индукция инфекционного эндокардита по S . Сообщалось, что mutans запускается генами rgp через высвобождение оксида азота [40], агрегацию тромбоцитов [41] и придание устойчивости к фагоцитозу полиморфно-ядерными лейкоцитами человека [42]. Следовательно, S Clade S . Виды группы mitis , которые продуцируют эти богатые рамнозой полимеры, могут демонстрировать патогенез, отличный от видов M Clade Streptococcus , с целью установления большей вирулентности и увеличения выживаемости в клетках-хозяевах.Недавнее исследование выявило группу стрептококков Sanguinis в качестве распространенного возбудителя транзиторной бактериемии, которая потенциально может привести к инфекционному эндокардиту. Сообщалось также, что эта группа присутствовала в нескольких случаях вирулентной сепсисной инфекции у пациентов с нейтропенией [43].

    Инструменты поиска последовательности.

    Мы включили два типа механизмов BLAST, стандартный BLAST и VFDB BLAST, в StreptoBase для поиска штаммов Streptococcus , ближайших к запрашиваемому штамму.Эти эксклюзивные поиски BLAST функционально основаны на автономном инструменте BLAST [44], загруженном из NCBI. Оба механизма BLAST поддерживают три типа функций BLAST, а именно BLASTN, BLASTP и BLASTX. Пользователи могут определять полноту генома (%) и идентичность генома (%) в формах отправки инструментов BLAST. Эти специализированные инструменты BLAST призваны облегчить пользователям поиск сходства их запрашиваемых последовательностей с последовательностями генома Streptococcus , последовательностями генов (стандартный BLAST), а также с генами вирулентности VFDB (VFDB BLAST), что позволяет пользователям проверять, действительно ли их представляющие интерес гены являются генами потенциальной вирулентности с использованием подхода гомологии последовательностей.

    Дальнейшая работа и заключение

    С развитием технологии NGS будет секвенировано еще видов или штаммов Streptococcus , и это создает острую потребность в хранении, просмотре, извлечении и анализе огромных объемов данных генома и разработке специализированных инструментов для сравнительного анализа этих геномов.

    Здесь мы успешно описали и продемонстрировали функциональные возможности StreptoBase, в частности разработанные нами биоинформатические конвейеры для анализа геномных данных Streptococcus .

    Эта специализированная биологическая база данных будет постоянно обновляться, чтобы предоставлять последние обновления генома и исследования, связанные с родом Streptococcus , а также обеспечивать точность и полезность S . mitis данные генома группы видов и аннотация. Мы ожидаем, что StreptoBase будет служить полезным ресурсом и платформой для анализа, особенно для сравнительного анализа S . mitis групповые геномы для исследовательских сообществ.Мы призываем других исследователей или исследовательские группы вносить предложения и делиться своими аннотациями, мнениями и тщательно подобранными данными по адресу [email protected]

    Доступность и системные требования

    StreptoBase доступен в Интернете по адресу http://Streptococcus.um.edu.my. Пользователи могут загрузить и визуализировать все последовательности и аннотации, описанные в этом документе, на веб-сайте StreptoBase. Штаммы, которые еще не были депонированы в коллекции культур NCTC или ATCC, доступны по запросу в NSJ.Эта аналитическая платформа обычно совместима с несколькими типами браузеров, включая Internet Explorer 8.x или выше, Mozilla Firefox ® 10.x или выше, Safari 5.1 или выше, Chrome 18 или выше и любое другое аналогичное программное обеспечение браузера. Этот веб-сайт лучше всего просматривать при разрешении экрана 1024 × 768 пикселей или выше.

    Дополнительная информация

    S1 Рис. Обзор генома 104

    групповых геномов Streptococcus mitis в StreptoBase.

    Подробная информация о геноме включает размер генома, количество контигов, количество ORF, количество тРНК, количество рРНК, содержание GC, а также номера доступа NCBI 104 штаммов Streptococcus .

    https://doi.org/10.1371/journal.pone.0151908.s001

    (XLSX)

    Благодарности

    Мы хотели бы поблагодарить всех членов Genome Informatics Research Group (GIRG) за вклад в это исследование.

