Сыворотки состав: состав, полезные свойства и вред, калорийность сыворотки

состав, полезные свойства и вред, калорийность сыворотки

Молочные продукты во все времена играли большую роль в жизни человека: их ценность в высоком содержании животного белка и кальция, укрепляющего зубы. Даже после скисания или естественного брожения молоко не теряет своей ценности, а молочная сыворотка в обязательном порядке должна быть включена в рацион людей всех возрастов. Компоненты сыворотки принимают участие в процессах кроветворения и белкового обмена, даже поднимают настроение.

Состав молочной сыворотки

В сыворотке содержится более 200 полезных элементов, участвующих в жизнедеятельности нашего организма. Организмом усваивается всего 7% полезных веществ, но и этого количества достаточно для ЖКТ, зубов и костей, а также мышц, «питающихся» белком. В состав молочной сыворотки входят такие компоненты:

• Молочный сахар, полностью усваиваемый организмом. Он считается самым лучшим углеводом, который не перерабатывается в жир на нашей фигуре.
• Белки и аминокислоты, не вырабатывающиеся организмом. Белки сыворотки молочной самые ценные в ряду остальных молочных продуктов.
• Витамины: А, В, С, Е.
• Минералы и микроэлементы: кальций, фосфор, калий, магний, а также никотиновая кислота.

Интересно знать! Оказывается, что молочная сыворотка максимально приближена к составу женского грудного молока, поэтому ее часто используют в качестве компонента детского питания.

Полезные свойства молочной сыворотки

Богатый витаминно-минеральный состав наносит сокрушительный удар по таким болезням и проблемам организма:

• Повышает иммунитет: для этого стоит выпивать 150 мл сыворотки хотя бы 3 раза в неделю.
• Восстанавливает нормальную работу ЖКТ. Благодаря молочной сыворотке очищаются и восстанавливаются стенки кишечника, желудок работает лучше, полезно пить сыворотку людям, страдающим от запоров. Также сыворотка из молока восстанавливает микрофлору, погубленную во время приема антибиотиков.
• Восстанавливает водно-солевой баланс, полезна при отеках, выводит излишки воды, токсины.
• Рекомендуется пить молочную сыворотку людям, которые страдают от гипертонии и сердечно-сосудистых заболеваний. Сыворотка выводит вредные вещества и снижает показатель «плохого» холестерина, предотвращая образование бляшек в сосудах.
• Снижает аппетит, что ценно во время похудения. Главное правило – пить сыворотку натощак, чтобы во время завтрака или обеда «сбить» аппетит.
• Показана при: сахарном диабете, атеросклерозе, ишемической болезни сердца, заболеваниях печени и почек.
• Снимает стресс и оказывает негативное влияние на выработку стрессовых гормонов.

Совет! Если вы обгорели на солнце, то помажьте ожоги молочной сывороткой. Также можно налить в теплую ванную 2-3 литра сыворотки, а потом полежать в ней 20-40 минут. Сыворотка смягчит кожу, не даст образоваться волдырям, которые присущи всем солнечным ожогам.

Вред сыворотки молочной

Молочная сыворотка безобидна, но нельзя злоупотреблять употреблением этого продукта. Как и любой другой кисломолочный продукт, сыворотка может стать причиной диареи.

Молочная сыворотка в кулинарии

Молочная сыворотка редко продается в магазинах, а приобретать такой продукт на рынке просто опасно. Поэтому рекомендуется готовить сыворотку из молока дома: процесс не трудоемкий, а получившийся продукт будет свежим и вкусным.

Вы можете приготовить из 2-3 л молока сразу два продукта: сыворотку и творог. Для этого перелейте молоко в банку и отправьте его на 1-2 дня в теплое место, для ускорения процесса скисания можно разбавить молоко 1 ст. л. сметаны. После сквашивания перелейте молоко в кастрюльку, поставьте его на огонь и нагрейте, но не кипятите. Томите сквашенное молоко до тех пор, пока не появятся сгустки. После этого выключите газ, дождитесь остывания, накиньте на дуршлаг марлю и слейте сыворотку в банку, а творог в марле повесьте, чтобы с него стекла жидкость.

Гастрономический совет! Вы можете не ждать 2-3 дня сквашивания и не класть в молоко сметану: сразу поставьте его на огонь, добавьте сок лимона (на 1 л молока берут сок из 1 лимона). Отметим, что вкус сыворотки и творога не меняется.

Энергетическая ценность продукта (Соотношение белков, жиров, углеводов):

Белки: 0.8г. ( ∼ 3,2 кКал)

Жиры: 0.2г. ( ∼ 1,8 кКал)

Углеводы: 3.5г. ( ∼ 14 кКал)

Энергетическое соотношение (б|ж|у): 17% | 9% | 77%

Сыворотка творожная — калорийность, полезные свойства, польза и вред, описание

Калории, ккал: 

20

Углеводы, г: 

3.5

Творог – это один из тех продуктов, которые знакомы большинству людей с детства. Действительно, уникальные состав, вкус и полезные свойства делают его незаменимым продуктом, как детского, так и взрослого питания.

При изготовлении творога образуются дополнительные продукты, например – творожная сыворотка, она известна не столь широко, как творог (калоризатор). Это жёлтая, зеленоватая или белесая жидкость. Несмотря на не совсем привлекательный вид, это один из продуктов, ничем не уступающий, а в чем-то даже превосходящий творог.

Калорийность сыворотки творожной

Калорийность сыворотки творожной очень мала и составляет всего 20 ккал на 100 грамм продукта.

Состав и полезные свойства сыворотки творожной

Сыворотка в своем составе содержит все те же полезные вещества, что и творог, а именно: кальций, калий, фосфор, железо, натрий и магний.

Из органических веществ есть: холин, витамины РР, вся группа В, С, Е. Очень важно, что все соединения оптимально усваиваются организмом, что повышает пользу при употреблении.

Творожная сыворотка имеет весь перечень необходимых белков (calorizator). Все это позволяет ей положительно влиять на весь организм в комплексе, предупреждая и подавляя самые разнообразные заболевания.

Творожная сыворотка рекомендуется всем, кто заботится о правильном питании. Кроме этого сыворотка с творога – это один из популярных напитков у спортсменов.

Применение сыворотки творожной в кулинарии

В домашней кухне творожная сыворотка будет отличным аналогом кефира, особенно, если приготовлена самостоятельно.

Кроме напитка она часто применяется в домашней выпечке, придавая изделиям неповторимый «деревенский» вкус.

Также известны рецепты прохладительных летних супов, обладающих превосходным вкусом.

что такое, как пользоваться и наносить [мнение экспертов SkinCeuticals]

1 Что такое сыворотка для лица

Сыворотка (серум) — косметический продукт, в котором активные ингредиенты представлены в высокой концентрации. То есть действующие вещества те же, что в кремах, но их удельный вес в разы больше. Формула сыворотки такова, что она почти мгновенно впитывается и демонстрирует результат быстрее крема. Иногда — мгновенно.

Активные компоненты составляют до 70% серума, в то время как в кремах их 10-12%, остальное — основа и структурообразующие ингредиенты: эмульгаторы, эмоленты (смягчители), загустители, пленкообразователи.

3 Состав сыворотки

Вот её главные ингредиенты:

• антиоксиданты — ферменты, полифенолы, минералы;
• витамины С, Е, группы B, ретинол;
• гидрофиксаторы — гиалуроновая кислота, глицерин;
• кислоты AHA, BHA, которые обеспечивают пилинг;
• церамиды, восстанавливающие водно-липидный баланс и защитные свойства кожи;
• пептиды, стимулирующие выработку коллагена и эластина.

4 Как применять сыворотку

Любая сыворотка наносится:

• 1–2 раза в день, в малом количестве — по 4–5 капель;
• только на очищенную и тонизированную кожу — желательно, чтобы она была влажной, это усилит действие сыворотки.

6 Обзор сывороток для лица SkinCeuticals

Сыворотка для коррекции акне и возрастных изменений кожи Blemish & Age Defense

Интенсивный кислотный комплекс (диоевая, каприлоил-салициловая, салициловая кислоты) уменьшает число несовершенств, снижает выработку себума, очищает поры и деликатно выполняет эксфолиацию. Гликолевая и лимонная кислоты отвечают за гладкость кожи.

Обновляющая увлажняющая сыворотка Retexturing Activator

Хорошо увлажняют кожу гиалуроновая кислота и компонент натурального увлажняющего фактора — гидроксиэтил мочевина, а hepes обеспечивает бережное, но эффективное отшелушивание и, как следствие, регенерацию кожи. Ферментированный экстракт черного чая (комбуча) известен своей способностью выравнивать цвет лица и придавать коже сияние.

Сыворотка в геле Phloretin CF

Антиоксиданты флоретин, 10%-ная L-аскорбиновая и феруловая кислоты обладают синергирующим (взаимоусиливающим) действием. Защищают кожу от раннего старения и вредного UV- и инфракрасного излучения, корректируют признаки увядания, тормозят образование свободных радикалов, выравнивают цвет лица, предупреждают пигментные пятна.

Высокоэффективная антиоксидантная сыворотка для сухой и нормальной кожи CE Ferulic

Серум наносится утром и оказывает тройное действие. Высококонцентрированная L-аскорбиновая кислота, альфа-токоферол (витамин Е) и феруловая кислота дают мощную защиту от свободных радикалов и внешних негативных факторов, корректируют несовершенства (морщины, пигментные пятна), стимулируют синтез коллагена.

Высокоэффективная антиоксидантная сыворотка для всех типов кожи Serum 10

Подходит даже для чувствительной кожи. Комбинация L-аскорбиновой и феруловой кислот предупреждает образование свободных радикалов, уменьшает пигментацию и выраженность морщин, защищает от последствий UV-излучения. Витамин С стимулирует синтез коллагена.

Корректирующая сыворотка для повышения гиалуроновой кислоты в коже H. A. Intensifier

Наносится утром. Проксилан, экстракты лакрицы и пурпурного риса повышают упругость кожи, cпособствуют поддержанию оптимального уровня гиалуроной кислоты и целостности внеклеточного матрикса (соединительной ткани). Концентрированная гиалуроновая кислота сразу в трех модификациях увлажняет кожу и уменьшает признаки старения.

Некоторые сыворотки необходимо использовать под прикрытием солнцезащитного крема.

Антиоксидантный гель для сухой и нормальной кожи Phloretin CF Gel

Подходит для сухой, нормальной и склонной к пигментации кожи. Антиоксиданты (аскорбиновая и феруловая кислоты в сочетании с флоретином) предупреждают старение и защищают клетки от вредного излучения и других агрессивных внешних факторов, сокращают морщины и гиперпигментацию. Технология «сыворотка в геле» повышает проникновение активных компонентов и делает текстуру легкой, комфортной даже для мужской кожи после бритья.

Ночной концентрированный антиоксидантный гель Resveratrol B E

Антиоксидантное трио — ресвератол, байкалин и альфа-токоферол — уменьшает окислительный стресс, запускает процессы регенерации и самовосстановления клеток. Гель обеспечивает эффективный ночной уход для всех типов кожи. Подходит и мужчинам.

Антиоксидантный гель для ухода за кожей вокруг глаз против фотостарения и признаков усталости AOX+ Eye Gel

Витамин С, феруловая кислота, флоретин предотвращают оксидативный стресс, кофеин улучшает лимфодренаж, экстракт корня иглицы укрепляет капилляры и усиливает микроциркуляцию. Итог — увлажнение, защита, снижение отеков, уменьшение морщин, предупреждение старения. Не наносить на подвижное веко.

 

Источник: skin.ru

Молочная сыворотка — калорийность и свойства. Состав и польза молочной сыворотки



Свойства молочной сыворотки

Пищевая ценность и состав | Витамины | Минеральные вещества

Сколько стоит молочная сыворотка ( средняя цена за 1 л.)?

Москва и Московская обл.

60 р.

 

Известно, что молочную сыворотку получают в процессе изготовления творога. Происходит это следующим образом: когда скисшее молоко нагревают, возникает створаживание, в результате которого масса делится на две части – непосредственно творог и молочная сыворотка. Творог используется по прямому назначению — в питании, тогда как сыворотка применяется во многих случаях.

Как правило, к основному способу использования молочной сыворотки относят ее употребление в качестве самостоятельного продукта, однако нередко она выступает в роли натурального заменителя всевозможных косметических средств. Но все же применение в кулинарии стоит во главе. Так, на ее основе можно приготовить превосходные вкусные и лечебные напитки – достаточно смешать молочную сыворотку с овощным или фруктовым соком. Двойного целебного действия можно достичь, приготовив коктейль из сыворотки и отвара лечебных трав.

Достаточно сложно напоить этим полезным продуктом детей, поэтому отличным выходом в данной ситуации считается приготовление вкуснейшего желе из сыворотки. Навряд ли малыши откажутся от такого десерта, если в его составе будут присутствовать ягоды или фрукты. Это блюдо не только освежит и подарит заряд бодрости, но и обогатит маленький организм большим количеством витаминов и минералов – это говорит о немалых полезных свойствах молочной сыворотки.

Состав молочной сыворотки

Доказано, что в составе молочной сыворотки присутствуют белки, которое включают в себя незаменимые аминокислоты, не способные самостоятельно вырабатываться организмом. Поэтому единственно возможным их попаданием в организм является поступление с пищей.

Кроме того, богат состав молочной сыворотки и минеральными веществами наряду с целым рядом жизненно важных витаминов. Это калий, магний, фосфор, кальций, витамины РР, Е, С, Н и группы В. Есть в ней также холин, биотин и никотиновая кислота.

Польза молочной сыворотки

Благодаря своему составу молочная сыворотка буквально творит чудеса. При регулярном употреблении этого целебного продукта из организма выводятся соли тяжелых металлов, шлаки, токсины, а также излишняя жидкость. Польза молочной сыворотки очевидна, ведь это источник природных протеинов. Данные вещества отличаются низкой пищевой ценностью, что и обуславливает неимоверно маленькую калорийность молочной сыворотки.

Специалисты утверждают, что употребление молочной сыворотки и напитков, изготовленных на ее основе, способствует сохранению позитивного эмоционального состояния, а также восполнению витаминной недостаточности в том случае, если поступление в организм человека питательных веществ является слишком низким. Другими словами, польза молочной сыворотки заключается еще и в том, что она способна частично заменять свежие фрукты и овощи.

Калорийность молочной сыворотки 18.1 кКал

Энергетическая ценность молочной сыворотки (Соотношение белков, жиров, углеводов — бжу):

Белки: 0.8 г. (~3 кКал)
Жиры: 0.2 г. (~2 кКал)
Углеводы: 3.5 г. (~14 кКал)

Энергетическое соотношение (б|ж|у): 18%|10%|77%

Рецепты с молочной сывороткой



Пропорции продукта. Сколько грамм?

в 1 чайной ложке 5 граммов
в 1 столовой ложке 18 граммов
в 1 стакане 250 граммов
в 1 упаковке 1000 граммов

 

Витамины

Минеральные вещества

Аналоги и похожие продукты

Просмотров: 44741

Cухая молочная сыворотка: состав, польза и вред

Сухая молочная сыоротка. Данный продукт готовится только из натурального сырья, которое не испытывало на себе никаких генетических воздействий или модификаций.Данное изделие солёно-сладкого вкуса имеет белый или слегка желтоватый оттенок. Практически не имеет запаха, иногда источает легкий специфический аромат. Возможно присутствие небольших комков, которые мягко разваливаются при надавливании.Сухая сыворотка обладает полезными качествами, которые используются спортсменами-атлетами с целью увеличения мышечной массы.Данный продукт обладает богатым на витамины и минеральные вещества составом, включающим такие минералы и витамины как витамины группы А и В, органический кислоты, витамин РР и Н, калий, кобальт, железо, йод и др.В её составе содержаться практически все микроэлементы и соли веществ, растворимых в оде. Особенно много в сухой сыворотке витаминов группы В, являющиеся весьма действенными в процессах успокоения и релаксации. Также витамины этой группы незаменимы в борьбе с авитаминозами и нехватками полезных веществ в организме человека, эти витамины пополняют их запас.В составе белка, содержащегося в сухой сыворотке, содержаться ферменты и вещества, сходные по составу с белковой составляющей материнского молока, а белок коровьего молока во многом отличен от белка, содержащегося в молоке кормящей женщины. Этот показатель делает возможным применение сухой молочной сыворотки в производстве детских питательных смесей, жиры которой обладают повышенной дисперсностью по сравнению с жирами молока коровы, это способствует более легкому усвоению детского питания организмом ребенка.Сухая сыворотка широко используется в различных сферах, разными людьми, независимо от их пола и возрастной категории. Мужской пол может использовать сыворотку как анаболик для роста мышц, получается, что рассказав о применении сыворотки в спорте, мы приоткрыли завесу в тайне секретного питания атлетов. Прекрасная половина нашего общества с помощью сухой сыворотки может вывести накопившиеся шлаки или ненужную жидкость. Сыворотку можно пить каждый день, таким образом, прибавляя количество протеинов в вашем теле и при этом не поправляясь. Этот продукт эффективно утоляет чувство голода, что можно активно использовать, в случае если вы находитесь на диете и ограничиваете себя в питании.Людям преклонных лет рекомендуется пить сыворотку при лечении скрытых форм авитаминоза, атеросклероза, гипертонических проблем и при заболеваниях сердечнососудистой системы. Малышам сыворотка служит источником полезных витаминов, микроэлементов, солей веществ, повышающих защитные функции детского организма. Данный молочный продукт улучшает кровяное давление, повышает общую жизненную энергию, приводит микрофлору кишечно-желудочного тракта в нормальное состояние.Особенно полезными свойствами обладает сыворотка из козьего молока, она оказывает помощь при лечении желудочной и легочной недостаточности, улучшает состав крови при таком заболевании как малокровие.

ПЕРЕРАБОТКА СЫВОРОТКИ | Dairy Processing Handbook

Сыворотка, жидкий побочный продукт, образующийся при производстве сыра, казеина и йогурта, является одним из крупнейших источников пищевого белка, доступных на сегодняшний день. Мировое производство сыворотки, составившее в 2013 г. примерно 180 миллионов тонн, содержит около 1,5 миллиона тонн постоянно дорожающих белков и 8,6 миллиона тонн лактозы, важного источника углеводов для всего мира. Последние исследования показывают, что белки сыворотки, возможно, являются самым ценным в питательном аспекте белком из всех имеющихся, поэтому неудивительно, что производители продуктов питания, таких как спортивное, лечебное и детское, вкладывают огромные средства в молочную промышленность. Имеющая полный комплект «природных приятных мелочей» в своем составе, таких как высокожелирующий b-лактоглобулин, эквивалент белка материнского молока a-лактальбумин, лактоферрин и иммуноглобулин, а также имея в составе вещество-прекурсор пробиотических галактоолигосахаридов (ГОС), сыворотка становится одним из самых восхитительных источников питательных веществ, доступных на сегодняшний день.

Сыворотка составляет около 80–90 % от общего объема перерабатываемого молока и содержит около 50 % питательных веществ, входящих в состав необработанного молока: растворенные белки, лактозу, витамины и минералы.

Сыворотка, которая является побочным продуктом производства твердых, полутвердых и мягких сыров и сычужного казеина, называется сладкой сывороткой и имеет рН 5,9–6,6. При производстве осажденного неорганическими кислотами казеина образуется кислая сыворотка с рН 4,3–4,6. В таблице 15.1 указан примерный состав сыворотки, получаемой при производстве сыра и казеина.