    Вклад авторов

    Задумал и спроектировал эксперименты: SWC NSJ ICP. Проведены эксперименты: WZ LAO. Проанализированы данные: WZ SWC. Внесенные реактивы / материалы / инструменты анализа: SWC NSJ WZ TKT ICP LAO NVRM CCS SYT. Написал документ: WZ TKT SWC ICP NSJ.

    Ссылки

    1. 1. Barnard JP, Stinson MW (1996) Альфа-гемолизин Streptococcus gordonii представляет собой перекись водорода. Infect Immun 64: 3853–3857. pmid: 8751938
    2. 2. Кавамура Y, Hou X-G, Sultana F, Miura H, Ezaki T (1995) Определение последовательностей 16S рРНК Streptococcus mitis и Streptococcus gordonii и филогенетические отношения между членами рода Streptococcus. Международный журнал систематической бактериологии 45: 406–408.pmid: 7537076
    3. 3. Bentley RW, Leigh JA, Collins MD (1991) Внутриродовая структура Streptococcus на основе сравнительного анализа последовательностей малых субъединиц рРНК. Международный журнал систематической бактериологии 41: 487–494. pmid: 1720654
    4. 4. Якубович Н.С., Ясин С.А., Рикард А.Х. (2014) Взаимодействие оральных стрептококков в сообществе. Adv Appl Microbiol 87: 43–110. pmid: 24581389
    5. 5. Facklam R (2002) Что случилось со стрептококками: обзор таксономических и номенклатурных изменений.Обзоры клинической микробиологии 15: 613–630. pmid: 12364372
    6. 6. Human Microbiome Project C (2012) Структура, функции и разнообразие здорового микробиома человека. Природа 486: 207–214. pmid: 22699609
    7. 7. Westling K (2005) Септицемия и эндокардит, вызванные стрептококками группы Viridans: Молекулярная диагностика, чувствительность к антибиотикам и клинические аспекты: Institutionen för medicin / Департамент медицины.
    8. 8. Камио Н., Имаи К., Симидзу К., Куэно М.Э., Тамура М. и др.(2015) Стрептококки группы орального митита, продуцирующие нейраминидазу, потенциально способствуют развитию вирусной инфекции гриппа и снижению противовирусной эффективности занамивира. Клеточные и молекулярные науки о жизни 72: 357–366. pmid: 25001578
    9. 9. McAnally J, Levine M (1993) Бактерии, реагирующие на моноклональные антитела, нейтрализующие токсин бляшек, связаны с тяжестью гингивита в месте отбора пробы. Микробиология и иммунология полости рта 8: 69–74. pmid: 8355987
    10. 10. Sullam P, Valone F, Mills J (1987) Механизмы агрегации тромбоцитов стрептококками группы viridans.Инфекция и иммунитет 55: 1743–1750. pmid: 3112008
    11. 11. Kilian M, MIKKELSEN L, HENRICHSEN J (1989) Таксономическое исследование стрептококков viridans: описание Streptococcus gordonii sp. ноя и внесены поправки в описания Streptococcus sanguis (White and Niven 1946), Streptococcus oralis (Bridge and Sneath, 1982) и Streptococcus mitis (Andrewes and Horder, 1906). Международный журнал систематической бактериологии 39: 471–484.
    12. 12. Азиз Р.К., Бартельс Д., Бест А.А., ДеДжонг М., Дис Т. и др.(2008) Сервер RAST: быстрые аннотации с использованием технологии подсистем. BMC genomics 9: 75. pmid: 18261238
    13. 13. Нэнси Ю.Ю., Вагнер-младший, Лэрд М.Р., Мелли Дж., Рей С. и др. (2010) PSORTb 3.0: улучшенное предсказание субклеточной локализации белка с уточненными подкатегориями локализации и прогностическими возможностями для всех прокариот. Биоинформатика 26: 1608–1615. pmid: 20472543
    14. 14. Скиннер М.Э., Узилов А.В., Штейн Л.Д., Мунгалл С.Дж., Холмс И.Х. (2009) JBrowse: браузер генома следующего поколения.Исследование генома 19: 1630–1638. pmid: 19570905