Таблица 15.1

Примерный состав отделенной сыворотки, %

	Подсырная кислота	Соляная кислота Казеиновая сыворотка
Ингредиент	%	%
Сухие в-ва	6.0	6.4
Вода	94	93.6
Жир	0.05	0.05
Чистый белок	0.60	0.60
Небелковые азотные соединения	0.20	0.20
Лактоза	4.5	4.6
Зола (минеральные вещества)	0.5	0.8
Кальций	0.035	0.12
Фосфор	0.040	0.065
Натрий	0.045	0.050
Калий	0.14	0.16
Хлориды	0.09	0.11
Молочная к-та	0.05	0.05

Сыворотку часто разбавляют водой. Приведенные выше цифры относятся к неразбавленной сыворотке. Что касается фракции NPN (небелковых азотистых соединений), около 30 % ее состоит из мочевины. Остальную часть составляют аминокислоты и пептиды (гликомакропептид, полученный при сычужной коагуляции). В таблице 15.2 приведены некоторые области использования сыворотки и изготовленных из нее продуктов.
Достижения в области мембранной фильтрации и хроматографии подвели фундамент под экономически обоснованные промышленные процессы разделения сыворотки на высокочистый белок и производные лактозы, что позволяет конечным потребителям использовать различные функциональные возможности отдельных компонентов сыворотки. Эта тенденция, как ожидается, продолжится, так как исследования выявляют новые биоактивные свойства, а потребители узнают больше о пищевой ценности сыворотки.

Таблица 15.2

Примеры использования сыворотки и продуктов на ее основе

Продукт из сыворотки	Сыворотка					Концентрат сыворотки или порошок					Сывороточный белок концентрат или порошок					Лактоза и Сухой пермеат
	Жидкая сыворотка		Природная	Подслащенная	Обессоленная 40-50	Обессоленная 70-90	Без лактозы	Безбелковая		КСБ 35-59	КСБ 60-80	Изолят сывороточного белка		Исходная	Пищевая	Очищенная пищевая	Фармацевтика	Сухой пермеат
Корм для скота	X		X		X		X			X								X
Потребление человеком
Детское питание						X				X	X				X	X
Диетическое питание										X	X				X
Спортивное питание											X	X
Лечебное питание											X	X
Колбасы											X
Супы			X	X	X					X								X
Выпечка	X		X							X								X
Заправки к салатам			X
Мороженое										X
Сывороточные пасты/сыры			X
Сыры			X								X
Напитки	X										X	X				X
Кондитерские изделия			X	X	X					X					X	X		X
Фармацевтические продукты																	X
Дрожжевые продукты	X													X
Промышленные изделия

Блок-схема на рис. 15.1 обобщает различные процессы, используемые при обработке сыворотки и ее конечных продуктов. Первым этапом является фильтрация частиц творога, оставшихся в сыворотке, после чего следует сепарация мелких остатков жира и казеина (рис. 15.2) частично, чтобы увеличить экономический эффект, и частично, потому что такие компоненты влияют на последующую обработку.
Использование сухихвеществ, содержащихся в сыворотке, обычно сводится к производству сухой сыворотки, безлактозной сыворотки и лактозы. Однако растущий спрос на сывороточные белки привел к тому, что примерно 40 % переработанных сухих веществ, полученных из сыворотки, направляется на сопутствующие продукты КСБ35-80, изолят сывороточного белка (ИСБ), лактозу и пермеат. Закончился переход от восприятия сыворотки как ненужного отхода производства к признанию ее роли в качестве ценнейшего источника питательных веществ. Некоторые используемые сегодня продукты описаны в этой главе.

Рис. 15.1

Варианты переработки сыворотки

Различные технологии переработки сыворотки

Сыворотка должна быть переработана как можно быстрее после ее получения из сырной массы, так как благодаря ее температуре и составу в ней начинают быстро размножаться бактерии, расщепляющие белок и выделяющие молочную кислоту.

Рекомендуется получать сыворотку непосредственно в процессе производства сыра, непродолжительное время накапливать ее в буферном танке, затем очищать, сепарировать, пастеризовать и охлаждать для хранения в ожидании дальнейшей переработки.

ИЗВЛЕЧЕНИЕ КАЗЕИНОВЫХ ЧАСТИЦ И СЕПАРИРОВАНИЕ ЖИРА

В сыворотке всегда присутствуют частицы казеина. Они отрицательно воздействуют на сепарирование жира, поэтому их следует удалить из сыворотки в первую очередь. Для этого можно использовать различные типы сепарирующих устройств (например, циклоны, центробежные сепараторы или вибрирующие/вращающиеся фильтры) (рис. 15.2).

Рис. 15.2

Мелкая фракция и сепарирование жира из сыворотки

1. Танк для сбора сыворотки 
2. Осветлитель 
3. Танк для мелкой фракции 
4. Сепаратор подсырных сливок 
5. Пастеризатор сыворотки 
6. Танк для подсырных сливок 
7. Сыворотка для дальнейшей переработки

 

ЖИР ОТДЕЛЯЕТСЯ С ПОМОЩЬЮ ЦЕНТРОБЕЖНЫХ СЕПАРАТОРОВ

Собранные мелкие частицы часто спрессовывают, подобно сыру, после этого их можно использовать при производстве плавленого сыра, а после созревания также и в кулинарии.

Содержание жира в подсырных сливках в основном составляет 25–30 %, их можно повторно использовать для нормализации молока при производстве сыра, а также для производства специальных продуктов с повышенным содержанием жира. Обычно это хорошо работает в случае сыров с коротким сроком созревания, таких как моцарелла, но следует учитывать, что с удлинением срока созревания увеличивается риск появления прогорклого привкуса. Важно исключить рециркуляцию, чтобы избежать накопления свободных жирных кислот и других нежелательных веществ, которые не задерживаются творожной матрицей. При производстве чеддера подсырные сливки обычно повторно не используются из-за чувствительности закваски к бактериофагам. В некоторых других случаях подсырные сливки перерабатываются в подсырное масло.

ПАСТЕРИЗАЦИЯ И ОХЛАЖДЕНИЕ

Сыворотка, которую до обработки предполагается хранить, должна быть или охлаждена, или пастеризована и охлаждена сразу после отделения жира и мелких фракций. При кратковременном хранении (< 8 часов) для снижения активности бактерий охлаждения до < 5 °C обычно достаточно. При более продолжительном хранении и использовании сыворотки в высококачественных продуктах для детей и спортивного питания необходимо произвести пастеризацию сыворотки сразу после удаления жира и мелких фракций, обычно такой подход рекомендуется для удовлетворения все более строгих требований к качеству продукции.

КОНЦЕНТРИРОВАНИЕ СУХИХ ВЕЩЕСТВ

КОНЦЕНТРАЦИЯ

Первый этап концентрирования сыворотки обычно включает повышение содержания сухого вещества с примерно 6 % до 18–25 % с использованием обратного осмоса или обратного осмоса в сочетании с нанофильтрацией. После этого сыворотку можно или перевезти на другой участок для дальнейшей обработки (например, для выпаривания и высушивания), или высушить непосредственно на месте.
При содержании сухих веществ выше 25–30 % более экономичным является использование выпаривания с помощью механической рекомпрессии пара (МРП) для повышения концентрации сыворотки. Использование МРП на этом втором этапе повышения концентрации сыворотки может повысить содержание сухих веществ с примерно 20 % до 45–65 %.
После выпаривания концентрат быстро охлаждают до 30–40 °C, вызывая тем самым зарождение кристаллов лактозы, после чего продолжают охлаждение и перемешивание в специальных танках для кристаллизации. Продукт выдерживают в кристаллизаторах 4–8 часов для получения однородного распределения мелких кристаллов лактозы, которые при распылительной сушке позволяют получить негигроскопичный продукт.
Концентрированная сыворотка представляет собой перенасыщенный раствор лактозы, при определенных условиях температуры и концентрации она может начать спонтанно кристаллизоватьсядотого, как покинет выпарной аппарат. При концентрациях сухих веществ свыше 65 % продукт становится настолько вязким, что теряет текучесть. Дополнительная информация по обратному осмосу и выпарным аппаратам приведена в главе 6, в разделах 6.4 и 6.5.

СУШКА

Обычно сыворотку сушат так же, как молоко, то есть в барабанных или распылительных сушилках (см. главу 17 «Сухое молоко и сыворотка»).

При использовании барабанных сушилок возникаетпроблема:сложно снятьслой сухой сыворотки с поверхности барабана. Поэтому перед сушкой с сывороткой смешивается наполнитель (например, пшеничные или ржаные отруби), чтобы облегчить процесс удаления сухого продукта.

Распылительная сушка сыворотки является наиболее широко используемым методом. Перед сушкой концентрат сыворотки обрабатывается, как было описано ранее, для того чтобы в нем образовались небольшие кристаллы лактозы, благодаря этому продукт становится негигроскопичным и не образует комков при впитывании влаги.
Кислую сыворотку, которая образовалась при производстве домашнего сыра и казеина, сложно высушивать из-за высокого содержания молочной кислоты. Она слипается и образует комки в распылительной сушилке. Сушка может быть облегчена путем нейтрализации и введения добавок (например, обезжиренного молока и зерновых продуктов).

РАЗДЕЛЕНИЕ СУХИХ ВЕЩЕСТВ НА ФРАКЦИИ

ИЗВЛЕЧЕНИЕ БЕЛКА

Первоначально для выделения сывороточных белков использовали различные технологии осаждения, но сегодня в дополнение к технологиям осаждения и комплексообразования используется мембранное разделение (фракционирование) и хроматографические процессы. Финк (Fink) и Кесслер (Kessler) (1988 г.) установили, что максимальная степень денатурации сывороточных белков составляет 90 % для всех денатурируемых фракций. Протеозопептонная
фракция, составляющая около 10 % сывороточных белков, считается неденатурируемой. Сывороточные белки в качестве составной части сухой сыворотки могут быть легко
получены путем ее тщательной сушки. В результате было разработано выделение сывороточных белков. Сывороточные белки, полученные методом мембранного разделения или с помощью ионообменной технологии, имеют хорошие функциональные показатели, такие как растворимость, пенообразование, эмульгирование и гелеобразование.

ИЗВЛЕЧЕНИЕ БЕЛКА С ПОМОЩЬЮ УЛЬТРАФИЛЬТРАЦИИ

Концентрат белка имеет очень хороший спектр аминокислот с высоким содержанием доступного лизина и цистеина.
Концентраты сывороточных белков (КСБ) – это порошки, получаемые при высушивании ультраконцентрата, образующегося при ультрафильтрации сыворотки. Они характеризуются содержанием в них белка (процент белка в сухом веществе), которое колеблется от 35 до 85 %. Для получения продукта, содержащего 35 % белка, жидкую сыворотку необходимо сконцентрировать по содержанию белка приблизительно в 6 раз до достижения уровня содержания сухих веществ 9 %.

Пример: 100 кг сыворотки дает выход примерно 17 кг ультраконцентрата и 83 кг пермеата после концентрирования в 6 раз (5,88). В таблице 15.3 приведен состав сыворотки на входе и получаемых ультраконцентрата и пермеата.
Содержание белка (%) в сухом остатке, вычисленное по данным таблицы 15.3.
В процессе концентрации сохраняется большая часть протеина, обычно >99 % вместе с практически 100 % жира. Концентрации лактозы, небелковых азотистых соединений и минеральных веществ в ретентате и пермеате практически такие же, как и в исходной сыворотке, за исключением незначительного снижения их содержания в пермеате.

Таблица 15.3

Состав сыворотки и получаемых ультраконцентрата и пермеата

Компонент	Содержание в 100 кг Исходной сыворотки %	Содержание в 16.7 кг Ультраконцентрата %	Содержание в 83.3 кг Пермеата %
Чистый белок	0.55	3.25	0.01
Лактоза	4.80	5.34	4.69
Зола	0.55	0.76	0.51
НАС*	0.18	0.24	0.17
Жир	0.03	0.18	Traces
Всего сухих веществ DM	6.11	9.77	5.38
ВБK**35.72		35.72
*НАС — Небелковые азотистые соединения
** ВБK = Всего белков по Кьельдалю

Конечные данные по содержанию во многом зависят от:

• типа мембраны;
• параметров потока;
• типа исходной сыворотки (разбавленная водой, предварительно концентрированная после деминерализации и т. д.).

Для получения концентрации протеина выше 80 % жидкая сыворотка сначала концентрируется в 20–30 раз по белку путем ультрафильтрации до содержания сухих веществ 25 %; такая концентрация считается наиболее приемлемой с экономической точки зрения для производства. Затем необходимо провести диафильтрацию концентрата, чтобы удалить как можно больше лактозы и минералов и увеличить концентрацию белка относительно общего содержания сухих веществ. Диафильтрация – это процедура, при которой во время фильтрации в продукт добавляется вода, чтобы вымыть низкомолекулярные вещества, обычно лактозу иминеральные соли, которые пройдут через мембрану.

Таблица 15.4

Состав некоторых сухих концентратов сывороточного белка в %

Продукт	1	2	3	4
Белок в сухом остатке	35	50	65	80
Влага	3.8	3.8	3.8	3.8
Неочищенный белок (Nx6.38)	36.2	52.1	63.0	81.0
Чистый белок	29.7	40.9	59.4	75.0
Лактоза	46.5	30.9	21.1	3.5
Лактоза	2.1	3.7	5.6	7.2
Зола	7.8	6.4	3.9	3.1
Молочная кислота	2.8	2.6	2.2	1.2
Спецификация продуктов:
1Заменитель обезжиренного молока, 35% белка в сухом остатке
2 Белковая добавка в другие пищевые продукты, 50% белка в сухом остатке
3 Практический предел концентрации белка прииспользовании только ультрафильтрации, 65% белка в сухом остатке
4Продукт после ультрафильтрации и диафильтрации, 80% белка в сухом остатке

В таблице 15.4 приведены составы некоторых типичных сухих концентратов сывороточных белков (КСБ).
Линия по производству сухих концентратов сывороточных белков при помощи УФ показана на рис. 15.3. Около 95 % сыворотки переходит в пермеат, при этом в сухом продукте концентрация белка может достигать 80–85 % (в расчете на содержание сухих веществ). Обычно при повышении концентрации белков выше 60 % от сухого вещества выпариватель не применяется, чтобы снизить до минимума тепловое повреждение белков. Развитие нанофильтрации для повышения концентрации позволяет повышать концентрацию этих продуктов перед сушкой выше 35 % по сухому веществу. Дополнительная информация по использованию ультрафильтрации приведена в главе 6.4 «Мембранная технология».

Рис. 15.3

Процесс извлечения сухого протеина при помощи ультрафильтрации (УФ) Содержание белка (%) в сухом остатке, вычисленное по данным таблицы 15.3.

1. Установка для ультрафильтрации 
2. Буферный танк для сывороточного пермеата 
3. Буферный танк для УФ-ретентата 
4. Выпариватель 
5. Распылительная сушилка
6. Фасовка

ИЗОЛЯТ СЫВОРОТОЧНОГО БЕЛКА

Изолят сывороточного белка (ИСБ), содержащий > 92 % белка в сухом остатке, находит все более широкое применение, например в пищевых добавках для культуристов – там, где жир и другие небелковые компоненты нежелательны, так же как и в заменителях яичных белков для взбитых продуктов, таких как безе, или в качестве ценного компонента пищевых продуктов и кислых фруктовых напитков.
Развитие микрофильтрации в значительной степени улучшило качество и экономические показатели существующих продуктов, переходя в последние годы от традиционного процесса горячего фильтрования на керамических мембранах к холодному процессу на органических спиральных мембранах.
Обработка сывороточного ретентата из УФ-установки, содержащего примерно 35 % белка в сухом веществе, может снизить содержание жиров в концентрате сывороточного белка с 7 % до менее чем 0,4 %. Микрофильтрация также повышает концентрацию мембран жировых шариков и большей части бактерий в МФ-концентрате, который собирается и перерабатывается отдельно,
в некоторых случаях этот концентрат высушивается в той же сушилке, что и ИСБ, что приводит к повышенному содержанию жира вКСБ70. Обезжиренный МФ-пермеат направляется во вторую УФ-установку для дальнейшей концентрации, наэтой стадиитакже используется диафильтрация. Как показано на рис. 15.4, предварительно обработанная сыворотка закачивается в установку.
УФ (4), где она концентрируется примерно до 35 % белка в сухом веществе. Этот концентрат закачивается в установку МФ (5), а пермеат после прохождения концентрации обратным осмосом и охлаждения направляется в сборный танк.
Ретентат после МФ-обработки, который содержит основную часть жира и бактерий, собирается отдельно, а обезжиренный пермеат отправляется на дальнейшую ультрафильтрацию и диафильтрацию (6). Полученный концентрат ИСБ затем снова концентрируется, используя НФ с высокой концентрацией (35–37 % сухого вещества), и сушится распылением для уменьшения содержания влаги, которая перед фасовкой не должна быть выше 4 %.

Рис. 15.4

Процесс обезжиривания концентрата сывороточных белков

1. Пастеризатор 
2. Сепаратор 
3. Танк для выдержки 
4. Блок УФ 
5. МФ для удаления жира 
6. УФ и диафильтрация

УФ-ПЕРМЕАТ

УФ-пермеат после получения КСБ и ИСБ может быть высушен распылением или использован для получения лактозы. Данные процессы будут объяснены ниже более подробно.

ИСБ И ПЕРМЕАТ ИЗ ОБЕЗЖИРЕННОГО МОЛОКА

Производство «идеальных» или «натуральных» сывороточных продуктов из обезжиренного молока привлекает все больше внимания из-за уникальных свойств получающихся продуктов, вызванных тем, что само молоко не подвергалось воздействию сычужного фермента, закваски или кислоты. Следовательно, в продукте отсутствуют ГМП (гликомакропептиды), уровень молочной кислоты не превышает естественный, нет разложения белков ферментами закваски и риска воздействия бактериофагов.
Как показано на рис 15.5, обезжиренное молоко сначала подвергается микрофильтрации (1) для отделения казеина (концентрат МФ) от пермеата, содержащего сывороточные белки, лактозу, небелковый азот и золу. Концентрат в жидкой или порошкообразной форме может быть использован в различных продуктах, где полезно обогащение казеином, в том числе в сырах, молочных десертах и напитках.
Затем используется ультрафильтрация – диафильтрация (3), чтобы отделить сывороточный белок (УФ-концентрат) от лактозы, золы и небелкового азота (УФ-пермеат), чтобы получить выход обогащенного белка с> 90 % белка в сухом веществе. После хранения (6) УФ-концентрат может быть подвергнут дальнейшей концентрации до 36–37 % сухого вещества, подвергнут тепловой обработке (10) для получения необходимых качеств и высушен (11) до состояния, при котором влажность не будет превышать 4 %.

Оставшийся пермеат после УФ (4) концентрируется на месте и затем хранится для дальнейшей переработки. Тип мембраны, используемой для повышения концентрации пермеата, зависит от того, будет ли он использован для нормализации содержания белка в сухих молочных продуктах, высушен и будет в дальнейшем использован как пермеат или будет использован при производстве лактозы. Ниже это будет раскрыто более подробно. Молочный УФ-пермеат также вырабатывается при производстве КМБ (концентрата молочного белка), в этом случае обезжиренное молоко направляется непосредственно на УФ-ДФ (3), см. рис. 15.5.