    15. 15. Банческу Г., Думитриу С., Банческу А., Дефта С., Пана М. и др. (2004) Тестирование чувствительности изолятов группы Streptococcus mitis. Индийский журнал медицинских исследований 119: 257–261. pmid: 15232207
    16. 16. Аргимон С., Конганти К., Чен Х., Алексеенко А.В., Браун С. и др. (2014) Сравнительная геномика пероральных изолятов Streptococcus mutans путем вычитания генома in silico не выявила дополнительных ДНК, связанных с тяжелым кариесом в раннем детстве.Инфекция, генетика и эволюция 21: 269–278. pmid: 242
    17. 17. Фрейзер К.А., Пахтер Л., Поляков А., Рубин Е.М., Дубчак И. (2004) VISTA: вычислительные инструменты для сравнительной геномики. Исследование нуклеиновых кислот 32: W273 – W279. pmid: 15215394
    18. 18. Карвер Т.Дж., Резерфорд К.М., Берриман М., Раджандрим М.А., Баррелл Б.Г. и др. (2005) ACT: инструмент сравнения Artemis. Биоинформатика 21: 3422–3423. pmid: 15976072
    19. 19. Lemos JA, Abranches J, Burne RA (2005) Ответы кариесогенных стрептококков на стрессы окружающей среды.Актуальные вопросы молекулярной биологии 7: 95–108. pmid: 15580782
    20. 20. Чен Л., Ян Дж., Ю Дж., Яо З., Сун Л. и др. (2005) VFDB: справочная база данных по факторам вирулентности бактерий. Исследование нуклеиновых кислот 33: D325 – D328. pmid: 15608208
    21. 21. Crater DL, Van de Rijn I (1995) Оперон синтеза гиалуроновой кислоты (имеет) экспрессию в стрептококках группы А. Журнал биологической химии 270: 18452–18458. pmid: 7629171
    22. 22. Келли Т., Диллард Дж. П., Йотер Дж. (1994) Влияние генетического переключения капсульного типа на вирулентность Streptococcus pneumoniae.Инфекция и иммунитет 62: 1813–1819. pmid: 8168944
    23. 23. Wessels MR, Moses AE, Goldberg JB, DiCesare TJ (1991) Капсула гиалуроновой кислоты является фактором вирулентности для мукоидных стрептококков группы A. Слушания Национальной академии наук 88: 8317–8321.
    24. 24. Schmidt K-H, Günther E, Courtney HS (1996) Экспрессия как M-белка, так и капсулы гиалуроновой кислоты штаммами стрептококков группы A приводит к высокой вирулентности для куриных эмбрионов. Медицинская микробиология и иммунология 184: 169–173.pmid: 8811648
    25. 25. Клири П.П., Ларкин А. (1979) Капсула с гиалуроновой кислотой: стратегия устойчивости к кислороду у стрептококков группы А. Журнал бактериологии 140: 1090–1097. pmid: 391798
    26. 26. WIBAWAN IWT, Pasaribu F, Utama I, Abdulmawjood A, Laemmler C (1999) Роль капсульного материала гиалуроновой кислоты Streptococcus equi subsp. zooepidemicus в опосредовании присоединения к клеткам HeLa и в сопротивлении фагоцитозу. Исследования в области ветеринарии 67: 131–135.pmid: 10502481
    27. 27. Ким С. Дж., Пак С. И., Ким С. В. (2006) Новый подход к производству гиалуроновой кислоты с помощью Streptococcus zooepidemicus. Журнал микробиологии и биотехнологии 16: 1849–1855.
    28. 28. Chen WY, Marcellin E, Hung J, Nielsen LK (2009) Молекулярная масса гиалуронана контролируется концентрацией UDP-N-ацетилглюкозамина в Streptococcus zooepidemicus. Журнал биологической химии 284: 18007–18014. pmid: 19451654
    29. 29. Hermans PW, Adrian PV, Albert C, Estevão S, Hoogenboezem T и др.(2006) Стрептококковая липопротеин ротамаза A (SlrA) представляет собой функциональную пептидил-пролилизомеразу, участвующую в колонизации пневмококков. Журнал биологической химии 281: 968–976. pmid: 16260779
    30. 30. Санчес К.Дж., Кумар Н., Лискано А., Шившанкар П., Даннинг Хотопп Дж. К. и др. (2011) Streptococcus pneumoniae в биопленках не могут вызывать инвазивное заболевание из-за измененного продуцирования детерминант вирулентности. PLoS One 6: e28738. pmid: 22174882
    31. 31. Москосо М., Гарсия Э., Лопес Р. (2006) Формирование биопленок с помощью Streptococcus pneumoniae: роль холина, внеклеточной ДНК и капсульного полисахарида в росте микробов.Журнал бактериологии 188: 7785–7795. pmid: 16936041
    32. 32. Дмитриев А., Шен А., Ткачикова Ľ, Микула И., Ян Ю. (2004) Структура межгенной области scpB-lmb как критерий для дополнительной классификации стрептококков группы B человека и крупного рогатого скота. Acta Veterinaria Brno 73: 215–220.
    33. 33. Zhang Y-M, Shao Z-Q, Wang J, Wang L, Li X и др. (2014) Преобладающее распространение и сохранение белка Lmb Streptococcus suis и его защитная способность против инфекции китайского высоковирулентного штамма.Микробиологические исследования 169: 395–401. pmid: 24120016
    34. 34. Terao Y, Kawabata S, Kunitomo E, Nakagawa I, Hamada S (2002) Новый ламинин-связывающий белок Streptococcus pyogenes, Lbp, участвует в адгезии к эпителиальным клеткам. Инфекция и иммунитет 70: 993–997. pmid: 11796638
    35. 35. Элснер А., Крайкемейер Б., Браун-Кевник А., Спеллерберг Б., Буттаро Б.А. и др. (2002) Участие Lsp, члена семейства LraI-липопротеинов в Streptococcus pyogenes, в адгезии и интернализации эукариотических клеток.Инфекция и иммунитет 70: 4859–4869. pmid: 12183530
    36. 36. Spellerberg B, Rozdzinski E, Martin S, Weber-Heynemann J, Schnitzler N, et al. (1999) Lmb, белок, сходный с семейством адгезинов LraI, опосредует прикрепление Streptococcus agalactiae к ламинину человека. Инфекция и иммунитет 67: 871–878. pmid: 9916102
    37. 37. Shibata Y, Yamashita Y, Ozaki K, Nakano Y, Koga T (2002) Экспрессия и характеристика стрептококковых генов rgp, необходимых для синтеза рамнана в Escherichia coli.Инфекция и иммунитет 70: 2891–2898. pmid: 12010977
    38. 38. Ямасита Й., Шибата Й., Накано Й., Цуда Х., Кидо Н. и др. (1999) Новый ген, необходимый для синтеза полисахаридов рамнозы и глюкозы у Streptococcus mutans. Журнал бактериологии 181: 6556–6559. pmid: 10515952
    39. 39. Холден М., Хаузер Х., Сандерс М., Нго Т.Х., Черевач И. и др. (2009) Быстрая эволюция вирулентности и устойчивости к лекарствам у появляющегося зоонозного патогена Streptococcus suis. PLoS One 4: e6072.pmid: 19603075
    40. 40. Мартин В., Клещев А.Л., Кляйн Дж.П., Берец А. (1997) Индукция продукции оксида азота полиозидами из клеточных стенок Streptococcus mutans OMZ 175, грамположительной бактерии, в аорте крысы. Инфекция и иммунитет 65: 2074–2079. pmid: 9169734
    41. 41. Chia J-S, Lin Y-L, Lien H-T, Chen J-Y (2004) Агрегация тромбоцитов, индуцированная полисахаридами серотипа из Streptococcus mutans. Инфекция и иммунитет 72: 2605–2617. pmid: 15102769
    42. 42.Цуда Х., Ямасита Ю., Тоошима К., Ямагути Н., Охо Т. и др. (2000) Роль серотип-специфичного полисахарида в устойчивости Streptococcus mutans к фагоцитозу полиморфно-ядерными лейкоцитами человека. Инфекция и иммунитет 68: 644–650. pmid: 10639428
    43. 43. Шелбурн С.А., Сахасрабходжан П., Салдана М., Яо Х., Су X и др. (2014) Штаммы Streptococcus mitis, вызывающие тяжелое клиническое заболевание у онкологических больных. Новые инфекционные заболевания 20: 762. pmid: 24750901
    44. 44.Джонсон М., Зарецкая И., Райцелис Ю., Мережук Ю., МакГиннис С. и др. (2008) NCBI BLAST: лучший веб-интерфейс. Исследование нуклеиновых кислот 36: W5 – W9. pmid: 18440982