Рис. 15.5

Процесс получения ИСБ и молочного пермеата из обезжиренного молока

1. Установка микрофильтрации
2. Танк сбора концентрата после микрофильтрации
3. Установка для ультрафильтрации – диафильтрации
4. Установка фильтрации пермеата обратным осмосом и нанофильтрацией 
5. Танк сбора концентрированного пермеата 
6. Танк сбора изолята сывороточного белка
7. Мембранная установка повышения концентрации ИСБ 
8. Установка обратного осмоса/доочистки 
9. Танк для хранения воды 
10. Предварительный подогреватель ИСБ 
11. Распылительная сушка 
12. Фасовка

ВЫДЕЛЕНИЕ ДЕНАТУРИРОВАННЫХ СЫВОРОТОЧНЫХ БЕЛКОВ

В основном сывороточные белки не осаждаются при воздействии сычужного фермента или кислоты. Тем не менее возможно осаждение сывороточных белков с помощью кислоты, если они предварительно были подвергнуты термическому денатурированию. Процесс разделяется на две стадии:

• осаждение (денатурация) белка при одновременной термической обработке и регулировке рН;
• концентрирование белков центробежным сепарированием.

Денатурированные сывороточные белки могут быть смешаны с молоком, предназначенным для производства сыра перед сычужным свертыванием; они захватываются пространственной трехмерной решеткой, образованной молекулами казеина при коагуляции. Это открытие способствовало активному поиску метода осаждения и отделения сывороточных белков, также как и технологии для оптимизации выхода. В некоторых странах добавка денатурированных сывороточных белков в сыр не разрешена законом, иногда речь идет о конкретных видах сыра. Денатурированные белки, будучи добавленными или в результате пастеризации при высокой температуре, влияют как на выход, так и на созревание сыров. На рис. 15.6 показана технологическая линия Centri-Whey для производства денатурированных сывороточных белков. После регулирования уровня рН сыворотка перекачивается через промежуточный танк (1) в пластинчатый теплообменник (2) для регенеративного нагрева. Температура сыворотки поднимается прямым впрыском пара (3) до 90–95 °С, после чего он проходит через трубчатую секцию выдержки (4) со временем выдержки 3–4 мин. На этой стадии для снижения уровня рН вводится кислота. Кислота может быть как органической, так и неорганической (например, молочная кислота или пищевая хлористоводородная/соляная кислота). Те белки, которые могли быть и были модифицированы под действием тепла, осаждаются в трубчатой секции выдержки (4) в течение 60 секунд.
После регенеративного охлаждения примерно до 40 °С осажденные белки отделяются отжидкой фракции в сепараторе-очистителе (6), где удаляются нерастворимые частицы. Очиститель разгружается с интервалами около 3 мин. Собранный белок представляет собой 12–15%-ный концентрат с содержанием чистого белка 8–10 %. Этот метод позволяет выделить 90–95 % коагулируемых белков.
Добавление концентрированных сывороточных белков в молоко, предназначенное для производства сыра (особенно в производстве мягких и полутвердых сыров), вызывает незначительные изменения в характеристиках коагуляции. Структура сгустка улучшается и становится более однородной, чем при обычных методах. Обработанные сывороточные белки являются более гидрофильными, чем казеин. При производстве сыра Камамбер, например, отмечено увеличение выхода продукта на 12 %.

Рис. 15.6

Извлечение денатурированных сывороточных белков

1. Танк для сбора сыворотки 
2. Пластинчатый теплообменник 
3. Паровой инжектор 
4. Трубы выдержки 
5. Танк для кислоты 
6. Сепаратор-очиститель 
7. Танк для сбора денатурированных сывороточных белков

УФ-ПЕРМЕАТ ИЗ СЫВОРОТКИ И ОБЕЗЖИРЕННОГО МОЛОКА

В настоящее время существует небольшой выбор вариантов дальнейшей переработки УФ- пермеата из сыворотки и обезжиренного молока, как показано ниже. Только молочный УФ- пермеат и лактоза могут быть использованы для нормализации молочных сухих продуктов по содержанию белка.
Процессы производства лактозы и сухого пермеата показаны ниже на рис. 15.7.

Рис. 15.7

Некоторые типичные варианты использования УФ-пермеата из сыворотки и молока

ВЫДЕЛЕНИЕ ЛАКТОЗЫ

Лактоза является основным ингредиентом сыворотки. Существуют два основных метода ее выделения в зависимости от исходного сырья:

• кристаллизация лактозы в необработанной, но концентрированной сыворотке;
• кристаллизация лактозы в сыворотке, из которой перед концентрацией был удален белок при помощи ультрафильтрации или другого метода.

При использовании обоих методов получается слой мелассы, который может быть высушен и использован в качестве корма для скота. Пищевая ценность продукта может быть значительно повышена, если из мелассы были удалены соли и добавлены высококачественные белки.

КРИСТАЛЛИЗАЦИЯ

Цикл кристаллизации определяется следующими факторами:

• поверхностью кристалла, доступной для роста;
• чистотою раствора;
• степенью насыщения;
• температурой;
• вязкостью;
• перемешиванием кристаллов в растворе.

Некоторые из этих факторов взаимно связаны друг с другом (например, степень насыщения раствора и вязкость). На рис. 15.8 показана технологическая линия для производства лактозы. Сыворотка предварительно концентрируется в вакуум-выпарном аппарате до концентрации 60–62 % сухих веществ и направляется в танки для кристаллизации (2), где в нее добавляется затравка (кристаллы). Кристаллизация происходит медленно в зависимости от предварительно установленной программы температура/время. Танки снабжены охлаждающими рубашками и оборудованием для регулирования температуры охлаждения. Они также снабжены специальными мешалками. После кристаллизации суспензия обрабатывается в декантирующей центрифуге и фильтрующей центрифуге (3), где происходит сепарирование кристаллов, которые высушивают (4) до порошкообразного состояния. После измельчения (обычно в молотковой дробилке) и просеивания лактоза упаковывается (5). Для более простого и эффективного отделения кристаллов лактозы из раствора стартовая кристаллизация должна проводиться таким образом, чтобы размер кристаллов превышал 0,2 мм (чем больше,тем лучше разделение). Степень кристаллизации определяется количеством b-лактозы, превратившейся в требуемую форму a-лактозы, поэтому охлаждение должно проводиться в строго контролируемых, оптимизированных условиях.

Рис. 15.8

Линия производства лактозы

1. Выпариватель 
2. Танки для кристаллизации 
3. Декантерные центрифуги 
4. Сушилка с псевдоожиженным слоем
5. Упаковка

Сепарирование лактозы

Для сбора кристаллов лактозы могут использоваться центрифуги различныхтипов. Одна из них – это горизонтальная декантерная центрифуга (рис. 15.9), которая работает непрерывно и имеет шнековый конвейер для вывода лактозы. Два аппарата устанавливаются последовательно. Лактоза, полученная на первом, проходит вторичное сепарирование на втором. Во время сепарирования посторонние ингредиенты вымываются из лактозы таким образом, что достигается высокая степень очистки. Остаточное содержание влаги в лактозе после второго сепарирования не превышает 9 %, а содержание чистой лактозы в сухом веществе составляет около 99 %.

Рис. 15.9

Декантерная центрифуга

1. Загрузка
2. Выход жидкой фракции 
3. Выход твердой фракции

Сушка

Лактоза высушивается после сепарирования до содержания остаточной влаги 0,1–0,3 % в зависимости от дальнейшего использования продукта. Во время сушки температура не должна превышать 93 °С, так как при более высоких температурах образуется b-лактоза. Время сушки также должно учитываться. Во время быстрой сушки образующийся тонкий слой аморфной (бесформенной некристаллической) лактозы способствует формированию α-кристаллогидрата, что в дальнейшем может привести к образованию комков. Обычно сушку производят в сушильном аппарате с псевдоожиженным слоем. Поддерживается температура 92 °С, время сушки составляет 15–20 мин. Высушенный сахар транспортируется воздухом при температуре 30 °С, который также охлаждает сахар.
Кристаллы обычно перемалывают в порошок сразу после сушки и расфасовывают.

РАФИНИРОВАНИЕ ЛАКТОЗЫ

В некоторых случаях требуется более высокая степень чистоты продукта (например, при производстве фармацевтических препаратов). Рафинирование лактозы также может улучшить выход лактозы в процессе производства.
Обычный метод производства лактозы для фармацевтики включает повторное растворение лактозы после декантера с содержанием 60 % сухого вещества в умягченной воде с рН 4 при температуре, близкой к 100 °C, после чего смешивают с активированным углем и дополнительно фильтруют. После фильтрации раствор лактозы поступает втанк, где происходит рекристаллизация, после чего его сепарируют, сушат, перемалывают и упаковывают. Это дорогостоящий процесс, при котором требуется удвоение количества оборудования для обеспечения непрерывности процесса, а активированный уголь и фильтрующий агент уходят в отходы.
С недавних пор альтернативные процессы, включающие непрерывную декальцинацию и удаление рибофлавина (причину желтого оттенка лактозы), при использовании колонны с регенерируемым активированным углем позволяют получить белую рафинированную лактозу с меньшими затратами. Эти процессы даже позволяют получить лактозу фармацевтического качества после добавления еще одной процедуры декантирования и промывания.

СУХОЙ ПЕРМЕАТ

Вместо получения лактозы из УФ-пермеата можно производить сухой пермеат с помощью процесса, показанного на рис. 15.10. Сухой пермеат в последнее время все более широко применяется для производства корма для скота и пищевых продуктов, где не требуется лактоза высокой чистоты, и процент золы в пермеате считается допустимым. Обычно этот вариант, не требующий больших вложений, не вызывает проблем, связанных с утилизацией маточного раствора или «мелассы», и имеет почти 100%-й выход лактозы в основной продукт.

Функциональные свойства, такие как сыпучее состояние, неслипаемость, цвет и вкус в течение длительного сроках ранения, очень важны для сухого пермеата, и условия производства должны быть тщательно подобраны с учетом этих требований.

УФ-пермеат сначала концентрируется (1) до 20–25 % сухого вещества, далее поступает в MVR испаритель и быстро охлаждается (2) для инициирования спонтанного образования кристаллов лактозы, а затем хранится в условиях с регулируемой температурой в системах кристаллизации особой конструкции (3), чтобы добиться высокого процента кристаллизации лактозы (> 75 %). Спустя примерно 4 часа кристаллизованный пермеат подается в распылительную сушилку, оборудованную ремнем синхронизации, где сушится в условиях, способствующих кристаллизации остатков лактозы (> 95 %), для получения сыпучего негигроскопичного продукта. После этого продукт хранится (5) не менее 6 часов для окончания процесса кристаллизации, после чего фасуется в мешки по 25 кг или автоцистерны.

Также используются альтернативные процессы, позволяющие получить высокую концентрацию пермеата > 80 % сухого вещества и непрерывную кристаллизацию перед высушиванием. Высокие температуры, необходимые для облегчения работы с очень вязким концентрированным пермеатом, следует подбирать очень осторожно, так как они могут отрицательно сказаться на качестве продукта, в первую очередь на его цвете и вкусе.

Таблица 15.5

Степень фильтрации ингредиентов нормальной сладкой сыворотки при нанофильтрации

Условия		Снижение	%
Конечное содержание сухих веществ	22 %	Калий	31
Кратность концентрации	4 x	Натрий	33
Температура	21 °C	Хлориды	67
Давление	2.5 Мпа (25 бар)	Кальций	3
		Магний	4
		Магний	4
		Фосфор	6
		Цитраты	0
		Лактаты	<3
		Зола	30
		Небелковый азот	27
		Лактоза	1

Рис. 15.10

Процесс производства сухого пермеата

1. Концентрированный пермеат 
2. Выпариватель пермеата 
3. Система кристаллизации 
4. Сушка пермеата и посткристаллизация 
5. Хранилище сухого пермеата

ДЕМИНЕРАЛИЗАЦИЯ (УДАЛЕНИЕ СОЛЕЙ)

Поскольку сыворотка имеет достаточно высокое содержание солей (около 8–12 % в пересчете на сухой остаток), ее пригодность в качестве пищевого продукта ограничена. Но после деминерализации может, однако, открыться широкое поле для применения сыворотки, которая была частично (на 25–30 %) или в значительной степени (на 90–95 %) деминерализована. Частично деминерализованный концентрат сыворотки может использоваться, например, при производстве мороженого, хлебобулочных изделий и даже кварка, в то время как высокодеминерализованная сухая сыворотка, или концентрат, может быть использована при изготовлении продуктов детского питания, а также очень многих других продуктов.

ПРИНЦИПЫ ДЕМИНЕРАЛИЗАЦИИ

Деминерализация включает в себя удаление неорганических солей и небольшое снижение содержания органических ионов, таких как лактаты и цитраты.
Частичная деминерализация основана наиспользованиипоперечных фильтрующихмембран, предназначенных пропускать частицы размером в пределах нанометра (10^-9 м). Такой тип фильтрации называется нанофильтрацией (НФ).

Деминерализация высокой степени основана на применении одного из двух методов:

• электродиализа;
• ионного обмена.

ЧАСТИЧНАЯ ДЕМИНЕРАЛИЗАЦИЯ С ПОМОЩЬЮ НФ

При использовании специальной мембраны обратного осмоса небольшие частицы, такие как некоторые моновалентные ионы, например, ионы натрия, калия, хлора, и не большие органические молекулы, такие как мочевина и молочная кислота, могут пройти сквозь мембрану вместе с водным пермеатом. Такой мембранный процесс известен под разными названиями, такими как ультраосмос, «ослабленный» обратный осмос и нанофильтрация (НФ).
В настоящее время чаще всего используются спиральные мембраны, обладающие большей компактностью. Дополнительная информация о таких мембранах приведена в главе 6.4
«Мембранная технология».
Примеры скоростей фильтрации ингредиентов обычной сладкой сыворотки при нанофильтрации приведены в таблице 15.5.
Как показывает таблица, снижение содержания хлоридов всладкой сыворотке может достигать 70 %, а натрия и калия – 30–35 %. Причиной такой разницы в концентрациях ионов является необходимость поддержания электрохимического баланса между положительно и отрицательно заряженными ионами.

Важным аспектом нанофильтрации при обработке сыворотки является то, что утечку лактозы необходимо свести к минимуму (менее 0,1 %), чтобы избежать проблем с высокой биологической потребностью в кислороде (БПК) в отработанной воде (пермеате). Установка оборудования НФ на линии обработки сыворотки может потребоваться в следующих ситуациях:

• в качестве недорогой альтернативы для устранения соленого привкуса обычной сладкой сухой сыворотки;
• в качестве предварительного этапа обработки перед окончательной деминерализацией сыворотки путем электродиализа и ионного обмена;
• для удаления кислоты из сыворотки, при производстве казеина с применением соляной или молочной кислоты; следует учесть, что скорость фильтрации ионов лактатов низкая, а у свободных молекул молочной кислоты – высокая;
• для снижения содержания соли в соленой сыворотке (например, при производстве сыра Чеддер).

ДЕМИНЕРАЛИЗАЦИЯ ВЫСОКОЙ СТЕПЕНИ

ЭЛЕКТРОДИАЛИЗ

Электродиализом называется перенос ионовчерез неселективные полупроницаемые мембраны под действием постоянноготока и приложенной разницы потенциалов. Используемые мембраны имеют функции обмена как анионов, так и катионов, что позволяет при электродиализе снизить минеральное содержание в обрабатываемой жидкости (например, морской воде или сыворотке). Два электрода на концах батареи элементов имеют раздельные каналы для омывания, как показанона рис. 15.11, через которые циркулирует отдельный подкисленный поток, защищающий электроды от химического воздействия.
При обработке сыворотки входящая сыворотка и подкисленный рассол проходят через чередующиеся ячейки батареи, чья конструкция может быть сравнена с конструкцией пластинчатого теплообменника или пластинчатого модуля ультрафильтрации. На рис. 15.11 приведена схема устройства электродиализной установки. Она состоит из набора отсеков, разделенных чередующимися катионными и анионными обменными мембранами, которые располагаются на расстоянии не более 1 мм друг от друга. В крайних отсеках находятся электроды. Между каждой парой электродов может находиться до 200 таких ячеек.

Рис. 15.11

Батарея ячеек для электродиализа
A = анионы = отрицательно заряженные
C = катионы = положительно заряженные
DC = постоянный ток

Принцип работы

Чередующиеся ячейки в блоке электродиализа работают, соответственно, как ячейки разбавления и концентрирования. Сыворотка проходит через ячейки разбавления, а 5%-й рассол (раствор- носитель) – через ячейки концентрирования.
Когда постоянный ток (DC) подается на электроды на концах блока, катионы стараются переместиться к катоду, а анионы – к аноду, как показано на рис. 15.11. Тем не менее свободное перемещение ионов невозможно, поскольку мембраны действуют как барьеры для ионов одноименного с ними заряда. Анионы могут проходить через анионную мембрану, но останавливаются катионной мембраной.
И наоборот, катионы могут проходить через катионную мембрану, но останавливаются анионной мембраной. В результате происходит снижение концентрации ионов в ячейках разбавления (в сыворотке). Сыворотка, таким образом, деминерализуется до уровня, который зависит от содержания золы в сыворотке, времени ее нахождения в установке, плотности тока и вязкости жидкости.
Установка для электродиализа может работать как в непрерывном режиме, так и в периодическом. Периодическая система, которая часто используется для деминерализации свыше 70 %, может состоять из одного набора мембран, в котором обрабатываемая жидкость, то есть сыворотка, циркулирует до достижения требуемого уровня содержания солей. Этот уровень определяется по электропроводности обрабатываемой жидкости. Время нахождения жидкости втакой системе может составлять 2–3 часа для 90 % деминерализации при 10–15 °С. При этом желательна предварительная концентрация сыворотки до 20–30 % сухих веществ с целью снижения расхода электроэнергии и увеличения производительности. Перед загрузкой в установку для электродиализа концентрированную сыворотку следует очищать.
Обрабатываемая жидкость в ходе процесса нагревается, поэтому необходим этап охлаждениядляподдержаниятребуемойрабочейтемпературы. При непрерывном производстве, использующем батареи мембран, соединенных последовательно, время выдерживания может быть сокращено до 10–40 минут. Максимальный уровень деминерализации на подобной установке обычно не превышает 60–70 %. Что касается производительности, то площадь установленных мембран в установке непрерывного действия значительно больше, чем в установке периодического действия.
Установка для электродиализа может быть легко автоматизирована и снабжена системой программируемой безразборной мойки. Процедура мойки обычно включает в себя промывку водой, промывку щелочным раствором (до рН 9), промывку водой, промывку соляной кислотой (рН 1) и заключительную промывку водой. Обычно программа мойки занимает 100 мин.

Электропитание и автоматизация

В установке для электродиализа используется постоянный ток, поэтому требуется наличие силового оборудования для регулировки тока в диапазоне от 0 до 185 А и напряжения в диапазоне от 0 до 400 В. Расход, температура, электропроводность и рН обрабатываемого продукта и технической воды, давление подачи продукта, разница давления между текущей жидкостьюиячейками установки,атакже напряжение на каждой ячейке установкиотображаются и контролируются в ходе работы.

Факторы, ограничивающие использование электродиализа

Основным ограничивающим фактором для использования электродиализа в молочном производстве является стоимость замены мембран, прокладок и электродов, которые составляют 35–40 % от общих эксплуатационных расходов завода. Замена бывает необходима вследствие засорения мембран, которое, в свою очередь, вызывается:

• осаждением фосфата кальция на поверхности мембраны катионного обмена;
• отложением белка на поверхности мембраны анионного обмена.