    Streptococcus mitis — microbewiki

    Страница Microbial Biorealm, посвященная роду Streptococcus mitis

    Классификация

    Таксоны высшего порядка

    Бактерии; Фирмикуты; Бациллы; Лактобациллы; Streptococcaceae;

    Виды

    Streptococcus mitis

    Описание и значение

    Streptococcus mitis — это комменсальные бактерии, которые колонизируют твердые поверхности полости рта, такие как твердые ткани зубов, а также слизистые оболочки, и являются частью флоры полости рта.Обычно они образуют короткие цепочки в виде кокков (10). Эти грамположительные бактерии обычно не являются патогенными, но обычно вызывают бактериальный эндокардит, то есть воспаление внутреннего слоя сердца. S. mitis являются альфа-гемолитическими, что означает, что они могут разрушать эритроциты. S. mitis неподвижны, не образуют спор и не имеют группоспецифических антигенов (2). S. mitis оптимально живут при температуре от 30 до 35 градусов Цельсия, что делает их мезофилами.Это факультативные анаэробы, бактерии, которые производят АТФ путем аэробного дыхания при наличии кислорода, но также способны переключаться на ферментацию в отсутствие кислорода (7).

    Структура генома

    Геном S. mitis был секвенирован и состоит из кольцевой хромосомы примерно с двумя миллионами пар оснований, которая варьируется в зависимости от штамма. Его содержание GC и AT составляет соответственно 40,4% и 59,1%. Всего насчитывается 2222 гена, из которых 2149 являются генами, кодирующими белок (3).

    Гены, кодирующие липопротеины Pb1A и Pb1B в S. mitis , сгруппированы рядом с генами, которые очень похожи на стрептококковые фаги r1t, 01205 и Dp-1. Это означает, что Pb1A и Pb1B могут находиться внутри профага (4). Чтобы проверить эту возможность, использовали митомицин С и УФ-свет, потому что оба они могут индуцировать литический цикл многих фагов. Этому подвергали культуры S. mitis , и с помощью Вестерн-блоттинга было обнаружено значительное увеличение экспрессии Pb1A и Pb1B.Частицы фага были видны в культурах S. mitis , названных SM1. Этот фаг имел ДНК-геном размером около 35 т.п.н. Все эти эксперименты показали, что Pb1A и Pb1B кодируются лизогенным бактериофагом (4).

    Строение клетки и обмен веществ

    4.1 Структура ячейки

    Как показывает электронная микроскопия, штаммы S. mitis обычно несут редко расположенные длинные фибриллы, а их клеточные поверхности часто считаются мягкими.Электрофоретическая мягкость и фиксированная плотность отрицательного заряда от -1,2 до -4,3 × 106 См-3 в слое полиэлектролита штаммов S. mitis были определены анализом мягких частиц с использованием измеренных электрофоретических подвижностей (5).

    У штаммов S. mitis очень высокая частота встречаемости внеклеточных поверхностных структур и обнаружено множество придатков различной длины до нескольких микрон (5). У разных штаммов плотность придатков на поверхности клеток может значительно различаться (5).