Первая проблема может быть отчасти устранена при правильном подборе профиля потока на поверхности мембраны и регулярной мойкой кислотой. Осаждение белков является основным фактором, снижающим срок службы анионных мембран. В основе этой проблемы лежит следующее: в сыворотке с нормальным значением рН сывороточные белки можно рассматривать как большие отрицательно заряженные ионы (анионы), которые перемещаются в растворе под действием электрического поля. Эти молекулы слишком крупные, чтобы пройти через мембраны анионного обмена, поэтому они образуюттонкий белковый слой на поверхности мембраны со стороны секции, по которой проходит сыворотка. Для удаления этих отложений с мембраны можно использовать, например, технологии изменения полярности.
Хотя при частой мойке растворами с высоким значением рН удаляется большая часть отложений, через каждые 2–4 недели рекомендуется проводить разборку установки для ручной мойки. Стоимость обработки электродиализом в большой мере зависит от степени деминерализации.Увеличение этой степени последовательно с 50 до 75 % и до 90 % каждый раз поднимает стоимость обработки вдвое. Это означает, что производственные расходы для продукта, деминерализованного на 90 %, в 4 раза больше, чем для продукта, деминерализованного на 50 %; причиной этого является снижение производительности установки при 90 % деминерализации. В стоимость работы установки также входят обработка водой, химическими соединениями, потребляемая электроэнергия и пар. Обработка отработанной воды является особо сложной задачей. В процессе обработки до 90 % деминерализации лактоза «вытекает» сквозь мембраны в количестве 7–10 %. Фосфаты, удаленные из сыворотки, также накапливаются в отработанной воде. Стоимость электроэнергии составляет 10–15 % от производственных затрат, в то время как химикаты, используемые в производстве, в основном соляная кислота, составляют менее 5 %. Стоимость пара, используемого для предварительного нагрева продукта, и стоимость охлаждения для поддержания температуры обработки составляет 10–15 % в зависимости от уровня деминерализации.
Электродиализ является наилучшим методом для деминерализации до уровня 70 %, где он успешно конкурирует с методом ионного обмена.

ИОННЫЙ ОБМЕН

В противоположность электродиализу, процессу, который удаляет ионизируемые вещества из растворов при постоянной электрохимической основе, ионообменный процесс использует смолы, адсорбирующие минеральные вещества из растворов в обмен на другие типы ионов. Смолы имеют ограниченную емкость, поэтому , когда они полностью насыщены, из них необходимо удалить все адсорбированные минеральные вещества и восстановить перед следующим использованием. Обычно смолы используются в фиксированных колоннах требуемой конструкции.
Ионообменные смолы–это макромолекулярные пористые пластичные материалы, спрессованные в гранулы диаметром от 0,3 до 1,2 мм для промышленного применения. С химической точки зрения они действуют как нерастворимые кислоты или основания, которые при превращении в соли остаются нерастворимыми. Основной характеристикой ионообменных смол является их способность замены подвижных ионов, которые они содержат, на ионы того же знака заряда, которые содержатся в обрабатываемом растворе. Простым примером подобной реакции является извлечение хлорида натрия, где R – это обменная группа нерастворимой смолы.

Катионный обмен R – H + Na+ = R – Na + H+ смола в форме H+

Анионный обмен R – OH + Cl– = R – Cl + OH– смола в форме OH–

Реакция, описанная выше, специально представлена в равновесном виде, поскольку направление реакции зависит от концентрации ионов в жидкости и в твердой фазе в смоле. Равновесие характеризуется константой. При регенерации реакция идет в обратном направлении, когда ионообменная смола, насыщенная натрием, обрабатывается, например 4%-м раствором соляной кислоты.
Высокая концентрация ионов водорода в кислоте сдвигает равновесие влево.
Константа равновесия в значительной мере зависит от типа ионов, что позволяет производить селективный ионообменный процесс. Проще говоря, многовалентные ионы имеют большую селективность, чем одновалентные, а ионы с одинаковой валентностью различаются по размеру. Крупные ионы имеют большую селективность. Что касается катионов, обычно находящихся в молочных продуктах, селективность уменьшается в следующем порядке: Ca²⁺ > Mg²⁺ > K⁺ > Na⁺.
Аналогично селективность при анионном обмене может быть охарактеризована следующим образом: цитрат^3– > HPO^2– > NO^– > Cl^–.
На практике это означает, что ионообменная смола после полного насыщения при обработке раствора, содержащего различные типы ионов, будет существовать в различных формах в разных участках вдоль колонны, как показано на рис. 15.12. На этом рисунке показано, что происходит при обработке обычной воды в колонне, загруженной катионообменной смолой с активным ионом водорода. Также показана ситуация после регенерации с помощью кислоты. Можно увидеть, что дольше всех в колонне катионного обмена задерживаются ионы натрия. Это следует из порядка селективности, описанного выше.

Возвращаясь к рисунку отработавшей катионообменной колонны, можно увидеть, что ионы натрия проходят, не задерживаясь, через ионообменную смолу первыми, за ними следуют ионы Mg²⁺ иCa²⁺. Просачивание ионов всостоянии истощения может произойти, когда ионообменная смола не полностью регенерирована, но при правильной регенерации ионы Na⁺ вымываются и заменяются ионами H⁺ (см. рис. 15.12). Состояние нижней части ионообменной колонны определяет попадание ионов в обработанную жидкость.

Рис. 15.12

Колонна с катионообменной смолой до и после регенерации кислотой

Характеристики ионообменных смол

Промышленные ионообменные смолы сегодня производятся из полимерных материалов, образующих пористую структуру. Обычно для этого используется полистирол/дивинилбензол и полиакрилаты. Функциональные группы химически связаны с матричной структурой.Типовыми группами являются:

• Сульфогруппа -SO₃^—H⁺ (сильнокислотный катионный обменник)
• Карбоксильные группы -COO^—H⁺ (слабокислотный катионный обменник)
• Четвертичный амин N⁺ OH^— (сильноосновной анионный обменник)
• Третичный амин NH⁺ OH^— (слабоосновной анионный обменник)

Как сильные основные,так и кислотные обменные смолы являются полностью ионизированными на всем рН-интервале от 0 до 14. Слабоосновные и кислотные обменные смолы имеют ограниченную зону рН, где они проявляют активность. Слабые кислотные обменные смолы обычно не используются при низком значении рн (0–7), поскольку карбоксильная группа в основном представлена в свободной кислотной форме, что определяется константой кислотно-основной диссоциации (часто выражается как рКа – отрицательный десятичный логарифм константы диссоциации). При значениях рН выше рКа карбоксильные группы находятся в форме соли и могут участвовать в ионообменных реакциях. И наоборот, слабоосновные анионные смолы активны только в нижнем рН-диапазоне 0–7.
С точки зрения упрощения процедуры регенерации предпочтительно везде, где возможно, использовать слабые смолы. Их можно регенерировать кислотой/основанием соответственно при превышении теоретически требуемого значения всего на 10–50 %. Для сильных кислот требуется превышение содержания кислоты/основания на 300–400 % по сравнению с теоретическим значением регенерации. Для деминерализации, согласно традиционной методике, сильнокислотная катионообменная смола, регенерированная ионами водорода, используется совместно со слабоосновной анионообменной смолой, работающей в свободной гидроксильной форме. Нельзя использовать слабокислотную анионообменную смолу вместо сильной, поскольку устанавливается благоприятное равновесие для связывания катионов водорода и гидроксильных групп.

Другими важными характеристиками ионообменных смол, которые в дальнейшем не рассматриваются, являются:

• ионообменная емкость;
• стойкость к разбуханию;
• механическая прочность;
• флюидизация (псевдоожижение) при промывании слоя обратным током;
• падение давления;
• ограничение скорости потока;
• требования к промывке водой после регенерации.

Ионообменные процессы при деминерализации

Для обработки воды деминерализация методом ионного обмена применялась давно, но она была адаптирована и для деминерализации сыворотки. По составу сыворотка не является однородным продуктом. Кислая сыворотка, полученная при производстве казеина/творога, имеет рН 4,3–4,6, в то время как рН сладкой сыворотки составляет 6,3–6,6. Основное различие между этими двумя типами сыворотки, помимо кислотности, это высокое содержание фосфата кальция в кислой сыворотке. Для вычисления степени минерализации сыворотки в качестве основы удобно использовать катионы, поскольку анионы, то есть цитраты и фосфаты, задействуются в протеолитических реакциях. Это затрудняет вычисление содержания конкретного иона в растворе. Типовое значение содержания катионов в сладкой и кислой сыворотках показано в таблице 15.6.
Сыворотку можно охарактеризовать как жидкость с высоким содержанием солей, что, в свою очередь, приводит к снижению продолжительности циклов ионного обмена. Это, в свою очередь, отражается в больших затратах на восстановительные химикаты, если они не регенерируются.

Таблица 15.6

Содержание катионов в сладкой и кислой сыворотках

Ион		Сладкая сыворотка				Кислая сыворотка
	%		м-экв/л		%		м-экв/л
Na	0.050		22.0		0.050		22.0
K	0.160		41.0		0.160		41.0
Ca	0.035		17.5		0.120		60.0
Mg	0.007		5.8		0.012		10.0
Итого:			86.3				133.0

Традиционный ионный обмен, используемый при деминерализации

На рис. 15.13 показана простая установка для деминерализации, работающая по принципу ионного обмена. Сыворотка сначала попадает в сильную катионообменную смолу с ионами водорода и идет далее в анионный обменник, где используется слабоосновная анионообменная смола в форме свободного основания. Ионообменные колонны промываются и регенерируются отдельно друг от друга разбавленной соляной кислотой и гидроксидом натрия (или аммония). Раз в день колонны дезинфицируются раствором с невысоким содержанием активного хлора. При деминерализации происходят следующие суммарные реакции (NaCI использованав качестве примера любой другой соли,содержащейся в сыворотке, a R представляет нерастворимую смолу).

Катионный обмен: R – H + Na⁺ + Cl^– —— R – Na + H⁺ + Cl^–
Анионный обмен:  R – OH + H⁺ + Cl^– —— R – CI + H₂O

Различные потоки в процессе ионного обмена включают следующие шаги:

• Истощение (через колонну после регенерации может быть пропущен 10–15-кратный относительный объем сыворотки). Относительный объем основан на объеме сыворотки по отношению к объему катионообменной колонны.
• Регенерация.
• Вытеснение сыворотки.
• Промывание обратным потоком.
• Контакт с регенерирующим раствором.
• Промывание водой.

Рис. 15.13

Установка для деминерализации подсырной сыворотки обычным методом ионного обмена

1. Бак для хранения дезинфектанта 
2. Бак для хранения соляной кислоты 
3. Катионная колонна 
4. Анионная колонна 
5. Бак для хранения гидроксида натрия 
6. Расходомер 
7. Смотровое стекло

Ионообменные колонны часто изготавливают из низкоуглеродистой стали, покрытой резиной, чтобы избежать проблем, связанных с коррозией. Для анионного обмена используются колонны конической формы, чтобы учесть набухание смолы при переходе из формы свободного основания в форму соли. Противоток часто используется для регенерации катионообменной смолы. Это означает,чтоесли сыворотка движется сверху вниз,торегенерация происходит снизу вверх.Таким образом, на 30–40 % снижается расход регенерирующих химикатов, но это происходит за счет более сложной конструкции. Установка может быть легко автоматизирована. Для непрерывной обработки сыворотки необходимо использовать 2 или 3 параллельные ионообменные системы. Продолжительность нормального цикла составляет 6 часов, 4 из которых необходимы для регенерации.

Производственные ограничения

Сыворотка – это жидкость с высоким содержанием солей, что уменьшает срок работы между регенерациями. Это также означает большой расход регенерирующих химикатов и высокое содержание солей в отработанной жидкости, включающее удаленные минеральные вещества и неизбежный избыток регенерирующих химических реагентов. Расход промывочной водытакже значителен, особенно при вымывании излишка гидроксида натрия из слабоанионной смолы. Потери сывороточных белков в колоннах происходят вследствие денатурации/абсорбции. Это вызвано значительными колебаниями уровня рН в сыворотке во время процесса ионного обмена. Потребление восстанавливающих химических реагентов составляет 60–70 % от стоимости
производства.
Процесс предназначен для деминерализации до уровня 90 %, но можно обеспечить любую степень деминерализации при использовании системы байпасирования.
Что происходит с сухими веществами сыворотки для различных вариантов смеси продуктов приведено на рис. 15.14.

Рис. 15.14

Чем становятся сухие вещества в сыворотке для различных вариантов смеси продуктов

Хроматографическое удаление лактопероксидазы и лактоферрина

В целом использование натуральных биологически активных веществ представляет особый интерес для продуктов детского питания, оздоровительных продуктов питания, косметических кремов и зубных паст. Примерамитаких компонентов являются биологически активные протеины лактопероксидаза (ЛП) и лактоферрин (ЛФ), которые присутствуют в сыворотке в небольших концентрациях, обычно 20 мг/л ЛП и 35 мл/л ЛФ. Для выделения ЛП и ЛФ из подсырной сыворотки обычно используют хроматографию.
Основополагающий принцип, используемый в процессе, заключается в том, что ЛП и ЛФ имеют изоэлектрические точки в щелочной области, то есть эти белки имеют положительный заряд в сладкой сыворотке с нормальным рН 6,2–6,6. Остальные белки сыворотки, например, b-лактоглобулин, a-лактальбумин и альбумины сыворотки крови, имеют при том же рН отрицательный заряд. Поэтому наиболее подходящий процесс отделения ЛП и ЛФ – это пропускание сыворотки через специальную катионообменную смолу для селективной адсорбции. Молекулы ЛП и ЛФ при взаимодействии зарядов связываются с отрицательно заряженными функциональными группами катионного обменника, что приводит к фиксации этих молекул на ионообменной смоле, в то время как остальные сывороточные белки проходят сквозь ионообменник, поскольку имеют отрицательный заряд. Для использования этого процесса в промышленных масштабах он должен отвечать некоторым основным требованиям.

Одно из них – это необходимость использования сыворотки без нерастворимых включений для поддержания высокой скорости потока во время загрузки, поскольку через ионообменную смолу для достижения насыщения должны пройти очень большие объемы сыворотки. Микрофильтрация (МФ) с порами размером 1,4 мкм при равномерном трансмембранном давлении зарекомендовала себя как хорошая технология получения сыворотки без твердых включений. Постоянный поток 1200–1500 л/м²/час без проблем поддерживается в течение 15–16 часов. При подобной предварительной обработке сыворотки можно избежать нарастания обратного давления в ионообменной колонне.

Ионообменная смола до насыщения способна поглотить 40–45 г ЛП и ЛФ на литр смолы. При объеме смолы 100 л можно обработать почти 100 000 л сыворотки за один цикл. При правильно подобранных условиях вымывания адсорбированных биологически активных белков из колонны можно получить очень чистые фракции ЛП и ЛФ. На этом этапе используются растворы солей с различными концентрациями. Эти белки присутствуют в промывном растворе в достаточно высокой концентрации порядка 1 % от веса. При ионном обмене концентрация ЛП и ЛФ повышается почти в 500 раз по сравнению с исходной сывороткой. При дальнейшей обработке промывного раствора на установках ультрафильтрации и диафильтрации получают очень чистый белковый продукт –с чистотой около 95 %. Наконец, после стерильной фильтрации в поперечном микрофильтре с порами 0,1–0,2 мкм концентрированные белки подвергают распылительной сушке. Весь процесс показан на рис. 15.15.

ПЕРЕРАБОТКА ЛАКТОЗЫ

ГИДРОЛИЗ ЛАКТОЗЫ

Лактоза – это дисахарид, состоящий из моносахаридов, глюкозы и галактозы (как показано на рис. 15.16). Лактоза существует в двух изомерных формах: a-лактоза и b-лактоза. 

Они отличаются друг от друга пространственным расположением гидроксильной группы по отношению к первому атому углерода в молекуле глюкозы, а также, помимо прочего:

• растворимостью;
• формой кристаллов;
• температурой плавления;
• физиологическим воздействием.

Лактозу можно расщепить гидролитически, то есть соединением с водой, и с помощью ферментов. Расщепляющий лактозу фермент b-галактозидаза относится к группе гидролаз. На рис. 15.16 показан процесс ферментативного расщепления лактозы на галактозу и глюкозу. Лактоза не такая сладкая, как другие типы сахаров. На рис. 15.17 показана относительная степень сладости различных типов сахара. Гидролиз лактозы приводит к значительному повышению сладости продукта.
У некоторых людей отсутствует фермент, расщепляющий лактозу, поэтому они не могут употреблять молочные продукты в больших количествах. Это называется «непереносимостью лактозы». Гидролиз лактозы, содержащейсявмолочных продуктах, даетэтим людям возможность использовать высокоценные белки, витамины и т. д., присутствующие в молочных продуктах. Некоторые пороки, такие как песчанистая консистенция мороженого (кристаллизация лактозы), при гидролизе лактозы практически устраняются.

Рис. 15.15

Блок-схема удаления лактопероксидазы (ЛП) и лактоферрина (ЛФ) из сыворотки

Рис. 15.16

Химическая структура лактозы и ее расщепление

Рис. 15.17

Относительная степень сладости различных типов сахара

ФЕРМЕНТАТИВНЫЙ ГИДРОЛИЗ

На рис. 15.18 показан процесс ферментативного гидролиза лактозы в сыворотке. Предварительная обработка,такая как деминерализация, не имеет существенного значения, но она улучшает вкус конечного продукта. После гидролиза сыворотку выпаривают. Получается сироп с содержанием сухих веществ 70–75 %. 85 % лактозы в этом сиропе гидролизовано и может использоваться в качестве подсластителя в хлебопекарном производстве и производстве мороженого.
В ходе производства фермент инактивируется при тепловой обработке или при регулировке рН. Он не может использоваться повторно. Вместо использования свободных ферментов сейчас возможно применять ферменты на водорастворимых и водонерастворимых носителях. Такие системы с иммобилизованными ферментами могут использоваться для непрерывного гидролиза лактозы. Фермент, являщийся дорогостоящим продуктом, не расходуется и может использоваться для гидролиза больших объемов продукта. Это повышает рентабельность. Данная технология еще не проработана в должной мере.

Рис. 15.18

Установка для ферментативного гидролиза лактозы в сыворотке 

1. Пастеризатор 
2. Танк для гидролиза 
3. Выпариватель
4. Фасовка

КИСЛОТНЫЙ ГИДРОЛИЗ

Также лактозу можно расщепить при помощи кислот вместе с термической обработкой или при пропускании через катионный обменник в водородной форме при температуре около 100 °С. Требуемая степень гидролиза определяется по уровню рН, температуре и времени выдержки. Поскольку продукт в ходе гидролиза приобретает коричневый оттенок, рекомендуется обработка активированным углем.

ХИМИЧЕСКИЕ РЕАКЦИИ

Было установлено, что небелковые азотистые соединения могут использоваться как частичная замена натуральных белков в питании жвачных животных, поскольку определенные микроорганизмы в рубце (первый отдел желудка жвачных) крупного рогатого скота могут синтезировать белок из мочевины и аммиака. Тем не менее, для того чтобы получить сбалансированное питание по азоту и энергетической ценности, мочевина и аммиак должны бытьтрансформированы в более подходящие формы, которые медленно выделяют азот в рубце, улучшая синтез протеинов.
Лактозил-мочевина и лактат аммония являются подобными продуктами, получаемыми из сыворотки.

ЛАКТОЗИЛ-МОЧЕВИНА

В общих чертах технология производства выглядит следующим образом: после сепарирования сыворотка концентрируется до 75 % сухих веществ, чаще всего в два этапа. После добавления мочевины и пищевой серной кислоты концентрат сыворотки выдерживается при температуре 70 °С в течение 20 часов в изолированном баке, снабженном мешалкой. В этих условиях протекает реакция между мочевиной и лактозой с образованием лактозил-мочевины.
После реакции продукт охлаждается и транспортируется на предприятие по производству концентрированного корма (например, в виде таблеток) или непосредственно фермерам.

ЛАКТАТ АММОНИЯ

Технология процесса включает ферментацию лактозы, содержащейся в сыворотке, в молочную кислоту и поддержание уровня рН с помощью аммиака, что приводит к образованию лактата аммония. После концентрирования до 61,5% по сухим веществам продукт готов к использованию.

Состав сыворотки

Основным компонентом в составе молочной сыворотки является лактоза, состав более 70%. В молочной сыворотке в среднем на 100 мл содержится 0,135 мг азота, около 65% которого входит в состав белковых азотистых соединений и около 35% — в составе небелковых. Состав белковых азотистых соединений в сыворотке колеблется от 0,5 до 0,8% и зависит от способа коагуляции белков молока, принятого при получении основного продукта (творог, сыр, казеин и т.д.). Состав белковых азотистых соединений молочной сыворотки приведен в таблице 1.

Сывороточные белки могут служить дополнительным источником аргинина, гистидина, метионина, лизина, треонина, триптофана и лейцина. Это позволяет отнести их к полноценным белкам, играющих важную роль в жизнедеятельности организма.

В молочной сыворотке содержатся все незаменимые аминокислоты. Состав свободных аминокислот в под сырной сыворотке в 4 раза, а в сырной в 10 раз больше, чем в исходном молоке.

Таблица 1 – Состав белков молочной сыворотки по фракциям

Фракции белков	Состав, %	Изоэлектрическая точка, рН	Температура денатурации,  0С
Лактоальбуминовая
лактоглобулин А	0,4–0,5	5,20	75-110
лактоглобулин В		5,10	60-95
лактоглобулин+В	0,3–0,6	5,30	60-95
лактоглобулин С		5,33	60-90
сывороточный альбумин		4,70	60-95
Лактоглобулиновая
эвоглобулин	0,06-0.08	6,00	75-90
псевдо глобулин		5,60	75-90
протеозопептонная	0,06-0.18	5,30	70-110

Состав углеводов в молочной сыворотке аналогичный углеводной составляющей молока — моносахариды, олигосахариды и аминосахариды. Основным углеводом молочной сыворотки является дисахарид лактоза, состав которой составляет до 90% от общего содержания углеводов. Из моноз в сыворотке обнаружены глюкоза и галактоза — продукты гидролиза лактозы в процессе переработки молока в сыр и творог. Из аминосахаридов в сыворотке обнаружены нейраминовая кислота и ее производные, а также кетопентоза. В сыворотке содержатся серологически активные олигосахариды, а также в незначительных количествах арабиноза.

В молочной сыворотке содержится 0,05-0,5% жира, что обусловлено его содержанием в исходном сырье, и технологии получения основного продукта. В сепарированный сыворотке содержание жира составляет 0,05-0,1%. Молочный жир в составе сыворотки измельченный больше, чем в цельном молоке, что положительно влияет на его усвояемость. В молочную сыворотку переходят практически все соли и микроэлементы, входящие в состав молока, а также те, которые вводят в процессе технологической обработки. Абсолютное содержание основных зольных элементов в сыворотке в% показано в таблице 2:

Таблица 2 – Содержание основных зольных элементов в составе сыворотки

Элемент	Содержание, в %
Калий	0,09-0,19
Магний	0,009-0,02
Кальций	0,04-0,11
Натрий	0,03-0,05
Фосфор	0,04-0,10
Хлор	0,08-0,11

Минеральные вещества в составе сыворотки находятся в форме истинного и молекулярного растворов, в коллоидном и нерастворимом состоянии, в виде солей органических и неорганических кислот. В состав неорганических солей входит 67% фосфора, 78% кальция, 80% магния. Количественное содержание анионов (5,831 г / л) и катионов (3,323 г / л) в молочной сыворотке аналогично содержанию микроэлементов в цельном молоке. Из катионов в сыворотке преобладают калий, натрий, кальций, магний и железо из анионов — остатки лимонной фосфорной, молочной и соляной кислот. В целом молочная сыворотка является продуктом с естественным набором жизненно важных минеральных веществ.

Кроме минеральных соединений в сыворотку почти полностью переходят водо — и жирорастворимые витамины молока, причем в под сырной сыворотке их значительно больше, чем в сырной. Относительное содержание витаминов в сыворотке (в%) по сравнению с содержанием их в цельном молоке приведены в таблице 3:

Таблица 3 – Относительное содержание витаминов в сыворотке

Витамины	Относительное содержание витаминов (в %) в сравнении с их содержанием в цельном молоке
Тиамин  (В1)	88
Рибофлавин  (В2)	91
Пиридоксин  (В6)	136
Кобаламин  (В12)	58
Аскорбиновая кислота  (С)	78
Никотинова кислота (РР)	54
Холин	102
Ретинол  (А)	11
Биотин  (Н)	90
Токоферол  (Е)	32

Количество пиридоксина, холина и, реже рибофлавина в сыворотке зачастую превышает содержание их в цельном молоке, что обусловлено жизнедеятельностью молочнокислых бактерий. Содержание витаминов в составе сыворотки подвергается колебаниям и при хранении резко снижается. В целом же молочная сыворотка по набору и абсолютному содержанию витаминов является биологически полноценным продуктом.

Из органических кислот в сыворотке обнаружены молочная кислота, а также лимонная, нуклеиновая и летучие жирные кислоты – уксусная, муравьиная, пропионовая, масляная. Молочная кислота образуется из лактозы в результате жизнедеятельности бактерий.

Под действием протеолитических ферментов, которые продуцируются молочнокислыми бактериями, происходит расщепление белковых веществ сыворотки, для инактивации которых необходима тепловая обработка при температуре выше 60°С. Кроме того, следует учитывать ферменты липазы и фосфорилазы, наличие которых может привести к возникновению горького вкуса в сыворотке. Особое внимание следует уделить ферменту лактаза, участвующей в гидролизе лактозы.

Содержание летучих жирных кислот в сырной сыворотке более, чем под сырной, что объясняется частичным гидролизом жира в процессе образования сырного сгустка. В сырной сыворотке ферментные системы более выражены, чем в сырной, за исключением сычужного фермента, количество которого в сыворотке крови составляет 23-75% от введенного в молоко.

В молочной сыворотке содержатся газы – углекислый, азот и кислород. Количество газов в сыворотке немного меньше, чем в цельном молоке, что обусловлено тепловой и механической обработкой молока при производстве творога, сыра и других продуктов. В процессе хранения сыворотки, особенно усеянной посторонней микрофлорой, количество газа может резко увеличиваться, что приводит к повышенному пенообразованию в молочной сыворотке.

Разница между сывороткой и плазмой

S.N.	Характеристики	Сыворотка	Плазма
1.	Определение	Сыворотка представляет собой жидкую часть крови после коагуляции.	Плазма — это прозрачная желтоватая жидкая часть крови.
2.	Состав	Сыворотка представляет собой водную жидкость из крови без факторов свертывания.	Плазма — это жидкость крови, содержащая агенты свертывания крови.
3.	Объем	Объем сыворотки меньше по сравнению с плазмой.	Плазма представляет собой прозрачную жидкость желтого цвета, составляющую 55% от общего объема крови.
4.	Изоляция	Сыворотка получается в процессе центрифугирования после свертывания.	Плазма получается в процессе центрифугирования перед свертыванием.
5.	Процедура изоляции	Сыворотка сложнее и требует много времени для отделения.	Отделение плазмы проще и требует меньше времени по сравнению с сывороткой.
6.	Использование антикоагулянтов	Сыворотка не требует антикоагулянтов для разделения.	Антикоагулянты необходимы для разделения плазмы.
7.	Состав	Сыворотка содержит белки, электролиты, антитела, антигены и гормоны.	Плазма считается средой крови, в которой взвешены эритроциты (красные кровяные тельца), лейкоциты (белые кровяные тельца) и другие компоненты крови.
8.	Состав (антитела)	Сыворотка содержит антитела и перекрестно реагирует с антигеном реципиента.	Плазма крови содержит антитела, тип белка, который может бороться с веществом, считающимся чужеродным для организма хозяина.
9.	Состав	Сыворотка содержит такие белки, как альбумин и глобулины.	Плазма содержит факторы свертывания крови и воду.
10.	Фибриноген	Отсутствует	Присутствует
11.	Состав (вода)	Сыворотка содержит 90% воды.	Плазма содержит 92-95% воды.
12.	Хранение	Сыворотку можно хранить при 2-6 градусах Цельсия в течение нескольких дней.	Замороженная плазма может храниться до года.
13.	Плотность	Сыворотка имеет плотность примерно 1,024 г / мл.	Плазма имеет плотность примерно 1025 кг / м3 или 1,025 г / мл.
14.	Расположение	Клетки обычно соединяются вместе путем образования сгустка.	Клетки не связаны вместе и не взвешиваются в плазме.
15.	Использует	Сыворотка является наиболее предпочтительной частью крови, используемой для проверки групп крови.	Плазма доставляется пациентам, у которых отсутствуют клетки крови.
16.	Использует	Сыворотка является важным источником электролитов, а сыворотка животных используется в качестве противоядия, антитоксинов и вакцинации.	Плазма содержит белки, которые помогают транспортировать такие вещества, как глюкоза и другие растворенные питательные вещества, через кровь.
17.	Использует	Сыворотка используется для различных диагностических тестов, используемых для определения уровней ХГЧ, холестерина, белков, сахара и т. Д., в крови.	Плазма помогает поддерживать кровяное давление и регулировать температуру тела

Белки и антитела в сыворотке, плазме и цельной крови — определение размера с использованием асимметричного полевого фракционирования потока (AF4)

Anal Bioanal Chem . 2018; 410 (20): 4867–4873.

, ¹ , ² , ¹ , ¹ и ²

Mats Leeman

¹ SOLVE Research & Consultancy AB, Medicon Village, 22381 Lund, Sweden 9022ye 9024i J ² Кафедра пищевых технологий, инженерии и питания, Инженерный факультет, Лундский университет, 22100 Лунд, Швеция

Себастьян Ханссон

¹ SOLVE Research & Consultancy AB, Medicon Village, 22381 Лунд, Швеция

Матильда Улмиус Storm

¹ SOLVE Research & Consultancy AB, Medicon Village, 22381 Лунд, Швеция

Ларс Нильссон

² Кафедра пищевых технологий, инженерии и питания, инженерный факультет, Лундский университет, 22100 Лунд, Швеция

¹ SOLVE Research & Consultancy AB, Medicon Village, 22381 Лунд, Швеция

² Департамент пищевых технологий, Engin eering and Nutrition, Инженерный факультет, Лундский университет, 22100 Лунд, Швеция

Автор, ответственный за переписку.

Поступило 09.03.2018 г .; Пересмотрено 25 апреля 2018 г .; Принято 3 мая 2018 г.

Открытый доступ Эта статья распространяется на условиях Международной лицензии Creative Commons Attribution 4.0 (http://creativecommons.org/licenses/by/4.0/), которая разрешает неограниченное использование, распространение, и воспроизведение на любом носителе при условии, что вы должным образом укажете автора (авторов) и источник, предоставите ссылку на лицензию Creative Commons и укажете, были ли внесены изменения.

Эта статья цитируется в других статьях в PMC.

Abstract

Анализ агрегатов терапевтических белков имеет решающее значение для обеспечения эффективности и безопасности пациентов. Обычно анализ выполняется в готовой рецептуре, чтобы убедиться в отсутствии агрегатов. Однако важный вопрос заключается в том, что происходит с терапевтическими белками в отношении олигомеризации и агрегации после их введения (т.е. в кровь). В этой статье показано разделение цельной крови, плазмы и сыворотки с использованием асимметричного фракционирования потока поля-потока (AF4) с минимальной предварительной обработкой образца.Кроме того, продемонстрированы анализ и характеристика размера флуоресцентного антитела в плазме крови с использованием AF4. Результаты показывают пригодность и эффективность AF4 для анализа крови и открывают новые важные пути анализа и характеристики терапевтических белков в крови.

Электронные дополнительные материалы

Онлайн-версия этой статьи (10.1007 / s00216-018-1127-2) содержит дополнительные материалы, которые доступны авторизованным пользователям.

Ключевые слова: Цельная кровь, антитела, плазма, сыворотка, фракционирование по полю асимметричного потока (AF4), флуоресцентная маркировка

Введение

Белковые препараты являются быстрорастущим сектором фармацевтической промышленности и в настоящее время используются при лечении множества заболеваний.Терапевтические белки сложны в отношении их большого молекулярного размера (сравните с низкомолекулярными лекарствами) и их вторичных и третичных структур, которые необходимо поддерживать для эффективного функционирования в качестве молекул лекарства. Эти внутренние свойства белков, вместе со стрессом окружающей среды, являются одной из причин, по которым белки склонны к агрегации при фармацевтической обработке, приготовлении и хранении. Образование белковых агрегатов может привести к снижению эффективности и / или иммуногенности лекарственного средства, что ставит под угрозу безопасность пациента [1].Следовательно, контроль и устранение белковых агрегатов является важной частью рецептуры белковых продуктов.

Анализ белковых агрегатов может быть сложной задачей из-за широкого диапазона размеров — от небольших олигомеров до крупных невидимых частиц или даже видимых преципитатов [2]. Основным методом определения размера и количества невидимых агрегатов является эксклюзионная хроматография (SEC) в сочетании с подходящими детекторами. Однако в последние годы SEC, хотя и хорошо известна, подвергается сомнению, поскольку может давать ошибочные оценки совокупных уровней [3–5].Регулирующие органы, такие как Управление по санитарному надзору за качеством пищевых продуктов и медикаментов (FDA) США, теперь рекомендуют использовать несколько дополнительных ортогональных методов для проверки измерений. Анализ белковых агрегатов в готовом препарате важен, но еще более важным является понимание потенциала агрегации после введения, включая взаимодействие с компонентами крови [6]. Анализ образования агрегатов терапевтических белков после введения лекарственного средства пациенту без вмешательства в извлеченный образец является предметом долгих поисков и может быть достигнут только путем анализа крови in vivo или ex vivo.

Плазма крови — это богатый белком раствор, в котором взвешены белые и красные кровяные тельца, а также тромбоциты, а сыворотка представляет собой жидкость, оставшуюся после удаления сгустка из цельной крови, в основном с таким же составом, что и плазма, за исключением что фибриногены и факторы свертывания отсутствуют. Концентрация белка в плазме / сыворотке составляет примерно 60–80 мг / мл, из которых около 50–60% составляют альбумины и 40% глобулины (10–20% иммуноглобулин G, IgG) [7, 8]. Распределение компонентов крови по размеру колеблется от небольших молекул и ионов (<1 нм) до примерно 15 мкм для лейкоцитов.Из-за сложной природы и большого диапазона размеров компонентов крови такие пробы трудно анализировать, и обычно требуется обширная предварительная обработка проб. Типичные этапы подготовки проб включают центрифугирование, экстракцию и фильтрацию [9, 10]. Однако эта предварительная обработка может вызвать непреднамеренные артефакты, такие как нежелательная потеря компонентов, загрязнение и агрегация белков. Следовательно, очень желательно иметь возможность анализировать и характеризовать белки в крови с минимизацией изменения условий, т.е.е. поддержание физиологического pH и солености и отказ от поверхностно-активных веществ и органических растворителей.

В отраслевом руководстве FDA по агрегированному анализу не рекомендуется использовать какой-либо конкретный аналитический метод [5]. Тем не менее, требуется тщательная оценка с использованием квалифицированных методов для исключения присутствия агрегатов, и один из упомянутых методов — это асимметричное фракционирование потока поля-потока (AF4). AF4 — это метод, в котором разделение достигается приложением внешнего поля (поперечного потока) в ленточном открытом канале без неподвижной фазы [11–13].Из-за отсутствия стационарной фазы устраняются некоторые проблемы, связанные с SEC, включая минимизацию неспецифической адсорбции белка, структурную деформацию на поверхности и высокие силы сдвига, которые могут привести к деградации аналитов. Следовательно, AF4 — это очень мощный метод, который все чаще используется для разделения и характеристики биомакромолекул и фармацевтических молекул [14–16]. Было доказано, что это потенциальный инструмент для изучения биологических структур, таких как белки, антигены и антитела [17–21].В предыдущих исследованиях фракционирование в полевом потоке (FFF) использовалось для разделения и характеристики плазмы крови и липопротеинов [22–24]. Ли и др. изучили возможность разделения липопротеинов в плазме крови с помощью симметричного потока FFF, Mädorin et al. основное внимание уделялось взаимодействию между лекарственным средством с низкой молекулярной массой и плазмой и количественному анализу по выделению лекарственного средства после фракционирования с помощью AF4, а также исследованию Park et al. Исследование было сосредоточено на сравнении белков плазмы (липопротеинов и альбумина) у пациентов и здоровых людей, использующих AF4 на входе фритты.Однако во всех случаях образцы плазмы готовились некоторыми методами подготовки (центрифугирование и добавление добавок).

Целью данного исследования является изучение возможности использования AF4 для разделения белков и других компонентов в сыворотке и плазме с высоким разрешением, а также для разделения цельной крови без предварительной обработки образца, такой как центрифугирование и фильтрация. Кроме того, мы исследуем возможность выборочного разделения и обнаружения флуоресцентных антител в матрице.

Материалы и методы

Материалы

Все соли, использованные для приготовления носителя (хлорид натрия, динатрийфосфат, фосфат калия, фосфат калия, хлорид калия и азид натрия), были аналитической степени чистоты (Sigma-Aldrich, St Louis, MS, США). Воду очищали на установке Millipore Plus (Merck Millipore, Дармштадт, Германия). Контрольные образцы миоглобина, бычьего сывороточного альбумина и иммуноглобулина G были получены от Sigma-Aldrich. Сыворотка человека (номер для заказа h5522) была получена от Sigma-Aldrich.Плазма была крысиной, а цельная — мышиной (любезно предоставлена ​​Redoxis AB, Лунд, Швеция). Козье антитело против человеческого IgG, меченное FITC (флуоресцеинизотиоцианат), было получено от Capra Science Antibodies, Ängelholm, Швеция. Нагрузка FITC была оценена как 6,2 / антитело.

Метод

Анализ фракционирования асимметричного потока поля-потока (AF4) был выполнен на Eclipse II (Wyatt Technology, Dernbach, Германия) в сочетании с LC-системой серии 1100, состоящей из вакуумного дегазатора ERC-3415 (ERC). ), насос G1311A, автоматический пробоотборник G1329A, детектор с диодной матрицей U V / VIS G1315A и детектор флуоресценции G1321C (Agilent Technologies, Санта-Клара, Калифорния, США).Детектор многоуглового рассеяния света (MALS) Dawn Heleos II и детектор дифференциального показателя преломления (dRI) Optilab t-Rex были подключены к сети (технология Wyatt) после канала. УФ-детектор контролировался на 250 и 280 нм, флуоресцентный детектор был настроен на длину волны возбуждения 495 нм и контролировал излучение на 525 нм, а MALS использовал лазер с длиной волны 658 нм и измерял рассеянный свет с помощью 17 детекторов в водный жидкий носитель. Детектор dRI работал на длине волны 658 нм.