    S. mitis характеризуется клеточной стенкой С-полисахарида и полисахаридом, подобным тейхоевой кислоте. Полисахарид, подобный тейхоевой кислоте, содержит повторяющееся звено фосфата гептасахарида, которое не состоит ни из рибита, ни из глицеринфосфата, как обычно наблюдается в тейхоевых кислотах (6). C-полисахарид S. mitis содержит в каждой повторяющейся единице два остатка фосфохолина и оба остатка галактозамина (6).

    4.2 Метаболизм

    С.mitis — это облегченный анаэроб, который делает его метаболизм очень универсальным. Использование и синтез внутриклеточного гликогена и его катаболизм в лактат были обнаружены у S. mitis . Гликогеноподобный полисахарид действует как единственный источник полезной энергии у S. mitis (7).

    Когда экзогенный источник энергии отсутствует, распад полисахарида обеспечивает S. mitis энергией в пригодной для использования форме для клеток, у которых полисахарид увеличивает активность β-галактозидазы при индуцировании тиометилгалактозидом (8).При аналогичном индуцировании клетки, в которых отсутствует полисахарид, и полисахарид-отрицательный вариант S. mitis не увеличивают активность β-галактозидазы. Единственным субстратом для эндогенного метаболизма S. mitis является внутриклеточный полисахарид (8).

    Экология

    S. mitis является частью нормальной флоры млекопитающих. Обычно они обитают во рту, горле и носоглотке. Некоторые штаммы S. mitis обладают способностью продуцировать протеазу IgIA1 и связывать альфа-амилазу слюны, которые являются двумя свойствами, определяющими Streptococcus viridans, которые представляют собой большую группу обычно непатогенных, комменсальных стрептококковых бактерий.Некоторые S. mitis , которые продуцируют нейраминидазу, имеют тенденцию колонизировать поверхности слизистых оболочек, хотя производство этого фермента не требуется для успешной колонизации (9). Однако ни активность протеазы иммуноглобулина A1, ни способность связывать α-амилазу из слюны не были предпочтительной характеристикой устойчивых генотипов. Основное происхождение новых клонов, занятых S. mitis , находится в дыхательных путях (9).

    Патология

    S. mitis обычно является этиологическим агентом одонтогенной инфекции и эндокардита и только в некоторых случаях признан респираторными патогенами.Самый распространенный хозяин — люди. Основным взаимодействием в патогенезе инфекционного эндокардита является прямое связывание бактерий с тромбоцитами (10). S. mitis — это комменсальный организм, который тесно связан с возбудителем Streptococcus pneumoniae , возбудителем отита, пневмонии, сепсиса и менингита. Наблюдалась гомологичная рекомбинация между этими видами, и перенос генетических детерминант от S. mitis к S. pneumoniae способствует устойчивости патогена к пенициллину (10).

    Известно, что многочисленные фаги несут детерминанты, повышающие вирулентность бактериального хозяина. Эти факторы представляют собой преимущественно секретируемые токсины, такие как стрептококковый эритрогенный токсин, стафилококковый энтеротоксин А, дифтерийный токсин и холерный токсин (10). Другие детерминанты вирулентности, кодируемые фагом, включают внеклеточные ферменты, такие как стафилокиназа и стрептококковая гиалуронидаза, ферменты, которые изменяют антигенные свойства штамма-хозяина, и белки внешней мембраны, которые повышают резистентность сыворотки (10).Вероятно, что Pb1A и Pb1B напрямую связываются с тромбоцитами, хотя механизм, с помощью которого PblA и PblB опосредуют связывание тромбоцитов с помощью S. mitis , не проиллюстрирован. Таким образом, кодирование PblA и PblB лизогенным SM1 может представлять класс детерминант вирулентности, опосредованной фагом (10).