Сбор данных производился с помощью Astra 6.2 (технология Wyatt). Асимметричный канал разделения потока и поля потока представлял собой канал Wyatt SC, снабженный прокладкой шириной 350 мкм. Для анализа использовали мембрану из регенерированной целлюлозы (RC) 10 или 100 кДа (Merck Millipore). Носитель представлял собой забуференный фосфатом физиологический раствор (PBS), pH 7,4, с 3 мМ азида натрия (добавленный для предотвращения микробной активности). Фракционирование проводили при температуре окружающей среды (приблизительно 22 ° C), и все эксперименты повторяли не менее двух раз для воспроизводимости.

Тестирование производительности разделения AF4, а также проверка обнаружения MALS-RI и определения молярной массы проводились путем анализа растворов миоглобина, бычьего сывороточного альбумина и иммуноглобулина G. Для оценки данных MALS использовался метод Zimm и dRI с приращением показателя преломления dn / dc 0,185 мл / г для определения концентрации для получения молекулярной массы (MW). В методе разделения AF4 используется скорость потока детектора 0,50 мл / мин, что дает давление в системе приблизительно 3-4 бара в зависимости от конфигурации детектора.Перед началом закачки системе давали возможность стабилизировать перетоки и давления в течение 2 минут. Скорость впрыска составляла 0,2 мл / мин, время впрыска 1 мин, время фокусировки 2 мин; поперечный поток во время инъекции и фокусировки был таким же, как и во время элюирования (2,0 мл / мин). Во время элюирования скорость поперечного потока, Q _c , составляла 2,0 мл / мин, которая поддерживалась постоянной в течение 4 минут после начала элюирования, после чего уменьшалась в соответствии с уравнением. 1

, где Q _{c , 0} — объемная скорость перетока в начале распада, t — время и t _½ — скорость распада (4 мин в настоящем исследовании).Когда скорость поперечного потока достигла 0,15 мл / мин, она оставалась постоянной до конца разделения.

Объем инъекции для всех тестов составлял 10 мкл. И сыворотка крови, и плазма крови, и цельная кровь были разбавлены в 100 раз носителем (PBS) перед инъекцией в канал AF4 и разделением по размеру. Предполагая, что содержание белка в сыворотке или плазме составляет примерно 70 мг / мл, это дает, что концентрация белка в образце, поступающем в канал, составляет примерно 700 мкг / мл, а нагрузка образца на канал AF4 составляет примерно 7 мкг.Для тестов с цельной кровью использовалась мембрана с отсечкой молекулярной массы 100 кДа (MWCO) для снижения белковой нагрузки на канал путем удаления белков с более низкой молекулярной массой (таких как сывороточный альбумин), которые могут выходить из канала разделения по размеру через мембрана.

Результаты и обсуждение

Анализ сыворотки крови

Сыворотка крови была разбавлена ​​в 100 раз фосфатно-солевым буфером (PBS) (10 мкл сыворотки, к которой было добавлено 990 мкл PBS) перед разделением AF4. Разбавление было сделано для того, чтобы снизить вязкость раствора.Время элюирования сывороточного компонента сравнивали со временем элюирования, полученным при анализе белков миоглобина, бычьего сывороточного альбумина и иммуноглобулина G с использованием идентичных условий AF4 (фиг.).

AF4-UV-MALS-dRI фрактограммы и молекулярный вес. Ультрафиолетовая кривая при 250 нм (зеленый), кривая dRI (синяя) и LS при кривой 90 ° (красная). а Анализ сыворотки крови. Объем инъекции составлял 10 мкл образца сыворотки, разведенного в 100 раз, т.е. соответствовал 0,1 мкл сыворотки. б Анализ плазмы.Объем инъекции составлял 10 мкл образца плазмы, разбавленной в 100 раз, т.е. соответствовал 0,1 мкл плазмы. c Анализ миоглобина 17 кДа (красный график), 67 кДа бычьего сывороточного альбумина (синий график) и ~ 150 кДа иммуноглобулина G (зеленый график). Образцы BSA и IgG содержат димеры

Образец сыворотки показывает широкое и многомодальное распределение по размерам, обнаруженное детекторами УФ, MALS и dRI. Пик с максимумом на 4,8 мин в образце сыворотки на рис. А хорошо соответствует времени элюирования пика мономера бычьего сывороточного альбумина на рис.c (по размеру похож на сывороточный альбумин человека), а пик на 6,8 мин хорошо соответствует времени элюирования, полученному при анализе иммуноглобулина G (пик мономера на рис. c). Кроме того, данные по молярной массе из MALS дают молярную массу на вершинах пиков как 70 кДа (при 4,8 мин) и 158 кДа (при 6,8 мин). Предполагается, что двумя наиболее распространенными белками в сыворотке крови будут сывороточный альбумин и IgG (на основе литературных значений [7], часто приводимых как приблизительно 40 и 10 мг / мл, соответственно). Из этих сравнений и на основании данных о молекулярной массе мы заключаем, что с очень высокой вероятностью компонент элюируется при 4.8 мин — это в основном сывороточный альбумин, а компоненты, элюирующие около 6,8 мин, — в основном IgG.

Очевидно, учитывая огромное количество различных белков, которые, как ожидается, должны присутствовать в сыворотке крови, можно ожидать, что большое количество (аналогичного размера) белков и других компонентов сыворотки элюируется совместно с сывороточным альбумином и IgG. . Однако сывороточный альбумин и IgG являются наиболее распространенными белками и классами белков, которые можно ожидать в крови, и, вероятно, они вносят наибольший вклад в обнаруженные пики.

Идентичность компонентов сыворотки, элюированных после IgG (8–11 мин на рис. A), неизвестна, но известно, что сыворотка содержит белки больше, чем IgG, такие как альфа-2-макроглобулин (720 кДа, ~ 3 мг / мл в сыворотка) и IgM (950 кДа, ~ 1 мг / мл в сыворотке) [25]. Кроме того, существует вероятность того, что некоторые из обнаруженных компонентов представляют собой более мелкие белки, которые агрегированы или связаны с другими белками, что делает их размер больше (тем самым элюируя позже), чем у отдельного мономерного белка.

Анализ плазмы крови

Плазма крови анализировалась с использованием тех же настроек, что и для сыворотки крови. Профиль элюции (рис. B) аналогичен профилю, полученному для сыворотки крови с компонентами, обнаруженными при таком же времени элюирования, как сывороточный альбумин и иммуноглобулин G. Наиболее заметное различие между профилем элюции сыворотки и плазмы состоит в том, что имеется большее количество компонентов. элюируется в интервале времени элюирования от 3 до 6 мин (более высокая интенсивность пика при 4–6 мин в образце плазмы) на рис.б. Можно предположить, что это может быть связано с фибриногеном (белок 340 кДа), который, как ожидается, должен присутствовать в плазме, но не должен присутствовать в сыворотке (удаляется центрифугированием после свертывания крови). Эти результаты показывают более высокое разрешение разделения плазмы крови с помощью методов FFF и более чувствительное обнаружение, чем результаты предыдущих исследований [22–24].

Флуоресцентно меченые антитела в PBS и плазме

И сыворотка, и плазма содержат широкий спектр антител (по оценкам,> 10 ⁷ различных антител [26].Иммуноглобулин G подразделяется на четыре класса (IgG1 – IgG4), каждый из которых, в свою очередь, состоит из огромного набора антител, часто очень незначительно различающихся по размеру и молярной массе. Разделить их физически по размеру невозможно с помощью AF4 из-за недостаточного разрешения. Таким образом, антитела, элюируемые из AF4, будут элюироваться как смесь многих антител. Следовательно, чтобы иметь возможность обнаруживать и контролировать один конкретный тип антител, необходимо избирательное обнаружение. Обнаружение флуоресценции может предложить такое избирательное обнаружение, если интересующее антитело флуоресцентно помечено.Чтобы исследовать, можно ли контролировать флуоресцентно меченые антитела в плазме крови, использовали козьи антитела типа IgG, которые были помечены флуоресцентным маркером FITC. Для справки, флуоресцентно меченное антитело анализировали в PBS в концентрации 100 мкг / мл, объем образца 10 мкл, чтобы обеспечить обнаружение УФ, MALS и dRI (рис. А). Меченое антитело элюируется при времени элюирования 6,75 мин, аналогичном времени элюирования IgG в сыворотке и плазме (6,8 мин). Отмечено наличие плеча на пике (8–9 мин), что интерпретируется как обнаружение (не полностью разрешенных) димеров.

AF4-UV-MALS-dRI-FL фрактограммы. Обнаруживается УФ при 250 нм (зеленая кривая), MALS (красная кривая), FL при 495/525 нм (оранжевая кривая) и dRI (синяя кривая). a Анализ флуоресцентно меченых антител в PBS. Объем инъекции составлял 10 мкл раствора 100 мкг / мл (массовая нагрузка = 1 мкг). b Анализ флуоресцентно меченых антител в плазме крови. В плазму добавляли концентрацию 10 мкг флуоресцентно меченного антитела / мл плазмы. Затем добавленную плазму разбавляли в 100 раз носителем PBS перед анализом (объем образца составлял 10 мкл, что соответствует массовой нагрузке 1 нг флуоресцентно меченного антитела на канал). c Анализ флуоресцентно меченых антител в PBS (зеленая кривая) и в плазме крови (красная кривая). В плазму добавляли концентрацию 100 мкг флуоресцентно меченых антител / мл плазмы. Затем добавленную плазму разбавляли в 100 раз носителем PBS перед анализом (объем образца составлял 10 мкл, что соответствует массовой нагрузке 10 нг флуоресцентно меченого антитела на канал)

Флуоресцентно меченное антитело добавляли в плазму до концентрации 10 мкг / мл плазмы и анализировали.Детектор флуоресценции обнаруживает меченый IgG (рис. B), в то время как детекторы УФ, MALS и dRI обнаруживают все другие компоненты плазмы. При повышенной концентрации (10 мкг / мл плазмы) количество меченого IgG в канале составляет 1 нг, что слишком мало для обнаружения детекторами УФ, MALS или dRI.

Более подробное сравнение профиля элюции FICT-меченного IgG в PBS и в плазме показывает, что существуют различия, отслеживаемые детектором флуоресценции (рис. C). Меченный FICT IgG в PBS (зеленые кривые на рис.c) имеет вершину на 6,75 мин и показывает хвост на основном пике (на 8–9 мин), интерпретируемый как димер (как указано выше). Для сравнения, когда FICT-IgG вводится в плазму (красная кривая на рис. C), пик смещается на 6,9 мин. Кроме того, плечо (димер) намного более выражено (более высокая интенсивность), когда образец находится в плазме. Данные получены на одном и том же оборудовании, проанализированы рядом друг с другом, в двух экземплярах, в двух разных случаях, с использованием одних и тех же условий как для плазмы, так и для PBS.Когда Ab-FICT анализируется вместе с компонентами плазмы, становится очевидным, что как сдвиг основного пика, указывающий на то, что он действует так, как он был немного больше во время разделения, так и большее увеличение антитела, имеющего размер, аналогичный димера антитела. Вывод заключается в том, что между компонентами плазмы и FICT-меченным IgG происходит взаимодействие. Для выяснения природы взаимодействия требуются дальнейшие исследования.

Анализ цельной крови

Свежая кровь мыши была получена для исследования способности AF4 разделять даже более сложную матрицу, чем показано выше (т.е., включая клетки крови). Время между взятием пробы у мышей и анализом было коротким (примерно 30 мин), чтобы минимизировать гемолиз. ЭДТА добавляли для предотвращения свертывания крови. Кровь разбавляли в 100 раз носителем (PBS) непосредственно перед анализом, а затем кровь вводили непосредственно в канал AF4. Для этих анализов использовали мембрану 100 кДа для удаления белков с более низкой молекулярной массой из канала, что привело к снижению белковой нагрузки на канал. Обратите внимание, что эти разделения были выполнены на другой мембране, что дало различную толщину каналов и, следовательно, разное время элюирования по сравнению с приведенными выше результатами.

На фрактограмме (рис.) Виден пик (6,0 мин), совпадающий с пиком IgG, и пик 8–10 мин. В отличие от данных по сыворотке и плазме, имеется также большое количество компонентов большего размера, элюируемых в интервале времени от 10 до 20 мин, идентичность которых неизвестна. Сигнал светорассеяния показывает несколько узких пиков с высокой интенсивностью (шум). Предположительно, это происходит из-за элюирования крупных компонентов с очень высокой молекулярной массой или частиц цельной крови, которых относительно мало (например, целых клеток крови или их фрагментов).

Анализ цельной крови с помощью AF4-UV-MALS-dRI. Ультрафиолетовая кривая при 250 нм (зеленый), кривая dRI (синяя) и LS при кривой 90 ° (красная). Объем инъекции составлял 10 мкл образца крови, разбавленного в 100 раз, т.е. соответствует 0,1 мкл цельной крови.

Эритроциты имеют размер примерно 0,5 × 8 мкм и находятся за пределами диапазона броуновского режима AF4 [27, 28]. Поскольку цель анализа не заключалась в разделении этих больших компонентов, не ожидается, что они будут должным образом разделены. Скорее, цель заключалась в том, чтобы проверить, можно ли ввести образец крови с минимальной предварительной обработкой образца и без удаления каких-либо компонентов.Единственное нарушение в крови заключается в добавлении ЭДТА (для предотвращения свертывания крови) и в том, что образец был разбавлен носителем (PBS) перед инъекцией (для снижения вязкости). Фильтрация, центрифугирование или добавление модификаторов растворителей не производились, и кровь анализируется в носителе PBS, который имеет ионную силу и pH, очень близкие к крови. В той степени, в которой цельная кровь может быть проанализирована с помощью AF4, этот тест показывает, что это можно сделать; IgG и другие белки были элюированы, и матрица цельной крови не приводила к нарушению разделения по размерам.

Однако за эритроцитами из-за их цвета можно было наблюдать визуально, когда они вводились в канал, и было отмечено, что они прилипают к мембране (см. Дополнительный электронный материал (ESM), рис. S1). После анализа канал промывали (прокачка носителя PBS через канал со скоростью 0,5 мл / мин, отсутствие перетока), и примерно через 1 ч в канале не было визуально никаких красных следов. Это интерпретируется как то, что либо (а) клетки были вымыты, либо (б) клетки были гемолизированы и, таким образом, потеряли свой цвет (возможно, вымывшиеся фрагменты).Очевидно, что если бы цельная кровь анализировалась рутинно, это потребовало бы исследования и оптимизации типа и химического состава мембраны, состава носителя и протоколов промывки. Кроме того, вызывает беспокойство возможность засорения потоковых линий как в автосамплере, так и в детекторах, хотя во время этих повторных анализов засорения не наблюдалось.

Выводы

Три наиболее распространенных типа образцов крови (сыворотка, плазма и цельная кровь) были успешно разделены по размеру с помощью AF4.Возможность анализировать образцы крови в условиях, близких к естественным (например, ионная сила, pH, отсутствие фильтрации, центрифугирование, добавление органических модификаторов / растворителей или детергентов) открывает возможность для:

1. Профилирование размеров белков крови — исследование различий в распределении крови по размеру между образцами и изменений во времени

2. Исследования терапевтических белков (флуоресцентно меченных) в крови.

Обычно изучают терапевтические белки в составе, например, чтобы исследовать, происходит ли агрегация или разложение, обычно как часть контроля качества или во время разработки состава.Однако возможность использования AF4 для разделения по размеру в крови делает возможным изучение агрегации или деградации в среде, в которой должен присутствовать терапевтический белок (т. Е. В крови). В этом исследовании показано, что можно анализировать антитела в плазме крови. Результаты помогут ответить на вопрос о том, что происходит с терапевтическими белками после их введения [29]. В свете этого возможно, что AF4 является единственным доступным в настоящее время методом ex vivo анализа белковых агрегатов (размером <1 мкм), который может вызывать иммуногенность, требуя минимальной предварительной обработки образца.Требования к таким исследованиям состоят в том, чтобы можно было использовать метод селективного обнаружения, такой как флуоресценция (путем введения флуоресцентной метки на интересующее соединение). Масс-спектрометрия - еще один интересный метод, который можно использовать для селективного обнаружения терапевтических белков, разделенных, как описано в этой статье, что не требует флуоресцентного мечения. Флуоресцентное мечение было бы привлекательным, чтобы избежать, поскольку оно вносит изменения в химические свойства белка, которые, в свою очередь, могут повлиять на склонность к образованию агрегатов.

Электронный дополнительный материал

ESM 1 ^{(128K, pdf)}

(PDF 127 kb)

Благодарности

Авторы благодарят Redoxis AB, Лунд, Швеция, за предоставленные образцы плазмы и цельной крови.

Информация о финансировании

Это исследование финансировалось Винновским центром компетенций NextBioForm.

Соблюдение этических стандартов

Конфликт интересов

Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.

Сноски

Электронные дополнительные материалы

Онлайн-версия этой статьи (10.1007 / s00216-018-1127-2) содержит дополнительные материалы, которые доступны авторизованным пользователям.

Ссылки

1. Frokjaer S, Otzen DE. Стабильность белкового лекарственного средства: проблема рецептуры. Nat Rev Drug Disc. 2005. 4 (4): 298–306. DOI: 10,1038 / NRD1695. [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar] 2. Ден Энгельсман Дж., Гаридель П., Смолдерс Р., Колл Х., Смит Б., Бассараб С., Зайдл А., Хайнцл О., Джискут В.Стратегии оценки белковых агрегатов при разработке фармацевтических биотехнологических продуктов. Pharm Res. 2011; 28 (4): 920–933. DOI: 10.1007 / s11095-010-0297-1. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar] 3. Мэннинг Р.Р., Холкомб Р.Э., Уилсон Г.А., Генри К.С., Мэннинг М.С. Обзор методов, ортогональных к SEC для количественного определения и характеристики белковых агрегатов. Biopharm Int. 2014; 27 (12): 32. [Google Scholar] 4. Карпентер Дж. Ф., Рэндольф Т. В., Джискут В., Кроммелин Д. А., Миддо К. Р., Винтер Г. Потенциальное неточное количественное определение и определение размеров белковых агрегатов с помощью эксклюзионной хроматографии: существенная необходимость в использовании ортогональных методов для обеспечения качества терапевтических белковых продуктов.J Pharm Sci. 2010. 99 (5): 2200–2208. DOI: 10.1002 / jps.21989. [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar]

5. USFDA (2014) Руководство по промышленной оценке иммуногенности терапевтических белковых продуктов.

6. Ван В., Сингх С.К., Ли Н., Толер М.Р., Кинг К.Р., Нема С. Иммуногенность белковых агрегатов — проблемы и реальность. Int J Pharm. 2012; 431 (1–2): 1–11. [PubMed] [Google Scholar] 7. Барретт К.Е., Брукс Х., Бойтано С., Бармен С.М. Обзор медицинской физиологии Ганонга. 23. Нью-Йорк: McGraw-Hill Medical; 2010 г.[Google Scholar] 8. Gonzalez-Quintela A, Alende R, Gude F, Campos J, Rey J, Meijide LM, Fernandez-Merino C, Vidal C. Сывороточные уровни иммуноглобулинов (IgG, IgA, IgM) у взрослого населения в целом и их связь с потреблением алкоголя , курение и общие нарушения обмена веществ. Clin Exp Immunol. 2008. 151 (1): 42–50. DOI: 10.1111 / j.1365-2249.2007.03545.x. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar] 9. Pretlow TG, Pretlow TP. Разделение клеток: методы и избранные применения. Кембридж: Academic Pr; 1983 г.[Google Scholar] 10. Питт В.Г., Ализаде М., Хусейни Г.А., Макклеллан Д.С., Бьюкенен К.М., Бледсо К.Г., Робисон Р.А., Бланко Р., Родер Б.Л., Мелвилл М., Хантер А.К. Быстрое отделение бактерий от крови — обзор и перспективы. Biotechnol Prog. 2016; 32 (4): 823–839. DOI: 10.1002 / btpr.2299. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar] 11. Валунд К.Г., Нильссон Л. Flow FFF — основы и ключевые приложения. В: Williams SKR, Caldwell K, редакторы. Полевое фракционирование в биополимерном анализе. Вена: Springer Verlag; 2012 г.С. 1–21. [Google Scholar] 12. Litzén A, Wahlund KG. Расширение и разбавление зон в прямоугольных и трапециевидных асимметричных каналах фракционирования потока. Anal Chem. 1991. 63 (10): 1001–1007. DOI: 10.1021 / ac00010a013. [CrossRef] [Google Scholar] 13. Валунд К.Г., Литцен А. Применение канала фракционирования с асимметричным потоком поля-потока для разделения и характеристики белков, плазмид, фрагментов плазмид, полисахаридов и одноклеточных водорослей. J Chromatogr. 1989. 461: 73–87. DOI: 10.1016 / S0021-9673 (00) 94276-6. [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar] 14. Куреши Р.Н., Кок В.Т. Применение фракционирования потока поля потока для характеристики макромолекул, представляющих биологический интерес: обзор. Anal Bioanal Chem. 2011. 399 (4): 1401–1411. DOI: 10.1007 / s00216-010-4278-3. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar] 15. Rambaldi DC, Reschiglian P, Zattoni A. Фракционирование потока поля-потока: последние тенденции в анализе белков. Anal Bioanal Chem. 2011. 399 (4): 1439–1447. DOI: 10.1007 / s00216-010-4312-5.[PubMed] [CrossRef] [Google Scholar] 16. Нильссон Л. Разделение и характеристика макромолекул пищевых продуктов с использованием фракционирования в полевом потоке: обзор. Пищевой Hydrocoll. 2013; 30 (1): 1–11. DOI: 10.1016 / j.foodhyd.2012.04.007. [CrossRef] [Google Scholar] 17. Чой Дж., Ли С., Линарес-Пастен Дж., Нильссон Л. Исследование олигомеризации глутаматдекарбоксилазы из Lactobacillus brevis с использованием фракционирования поля-потока с асимметричным потоком (AF4) с методами светорассеяния. Anal Bioanal Chem. 2018; 410 (2): 451–458. DOI: 10.1007 / s00216-017-0735-6. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar] 18. Cragnell C, Choi J, Segad M, Lee S, Nilsson L, Skepö M. Бычий β-казеин имеет полидисперсное распределение равновесных мицелл. Пищевой Hydrocoll. 2017; 70: 65–68. DOI: 10.1016 / j.foodhyd.2017.03.021. [CrossRef] [Google Scholar] 19. Сандра К., Ванденхид И., Сандра П. Современные хроматографические и масс-спектрометрические методы для биофармацевтической характеристики белков. J Chromatogr A. 2014; 1335: 81–103. DOI: 10.1016 / j.chroma.2013.11.057. [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar] 20. Шин К., Чой Дж., Чо Дж. Х., Юн М.Ю., Ли С., Чунг Х. Возможность асимметричного фракционирования потока поля-потока как метода обнаружения защитного антигена путем прямого распознавания нанозондов, захваченных мишенью, с увеличенным размером. J Chromatogr A. 2015; 1422: 239–246. DOI: 10.1016 / j.chroma.2015.09.089. [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar] 21. Litzén A, Walter JK, Krischollek H, Wahlund KG. Разделение и количественное определение агрегатов моноклональных антител путем фракционирования по полю с асимметричным потоком и сравнение с гель-проникающей хроматографией.Анальная биохимия. 1993. 212 (2): 469–480. DOI: 10.1006 / abio.1993.1356. [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar] 22. Мадорин М., Ван Хогевест П., Хилфикер Р., Лангвост Б., Кресбах Г.М., Эрат М., Лойенбергер Х. Анализ взаимодействий лекарственное средство / белок плазмы с помощью фракционирования поля-потока с асимметричным потоком. Pharm Res. 1997. 14 (12): 1706–1712. DOI: 10,1023 / А: 1012171511285. [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar] 23. Ли П., Гиддингс Дж. Выделение и измерение коллоидов в плазме человека с помощью мембранно-селективного потокового фракционирования поля-потока: липопротеинов и фармацевтических коллоидов.J Pharm Sci. 1996. 85 (8): 895–898. DOI: 10.1021 / js950335s. [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar] 24. Пак И, Пэнг КДж, Юн Й, Сон Дж.Х., Мун МН. Разделение и селективное обнаружение липопротеиновых частиц у пациентов с ишемической болезнью сердца путем фракционирования с асимметричным потоком на входе фритты. J Chromatogr B Anal Technol Biomed Life Sci. 2002. 780 (2): 415–422. DOI: 10.1016 / S1570-0232 (02) 00630-X. [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar] 25. Дати Ф., Шуман Дж., Томас Л., Агуцци Ф., Бауднер С., Бьенвеню Дж., Блаабьерг О., Блируп-Дженсен С., Карлстром А., Петерсен П. Х., Джонсон А. М., Милфорд-Уорд А., Ричи Р. Ф., Свендсен П. Дж., Уичер Дж.Консенсус группы профессиональных обществ и диагностических компаний по руководящим принципам для промежуточных референсных диапазонов для 14 белков в сыворотке на основе стандартизации справочного материала IFCC / BCR / CAP (CRM 470) Eur J Clin Chem Clin Biochem. 1996. 34 (6): 517–520. [PubMed] [Google Scholar] 26. Аббас А.К., Лихтман А.Х., Побер Я.С. Клеточная и молекулярная иммунология. 4. Филадельфия: W. B. Saunders Co .; 2000. [Google Scholar] 27. Колдуэлл К.Д., Нгуен Т.Т., Майерс М.Н., Гиддингс Дж.С. Наблюдения за аномальным удержанием при фракционировании стерического поля-потока.Sep Sci Technol. 1979; 14 (10): 935–946. DOI: 10.1080 / 014963978103. [CrossRef] [Google Scholar] 28. Уильямс PS, Гиддингс JC. Теория программно-полевого фракционирования потока с поправками на стерические эффекты. Anal Chem. 1994. 66 (23): 4215–4228. DOI: 10.1021 / ac00095a017. [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar] 29. Би Дж. С., Голец Т. Дж., Рагхеб Дж. А. Будущее характеристики белковых частиц и понимание их потенциала для снижения иммуногенности биофармацевтических препаратов: общая точка зрения.J Pharm Sci. 2012. 101 (10): 3580–3585. DOI: 10.1002 / jps.23247. [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar]

Белки и антитела в сыворотке, плазме и цельной крови — определение размера с использованием асимметричного полевого фракционирования потока (AF4)

Anal Bioanal Chem. 2018; 410 (20): 4867–4873.

, ¹ , ² , ¹ , ¹ и ²

Mats Leeman

¹ SOLVE Research & Consultancy AB, Medicon Village, 22381 Lund, Sweden 9022ye 9024i J ² Кафедра пищевых технологий, инженерии и питания, Инженерный факультет, Лундский университет, 22100 Лунд, Швеция

Себастьян Ханссон

¹ SOLVE Research & Consultancy AB, Medicon Village, 22381 Лунд, Швеция

Матильда Улмиус Storm

¹ SOLVE Research & Consultancy AB, Medicon Village, 22381 Лунд, Швеция

Ларс Нильссон

² Кафедра пищевых технологий, инженерии и питания, инженерный факультет, Лундский университет, 22100 Лунд, Швеция

¹ SOLVE Research & Consultancy AB, Medicon Village, 22381 Лунд, Швеция

² Департамент пищевых технологий, Engin eering and Nutrition, Инженерный факультет, Лундский университет, 22100 Лунд, Швеция

Автор, ответственный за переписку.

Поступило 09.03.2018 г .; Пересмотрено 25 апреля 2018 г .; Принято 3 мая 2018 г.

Открытый доступ Эта статья распространяется на условиях Международной лицензии Creative Commons Attribution 4.0 (http://creativecommons.org/licenses/by/4.0/), которая разрешает неограниченное использование, распространение, и воспроизведение на любом носителе при условии, что вы должным образом укажете автора (авторов) и источник, предоставите ссылку на лицензию Creative Commons и укажете, были ли внесены изменения.

Эта статья цитируется в других статьях в PMC.

Abstract

Анализ агрегатов терапевтических белков имеет решающее значение для обеспечения эффективности и безопасности пациентов. Обычно анализ выполняется в готовой рецептуре, чтобы убедиться в отсутствии агрегатов. Однако важный вопрос заключается в том, что происходит с терапевтическими белками в отношении олигомеризации и агрегации после их введения (т.е. в кровь). В этой статье показано разделение цельной крови, плазмы и сыворотки с использованием асимметричного фракционирования потока поля-потока (AF4) с минимальной предварительной обработкой образца.Кроме того, продемонстрированы анализ и характеристика размера флуоресцентного антитела в плазме крови с использованием AF4. Результаты показывают пригодность и эффективность AF4 для анализа крови и открывают новые важные пути анализа и характеристики терапевтических белков в крови.

Электронные дополнительные материалы

Онлайн-версия этой статьи (10.1007 / s00216-018-1127-2) содержит дополнительные материалы, которые доступны авторизованным пользователям.

Ключевые слова: Цельная кровь, антитела, плазма, сыворотка, фракционирование по полю асимметричного потока (AF4), флуоресцентная маркировка

Введение

Белковые препараты являются быстрорастущим сектором фармацевтической промышленности и в настоящее время используются при лечении множества заболеваний.Терапевтические белки сложны в отношении их большого молекулярного размера (сравните с низкомолекулярными лекарствами) и их вторичных и третичных структур, которые необходимо поддерживать для эффективного функционирования в качестве молекул лекарства. Эти внутренние свойства белков, вместе со стрессом окружающей среды, являются одной из причин, по которым белки склонны к агрегации при фармацевтической обработке, приготовлении и хранении. Образование белковых агрегатов может привести к снижению эффективности и / или иммуногенности лекарственного средства, что ставит под угрозу безопасность пациента [1].Следовательно, контроль и устранение белковых агрегатов является важной частью рецептуры белковых продуктов.

Анализ белковых агрегатов может быть сложной задачей из-за широкого диапазона размеров — от небольших олигомеров до крупных невидимых частиц или даже видимых преципитатов [2]. Основным методом определения размера и количества невидимых агрегатов является эксклюзионная хроматография (SEC) в сочетании с подходящими детекторами. Однако в последние годы SEC, хотя и хорошо известна, подвергается сомнению, поскольку может давать ошибочные оценки совокупных уровней [3–5].Регулирующие органы, такие как Управление по санитарному надзору за качеством пищевых продуктов и медикаментов (FDA) США, теперь рекомендуют использовать несколько дополнительных ортогональных методов для проверки измерений. Анализ белковых агрегатов в готовом препарате важен, но еще более важным является понимание потенциала агрегации после введения, включая взаимодействие с компонентами крови [6]. Анализ образования агрегатов терапевтических белков после введения лекарственного средства пациенту без вмешательства в извлеченный образец является предметом долгих поисков и может быть достигнут только путем анализа крови in vivo или ex vivo.

Плазма крови — это богатый белком раствор, в котором взвешены белые и красные кровяные тельца, а также тромбоциты, а сыворотка представляет собой жидкость, оставшуюся после удаления сгустка из цельной крови, в основном с таким же составом, что и плазма, за исключением что фибриногены и факторы свертывания отсутствуют. Концентрация белка в плазме / сыворотке составляет примерно 60–80 мг / мл, из которых около 50–60% составляют альбумины и 40% глобулины (10–20% иммуноглобулин G, IgG) [7, 8]. Распределение компонентов крови по размеру колеблется от небольших молекул и ионов (<1 нм) до примерно 15 мкм для лейкоцитов.Из-за сложной природы и большого диапазона размеров компонентов крови такие пробы трудно анализировать, и обычно требуется обширная предварительная обработка проб. Типичные этапы подготовки проб включают центрифугирование, экстракцию и фильтрацию [9, 10]. Однако эта предварительная обработка может вызвать непреднамеренные артефакты, такие как нежелательная потеря компонентов, загрязнение и агрегация белков. Следовательно, очень желательно иметь возможность анализировать и характеризовать белки в крови с минимизацией изменения условий, т.е.е. поддержание физиологического pH и солености и отказ от поверхностно-активных веществ и органических растворителей.

В отраслевом руководстве FDA по агрегированному анализу не рекомендуется использовать какой-либо конкретный аналитический метод [5]. Тем не менее, требуется тщательная оценка с использованием квалифицированных методов для исключения присутствия агрегатов, и один из упомянутых методов — это асимметричное фракционирование потока поля-потока (AF4). AF4 — это метод, в котором разделение достигается приложением внешнего поля (поперечного потока) в ленточном открытом канале без неподвижной фазы [11–13].Из-за отсутствия стационарной фазы устраняются некоторые проблемы, связанные с SEC, включая минимизацию неспецифической адсорбции белка, структурную деформацию на поверхности и высокие силы сдвига, которые могут привести к деградации аналитов. Следовательно, AF4 — это очень мощный метод, который все чаще используется для разделения и характеристики биомакромолекул и фармацевтических молекул [14–16]. Было доказано, что это потенциальный инструмент для изучения биологических структур, таких как белки, антигены и антитела [17–21].В предыдущих исследованиях фракционирование в полевом потоке (FFF) использовалось для разделения и характеристики плазмы крови и липопротеинов [22–24]. Ли и др. изучили возможность разделения липопротеинов в плазме крови с помощью симметричного потока FFF, Mädorin et al. основное внимание уделялось взаимодействию между лекарственным средством с низкой молекулярной массой и плазмой и количественному анализу по выделению лекарственного средства после фракционирования с помощью AF4, а также исследованию Park et al. Исследование было сосредоточено на сравнении белков плазмы (липопротеинов и альбумина) у пациентов и здоровых людей, использующих AF4 на входе фритты.Однако во всех случаях образцы плазмы готовились некоторыми методами подготовки (центрифугирование и добавление добавок).

Целью данного исследования является изучение возможности использования AF4 для разделения белков и других компонентов в сыворотке и плазме с высоким разрешением, а также для разделения цельной крови без предварительной обработки образца, такой как центрифугирование и фильтрация. Кроме того, мы исследуем возможность выборочного разделения и обнаружения флуоресцентных антител в матрице.

Материалы и методы

Материалы

Все соли, использованные для приготовления носителя (хлорид натрия, динатрийфосфат, фосфат калия, фосфат калия, хлорид калия и азид натрия), были аналитической степени чистоты (Sigma-Aldrich, St Louis, MS, США). Воду очищали на установке Millipore Plus (Merck Millipore, Дармштадт, Германия). Контрольные образцы миоглобина, бычьего сывороточного альбумина и иммуноглобулина G были получены от Sigma-Aldrich. Сыворотка человека (номер для заказа h5522) была получена от Sigma-Aldrich.Плазма была крысиной, а цельная — мышиной (любезно предоставлена ​​Redoxis AB, Лунд, Швеция). Козье антитело против человеческого IgG, меченное FITC (флуоресцеинизотиоцианат), было получено от Capra Science Antibodies, Ängelholm, Швеция. Нагрузка FITC была оценена как 6,2 / антитело.

Метод

Анализ фракционирования асимметричного потока поля-потока (AF4) был выполнен на Eclipse II (Wyatt Technology, Dernbach, Германия) в сочетании с LC-системой серии 1100, состоящей из вакуумного дегазатора ERC-3415 (ERC). ), насос G1311A, автоматический пробоотборник G1329A, детектор с диодной матрицей U V / VIS G1315A и детектор флуоресценции G1321C (Agilent Technologies, Санта-Клара, Калифорния, США).Детектор многоуглового рассеяния света (MALS) Dawn Heleos II и детектор дифференциального показателя преломления (dRI) Optilab t-Rex были подключены к сети (технология Wyatt) после канала. УФ-детектор контролировался на 250 и 280 нм, флуоресцентный детектор был настроен на длину волны возбуждения 495 нм и контролировал излучение на 525 нм, а MALS использовал лазер с длиной волны 658 нм и измерял рассеянный свет с помощью 17 детекторов в водный жидкий носитель. Детектор dRI работал на длине волны 658 нм.

Сбор данных производился с помощью Astra 6.2 (технология Wyatt). Асимметричный канал разделения потока и поля потока представлял собой канал Wyatt SC, снабженный прокладкой шириной 350 мкм. Для анализа использовали мембрану из регенерированной целлюлозы (RC) 10 или 100 кДа (Merck Millipore). Носитель представлял собой забуференный фосфатом физиологический раствор (PBS), pH 7,4, с 3 мМ азида натрия (добавленный для предотвращения микробной активности). Фракционирование проводили при температуре окружающей среды (приблизительно 22 ° C), и все эксперименты повторяли не менее двух раз для воспроизводимости.

Тестирование производительности разделения AF4, а также проверка обнаружения MALS-RI и определения молярной массы проводились путем анализа растворов миоглобина, бычьего сывороточного альбумина и иммуноглобулина G. Для оценки данных MALS использовался метод Zimm и dRI с приращением показателя преломления dn / dc 0,185 мл / г для определения концентрации для получения молекулярной массы (MW). В методе разделения AF4 используется скорость потока детектора 0,50 мл / мин, что дает давление в системе приблизительно 3-4 бара в зависимости от конфигурации детектора.Перед началом закачки системе давали возможность стабилизировать перетоки и давления в течение 2 минут. Скорость впрыска составляла 0,2 мл / мин, время впрыска 1 мин, время фокусировки 2 мин; поперечный поток во время инъекции и фокусировки был таким же, как и во время элюирования (2,0 мл / мин). Во время элюирования скорость поперечного потока, Q _c , составляла 2,0 мл / мин, которая поддерживалась постоянной в течение 4 минут после начала элюирования, после чего уменьшалась в соответствии с уравнением. 1

, где Q _{c , 0} — объемная скорость перетока в начале распада, t — время и t _½ — скорость распада (4 мин в настоящем исследовании).Когда скорость поперечного потока достигла 0,15 мл / мин, она оставалась постоянной до конца разделения.

Объем инъекции для всех тестов составлял 10 мкл. И сыворотка крови, и плазма крови, и цельная кровь были разбавлены в 100 раз носителем (PBS) перед инъекцией в канал AF4 и разделением по размеру. Предполагая, что содержание белка в сыворотке или плазме составляет примерно 70 мг / мл, это дает, что концентрация белка в образце, поступающем в канал, составляет примерно 700 мкг / мл, а нагрузка образца на канал AF4 составляет примерно 7 мкг.Для тестов с цельной кровью использовалась мембрана с отсечкой молекулярной массы 100 кДа (MWCO) для снижения белковой нагрузки на канал путем удаления белков с более низкой молекулярной массой (таких как сывороточный альбумин), которые могут выходить из канала разделения по размеру через мембрана.