    Применение в биотехнологии

    В небольшом количестве из изолятов S. mitis был обнаружен холестерин-зависимый цитолизин, названный митилизином. Ген митилизина секвенировали из семи изолятов S.mitis . Сравнение с геном пневмококкового пневмолизина показывает 15 аминокислотных замен (11). S. mitis , по-видимому, выделяет митилизин внеклеточно. На основании результатов твердофазного иммуноферментного анализа и анализа нейтрализации один изолят S. mitis может продуцировать гемолитический токсин в дополнение к митилизину (11). Поскольку известно, что между S. mitis и Streptococcus pneumoniae происходит генетический обмен, это открытие может иметь значение для разработки вакцин или методов лечения пневмококковой инфекции, основанных на пневмолизине и его свойствах (11).

    Текущие исследования

    Ready (и др.) Проанализировали гены, кодирующие устойчивость к антибиотикам, которые можно найти на тех же генетических элементах, что и гены устойчивости к ртути (Hg). Они использовали стоматологические методы, в которых использовались реставрационные материалы, которые могут способствовать устойчивости к ртути, а также устойчивости к антибиотикам (12). Используя модель биопленки in vitro для выращивания зубных бляшек на субстратах из амальгамы и эмали, они наблюдали количество и пропорцию устойчивых к ртути бактерий с течением времени. Из 42 выделенных бактерий, устойчивых к ртути, 98% были стрептококками, с S.преобладает mitis . Семьдесят один процент изолятов, устойчивых к ртути, также были устойчивы к целому ряду антибиотиков; тетрациклин встречается наиболее часто (12). Результаты этого исследования «указывают на то, что установка реставраций из амальгамы может играть роль в повышении уровней Hg- и устойчивых к антибиотикам бактерий, присутствующих в полости рта» и способов предотвращения устойчивости бактерий к антибиотикам путем анализа генов (12 ).

    Oliveira (и др.) Исследовали способность лектина из Talisia esculenta (TEL), дерева, произрастающего в Бразилии, и белка из семян Labramia bojeri (Лабрамин) ингибировать адгезию микробов и использовать противомикробные препараты. эффекты.«Минимальные ингибирующие и бактерицидные концентрации этих белков были определены с использованием 5 видов бактерий: Streptococcus mutans UA159, Streptococcus sobrinus 6715, Streptococcus sanguinis ATCC10556, S. mitis ATCC903 и S. 13). Тест на адгезию был проведен с использованием этих 5 видов бактерий. Лабрамин показал ингибирующее действие на прилипание S. mutans и S. sobrinus .Эти результаты показывают, что «Лабрамин потенциально полезен как лекарство, ингибирующее биопленку» (13).

    Ip (и др.) Исследовали уникальные штаммы пневмококков и вариации атипичных последовательностей в «определяющих устойчивость к хинолонам областях (QRDR) генов гиразы и топоизомеразы по сравнению со штаммом Streptococcus pneumoniae R6» (14). Использование мультилокусного типирования последовательностей (MLST) для последовательностей шести локусов «позволило отличить« атипичные »штаммы от пневмококков, и эти штаммы тесно сгруппировались с S.mitis »(14). Все эти штаммы имеют от одного до трех генов gyrA, gyrB, parC и parE, «последовательности QRDR которых сгруппированы с последовательностями S. pneumoniae , что свидетельствует о горизонтальном переносе QRDR генов гиразы и топоизомеразы от пневмококков в viridans streptococci». (14). Эти гены также обладают устойчивостью к фторхинолонам к стрептококкам viridans. Были проанализированы агенты устойчивости к фторхинолонам 32 охарактеризованных штаммов S. mitis и Streptococcus oralis от пациентов.События рекомбинации и мутации de novo играют важную роль в развитии устойчивости бактерий к фторхинолонам и способах ее предотвращения (14).

    Список литературы

    1. Bischoff, J., Domrachev, M., Federhen, S., Hotton, C., Leipe, D., Soussov, V., Sternberg, R., Turner, S. База данных таксономии NCBI Доступно 26 августа, 2007 г.

    2. Проект генома Entrez Доступ: 23 августа 2007 г.

    3. База данных генома CMR TIGR, таблица фактов ДНК Доступ: 26 августа 2007 г.

    4.Уолан Р.Х., Фаннелл С.Г., Боулер Л.Д., Хадсон М.Дж., Робинсон А., Доусон К.Г. Распределение и генетическое разнообразие липопротеинов-переносчиков ABC PiuA и PiaA в Streptococcus pneumoniae и родственных стрептококках. J Bacteriol. Февраль 2006. Том 188, №3. п. 1031-1038.

    5. Родригес В., Бушер Х., Ван дер Мей В. и Х. Мягкость стенки бактериальных клеток Streptococcus mitis при исследовании с помощью микроэлектрофореза. Электрофорез. 2002. Том 23. с. 2007-2011 гг.

    6. Бергстром, Н., Янссон, П.Е., Килиан, М., Сков Соренсен, У.Б. Структуры двух полисахаридов, ассоциированных с клеточной стенкой, штамма Streptococcus mitis biovar 1. Уникальный полисахарид, подобный тейхоевой кислоте, и антиген группы O, который является C-полисахаридом, общим с пневмококками. Eur-J-Biochem. Декабрь 2000. Том 267, № 24. с. 7147-57.

    7. Houte, J.V., Jansen, H.M. Роль гликогена в выживаемости от Streptococcus mitis. Журнал бактериологии. Март 1970. Том 101, № 3. с. 1083-1085.

    8.Гиббонс, Р. Дж. (Стоматологический центр Форсайт, Бостон, Массачусетс). [http://www.pubmedcentral.nih.gov/picrender.fcgi?artid=277233&blobtype=pdf Метаболизм внутриклеточного полисахарида с помощью Streptococcus mitis и его связь с образованием индуцируемых ферментов.] J. Bacteriol. 1964. Том 87. с. 1512–1520.

    9. Кирхерр, Дж. Л., Боуден, Г. Х., Ричмонд, Д. А., Шеридан, М. Дж., Вирт, К. А., Коул, М. Ф. Распространение фенотипов Streptococcus mitis biovar 1 на шелушащихся и не шелушащихся поверхностях ротовой полости детей первого года жизни.Микробная экология в здоровье и болезнях. Сентябрь 2005. Том 17, Выпуск 3. с. 138 — 145.

    10. Бенсинг, Б.А., Рубенс, К.Э., Саллам, П.М. Генетические локусы Streptococcus mitis, которые опосредуют связывание с тромбоцитами человека. Заражение иммунной. Март 2001. Том 69, № 3. с. 1373–1380.

    11. Джеффрис, Дж., Ниеминен, Л., Киркхэм, Л., Джонстон, К., Смит, А., и Митчелл, Т.Дж. Идентификация секретируемого холестерин-зависимого цитолизина (митилизина) из Streptococcus mitis. J Bacteriol. Янв.2007. Том 189, № 2. с. 627–632.

    12. Риди, Д., Праттен, Дж., Мордан, Н., Уоттс, Э., Уилсон, М. Влияние воздействия амальгамы на устойчивые к ртути и антибиотикам бактерии. Int J Antimicrob Agents. Июль 2007 г .; Том 30, № 1. с. 34-39.

    13. Oliveira, M.R., Napimoga, M.H., Cogo, K., Gonçalves, R.B., Macedo, M.L., Freire, M.G., Groppo, F.C. Подавление прикрепления бактерий к покрытому слюной слюне через лектины растений. J Oral Sci. Июнь 2007. Том 49, № 2. с. 141-145.

    14. Ип, М., Чау, С.С., Чи, Ф., Танг, Дж., Чан, П.К. Устойчивость к фторхинолонам атипичных пневмококков и оральных стрептококков: свидетельство горизонтального переноса генов детерминант устойчивости к фторхинолонам от Streptococcus pneumoniae. Антимикробные агенты Chemother. Август 2007. Том 51, № 8. с. 2690-700.


    Под редакцией Нэнси Ле, ученица Рэйчел Ларсен

    Под редакцией KLB

    .
    Leave a Reply

    Добавить комментарий

    Ваш адрес email не будет опубликован. Обязательные поля помечены *

    2022 © Все права защищены.