Результаты и обсуждение

Анализ сыворотки крови

Сыворотка крови была разбавлена ​​в 100 раз фосфатно-солевым буфером (PBS) (10 мкл сыворотки, к которой было добавлено 990 мкл PBS) перед разделением AF4. Разбавление было сделано для того, чтобы снизить вязкость раствора.Время элюирования сывороточного компонента сравнивали со временем элюирования, полученным при анализе белков миоглобина, бычьего сывороточного альбумина и иммуноглобулина G с использованием идентичных условий AF4 (фиг.).

AF4-UV-MALS-dRI фрактограммы и молекулярный вес. Ультрафиолетовая кривая при 250 нм (зеленый), кривая dRI (синяя) и LS при кривой 90 ° (красная). а Анализ сыворотки крови. Объем инъекции составлял 10 мкл образца сыворотки, разведенного в 100 раз, т.е. соответствовал 0,1 мкл сыворотки. б Анализ плазмы.Объем инъекции составлял 10 мкл образца плазмы, разбавленной в 100 раз, т.е. соответствовал 0,1 мкл плазмы. c Анализ миоглобина 17 кДа (красный график), 67 кДа бычьего сывороточного альбумина (синий график) и ~ 150 кДа иммуноглобулина G (зеленый график). Образцы BSA и IgG содержат димеры

Образец сыворотки показывает широкое и многомодальное распределение по размерам, обнаруженное детекторами УФ, MALS и dRI. Пик с максимумом на 4,8 мин в образце сыворотки на рис. А хорошо соответствует времени элюирования пика мономера бычьего сывороточного альбумина на рис.c (по размеру похож на сывороточный альбумин человека), а пик на 6,8 мин хорошо соответствует времени элюирования, полученному при анализе иммуноглобулина G (пик мономера на рис. c). Кроме того, данные по молярной массе из MALS дают молярную массу на вершинах пиков как 70 кДа (при 4,8 мин) и 158 кДа (при 6,8 мин). Предполагается, что двумя наиболее распространенными белками в сыворотке крови будут сывороточный альбумин и IgG (на основе литературных значений [7], часто приводимых как приблизительно 40 и 10 мг / мл, соответственно). Из этих сравнений и на основании данных о молекулярной массе мы заключаем, что с очень высокой вероятностью компонент элюируется при 4.8 мин — это в основном сывороточный альбумин, а компоненты, элюирующие около 6,8 мин, — в основном IgG.

Очевидно, учитывая огромное количество различных белков, которые, как ожидается, должны присутствовать в сыворотке крови, можно ожидать, что большое количество (аналогичного размера) белков и других компонентов сыворотки элюируется совместно с сывороточным альбумином и IgG. . Однако сывороточный альбумин и IgG являются наиболее распространенными белками и классами белков, которые можно ожидать в крови, и, вероятно, они вносят наибольший вклад в обнаруженные пики.

Идентичность компонентов сыворотки, элюированных после IgG (8–11 мин на рис. A), неизвестна, но известно, что сыворотка содержит белки больше, чем IgG, такие как альфа-2-макроглобулин (720 кДа, ~ 3 мг / мл в сыворотка) и IgM (950 кДа, ~ 1 мг / мл в сыворотке) [25]. Кроме того, существует вероятность того, что некоторые из обнаруженных компонентов представляют собой более мелкие белки, которые агрегированы или связаны с другими белками, что делает их размер больше (тем самым элюируя позже), чем у отдельного мономерного белка.

Анализ плазмы крови

Плазма крови анализировалась с использованием тех же настроек, что и для сыворотки крови. Профиль элюции (рис. B) аналогичен профилю, полученному для сыворотки крови с компонентами, обнаруженными при таком же времени элюирования, как сывороточный альбумин и иммуноглобулин G. Наиболее заметное различие между профилем элюции сыворотки и плазмы состоит в том, что имеется большее количество компонентов. элюируется в интервале времени элюирования от 3 до 6 мин (более высокая интенсивность пика при 4–6 мин в образце плазмы) на рис.б. Можно предположить, что это может быть связано с фибриногеном (белок 340 кДа), который, как ожидается, должен присутствовать в плазме, но не должен присутствовать в сыворотке (удаляется центрифугированием после свертывания крови). Эти результаты показывают более высокое разрешение разделения плазмы крови с помощью методов FFF и более чувствительное обнаружение, чем результаты предыдущих исследований [22–24].

Флуоресцентно меченые антитела в PBS и плазме

И сыворотка, и плазма содержат широкий спектр антител (по оценкам,> 10 ⁷ различных антител [26].Иммуноглобулин G подразделяется на четыре класса (IgG1 – IgG4), каждый из которых, в свою очередь, состоит из огромного набора антител, часто очень незначительно различающихся по размеру и молярной массе. Разделить их физически по размеру невозможно с помощью AF4 из-за недостаточного разрешения. Таким образом, антитела, элюируемые из AF4, будут элюироваться как смесь многих антител. Следовательно, чтобы иметь возможность обнаруживать и контролировать один конкретный тип антител, необходимо избирательное обнаружение. Обнаружение флуоресценции может предложить такое избирательное обнаружение, если интересующее антитело флуоресцентно помечено.Чтобы исследовать, можно ли контролировать флуоресцентно меченые антитела в плазме крови, использовали козьи антитела типа IgG, которые были помечены флуоресцентным маркером FITC. Для справки, флуоресцентно меченное антитело анализировали в PBS в концентрации 100 мкг / мл, объем образца 10 мкл, чтобы обеспечить обнаружение УФ, MALS и dRI (рис. А). Меченое антитело элюируется при времени элюирования 6,75 мин, аналогичном времени элюирования IgG в сыворотке и плазме (6,8 мин). Отмечено наличие плеча на пике (8–9 мин), что интерпретируется как обнаружение (не полностью разрешенных) димеров.

AF4-UV-MALS-dRI-FL фрактограммы. Обнаруживается УФ при 250 нм (зеленая кривая), MALS (красная кривая), FL при 495/525 нм (оранжевая кривая) и dRI (синяя кривая). a Анализ флуоресцентно меченых антител в PBS. Объем инъекции составлял 10 мкл раствора 100 мкг / мл (массовая нагрузка = 1 мкг). b Анализ флуоресцентно меченых антител в плазме крови. В плазму добавляли концентрацию 10 мкг флуоресцентно меченного антитела / мл плазмы. Затем добавленную плазму разбавляли в 100 раз носителем PBS перед анализом (объем образца составлял 10 мкл, что соответствует массовой нагрузке 1 нг флуоресцентно меченного антитела на канал). c Анализ флуоресцентно меченых антител в PBS (зеленая кривая) и в плазме крови (красная кривая). В плазму добавляли концентрацию 100 мкг флуоресцентно меченых антител / мл плазмы. Затем добавленную плазму разбавляли в 100 раз носителем PBS перед анализом (объем образца составлял 10 мкл, что соответствует массовой нагрузке 10 нг флуоресцентно меченого антитела на канал)

Флуоресцентно меченное антитело добавляли в плазму до концентрации 10 мкг / мл плазмы и анализировали.Детектор флуоресценции обнаруживает меченый IgG (рис. B), в то время как детекторы УФ, MALS и dRI обнаруживают все другие компоненты плазмы. При повышенной концентрации (10 мкг / мл плазмы) количество меченого IgG в канале составляет 1 нг, что слишком мало для обнаружения детекторами УФ, MALS или dRI.

Более подробное сравнение профиля элюции FICT-меченного IgG в PBS и в плазме показывает, что существуют различия, отслеживаемые детектором флуоресценции (рис. C). Меченный FICT IgG в PBS (зеленые кривые на рис.c) имеет вершину на 6,75 мин и показывает хвост на основном пике (на 8–9 мин), интерпретируемый как димер (как указано выше). Для сравнения, когда FICT-IgG вводится в плазму (красная кривая на рис. C), пик смещается на 6,9 мин. Кроме того, плечо (димер) намного более выражено (более высокая интенсивность), когда образец находится в плазме. Данные получены на одном и том же оборудовании, проанализированы рядом друг с другом, в двух экземплярах, в двух разных случаях, с использованием одних и тех же условий как для плазмы, так и для PBS.Когда Ab-FICT анализируется вместе с компонентами плазмы, становится очевидным, что как сдвиг основного пика, указывающий на то, что он действует так, как он был немного больше во время разделения, так и большее увеличение антитела, имеющего размер, аналогичный димера антитела. Вывод заключается в том, что между компонентами плазмы и FICT-меченным IgG происходит взаимодействие. Для выяснения природы взаимодействия требуются дальнейшие исследования.

Анализ цельной крови

Свежая кровь мыши была получена для исследования способности AF4 разделять даже более сложную матрицу, чем показано выше (т.е., включая клетки крови). Время между взятием пробы у мышей и анализом было коротким (примерно 30 мин), чтобы минимизировать гемолиз. ЭДТА добавляли для предотвращения свертывания крови. Кровь разбавляли в 100 раз носителем (PBS) непосредственно перед анализом, а затем кровь вводили непосредственно в канал AF4. Для этих анализов использовали мембрану 100 кДа для удаления белков с более низкой молекулярной массой из канала, что привело к снижению белковой нагрузки на канал. Обратите внимание, что эти разделения были выполнены на другой мембране, что дало различную толщину каналов и, следовательно, разное время элюирования по сравнению с приведенными выше результатами.

На фрактограмме (рис.) Виден пик (6,0 мин), совпадающий с пиком IgG, и пик 8–10 мин. В отличие от данных по сыворотке и плазме, имеется также большое количество компонентов большего размера, элюируемых в интервале времени от 10 до 20 мин, идентичность которых неизвестна. Сигнал светорассеяния показывает несколько узких пиков с высокой интенсивностью (шум). Предположительно, это происходит из-за элюирования крупных компонентов с очень высокой молекулярной массой или частиц цельной крови, которых относительно мало (например, целых клеток крови или их фрагментов).

Анализ цельной крови с помощью AF4-UV-MALS-dRI. Ультрафиолетовая кривая при 250 нм (зеленый), кривая dRI (синяя) и LS при кривой 90 ° (красная). Объем инъекции составлял 10 мкл образца крови, разбавленного в 100 раз, т.е. соответствует 0,1 мкл цельной крови.

Эритроциты имеют размер примерно 0,5 × 8 мкм и находятся за пределами диапазона броуновского режима AF4 [27, 28]. Поскольку цель анализа не заключалась в разделении этих больших компонентов, не ожидается, что они будут должным образом разделены. Скорее, цель заключалась в том, чтобы проверить, можно ли ввести образец крови с минимальной предварительной обработкой образца и без удаления каких-либо компонентов.Единственное нарушение в крови заключается в добавлении ЭДТА (для предотвращения свертывания крови) и в том, что образец был разбавлен носителем (PBS) перед инъекцией (для снижения вязкости). Фильтрация, центрифугирование или добавление модификаторов растворителей не производились, и кровь анализируется в носителе PBS, который имеет ионную силу и pH, очень близкие к крови. В той степени, в которой цельная кровь может быть проанализирована с помощью AF4, этот тест показывает, что это можно сделать; IgG и другие белки были элюированы, и матрица цельной крови не приводила к нарушению разделения по размерам.

Однако за эритроцитами из-за их цвета можно было наблюдать визуально, когда они вводились в канал, и было отмечено, что они прилипают к мембране (см. Дополнительный электронный материал (ESM), рис. S1). После анализа канал промывали (прокачка носителя PBS через канал со скоростью 0,5 мл / мин, отсутствие перетока), и примерно через 1 ч в канале не было визуально никаких красных следов. Это интерпретируется как то, что либо (а) клетки были вымыты, либо (б) клетки были гемолизированы и, таким образом, потеряли свой цвет (возможно, вымывшиеся фрагменты).Очевидно, что если бы цельная кровь анализировалась рутинно, это потребовало бы исследования и оптимизации типа и химического состава мембраны, состава носителя и протоколов промывки. Кроме того, вызывает беспокойство возможность засорения потоковых линий как в автосамплере, так и в детекторах, хотя во время этих повторных анализов засорения не наблюдалось.

Выводы

Три наиболее распространенных типа образцов крови (сыворотка, плазма и цельная кровь) были успешно разделены по размеру с помощью AF4.Возможность анализировать образцы крови в условиях, близких к естественным (например, ионная сила, pH, отсутствие фильтрации, центрифугирование, добавление органических модификаторов / растворителей или детергентов) открывает возможность для:

1. Профилирование размеров белков крови — исследование различий в распределении крови по размеру между образцами и изменений во времени

2. Исследования терапевтических белков (флуоресцентно меченных) в крови.

Обычно изучают терапевтические белки в составе, например, чтобы исследовать, происходит ли агрегация или разложение, обычно как часть контроля качества или во время разработки состава.Однако возможность использования AF4 для разделения по размеру в крови делает возможным изучение агрегации или деградации в среде, в которой должен присутствовать терапевтический белок (т. Е. В крови). В этом исследовании показано, что можно анализировать антитела в плазме крови. Результаты помогут ответить на вопрос о том, что происходит с терапевтическими белками после их введения [29]. В свете этого возможно, что AF4 является единственным доступным в настоящее время методом ex vivo анализа белковых агрегатов (размером <1 мкм), который может вызывать иммуногенность, требуя минимальной предварительной обработки образца.Требования к таким исследованиям состоят в том, чтобы можно было использовать метод селективного обнаружения, такой как флуоресценция (путем введения флуоресцентной метки на интересующее соединение). Масс-спектрометрия - еще один интересный метод, который можно использовать для селективного обнаружения терапевтических белков, разделенных, как описано в этой статье, что не требует флуоресцентного мечения. Флуоресцентное мечение было бы привлекательным, чтобы избежать, поскольку оно вносит изменения в химические свойства белка, которые, в свою очередь, могут повлиять на склонность к образованию агрегатов.

Электронный дополнительный материал

ESM 1 ^{(128K, pdf)}

(PDF 127 kb)

Благодарности

Авторы благодарят Redoxis AB, Лунд, Швеция, за предоставленные образцы плазмы и цельной крови.

Информация о финансировании

Это исследование финансировалось Винновским центром компетенций NextBioForm.

Соблюдение этических стандартов

Конфликт интересов

Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.

Сноски

Электронные дополнительные материалы

Онлайн-версия этой статьи (10.1007 / s00216-018-1127-2) содержит дополнительные материалы, которые доступны авторизованным пользователям.

Ссылки

1. Frokjaer S, Otzen DE. Стабильность белкового лекарственного средства: проблема рецептуры. Nat Rev Drug Disc. 2005. 4 (4): 298–306. DOI: 10,1038 / NRD1695. [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar] 2. Ден Энгельсман Дж., Гаридель П., Смолдерс Р., Колл Х., Смит Б., Бассараб С., Зайдл А., Хайнцл О., Джискут В.Стратегии оценки белковых агрегатов при разработке фармацевтических биотехнологических продуктов. Pharm Res. 2011; 28 (4): 920–933. DOI: 10.1007 / s11095-010-0297-1. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar] 3. Мэннинг Р.Р., Холкомб Р.Э., Уилсон Г.А., Генри К.С., Мэннинг М.С. Обзор методов, ортогональных к SEC для количественного определения и характеристики белковых агрегатов. Biopharm Int. 2014; 27 (12): 32. [Google Scholar] 4. Карпентер Дж. Ф., Рэндольф Т. В., Джискут В., Кроммелин Д. А., Миддо К. Р., Винтер Г. Потенциальное неточное количественное определение и определение размеров белковых агрегатов с помощью эксклюзионной хроматографии: существенная необходимость в использовании ортогональных методов для обеспечения качества терапевтических белковых продуктов.J Pharm Sci. 2010. 99 (5): 2200–2208. DOI: 10.1002 / jps.21989. [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar]

5. USFDA (2014) Руководство по промышленной оценке иммуногенности терапевтических белковых продуктов.

6. Ван В., Сингх С.К., Ли Н., Толер М.Р., Кинг К.Р., Нема С. Иммуногенность белковых агрегатов — проблемы и реальность. Int J Pharm. 2012; 431 (1–2): 1–11. [PubMed] [Google Scholar] 7. Барретт К.Е., Брукс Х., Бойтано С., Бармен С.М. Обзор медицинской физиологии Ганонга. 23. Нью-Йорк: McGraw-Hill Medical; 2010 г.[Google Scholar] 8. Gonzalez-Quintela A, Alende R, Gude F, Campos J, Rey J, Meijide LM, Fernandez-Merino C, Vidal C. Сывороточные уровни иммуноглобулинов (IgG, IgA, IgM) у взрослого населения в целом и их связь с потреблением алкоголя , курение и общие нарушения обмена веществ. Clin Exp Immunol. 2008. 151 (1): 42–50. DOI: 10.1111 / j.1365-2249.2007.03545.x. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar] 9. Pretlow TG, Pretlow TP. Разделение клеток: методы и избранные применения. Кембридж: Academic Pr; 1983 г.[Google Scholar] 10. Питт В.Г., Ализаде М., Хусейни Г.А., Макклеллан Д.С., Бьюкенен К.М., Бледсо К.Г., Робисон Р.А., Бланко Р., Родер Б.Л., Мелвилл М., Хантер А.К. Быстрое отделение бактерий от крови — обзор и перспективы. Biotechnol Prog. 2016; 32 (4): 823–839. DOI: 10.1002 / btpr.2299. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar] 11. Валунд К.Г., Нильссон Л. Flow FFF — основы и ключевые приложения. В: Williams SKR, Caldwell K, редакторы. Полевое фракционирование в биополимерном анализе. Вена: Springer Verlag; 2012 г.С. 1–21. [Google Scholar] 12. Litzén A, Wahlund KG. Расширение и разбавление зон в прямоугольных и трапециевидных асимметричных каналах фракционирования потока. Anal Chem. 1991. 63 (10): 1001–1007. DOI: 10.1021 / ac00010a013. [CrossRef] [Google Scholar] 13. Валунд К.Г., Литцен А. Применение канала фракционирования с асимметричным потоком поля-потока для разделения и характеристики белков, плазмид, фрагментов плазмид, полисахаридов и одноклеточных водорослей. J Chromatogr. 1989. 461: 73–87. DOI: 10.1016 / S0021-9673 (00) 94276-6. [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar] 14. Куреши Р.Н., Кок В.Т. Применение фракционирования потока поля потока для характеристики макромолекул, представляющих биологический интерес: обзор. Anal Bioanal Chem. 2011. 399 (4): 1401–1411. DOI: 10.1007 / s00216-010-4278-3. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar] 15. Rambaldi DC, Reschiglian P, Zattoni A. Фракционирование потока поля-потока: последние тенденции в анализе белков. Anal Bioanal Chem. 2011. 399 (4): 1439–1447. DOI: 10.1007 / s00216-010-4312-5.[PubMed] [CrossRef] [Google Scholar] 16. Нильссон Л. Разделение и характеристика макромолекул пищевых продуктов с использованием фракционирования в полевом потоке: обзор. Пищевой Hydrocoll. 2013; 30 (1): 1–11. DOI: 10.1016 / j.foodhyd.2012.04.007. [CrossRef] [Google Scholar] 17. Чой Дж., Ли С., Линарес-Пастен Дж., Нильссон Л. Исследование олигомеризации глутаматдекарбоксилазы из Lactobacillus brevis с использованием фракционирования поля-потока с асимметричным потоком (AF4) с методами светорассеяния. Anal Bioanal Chem. 2018; 410 (2): 451–458. DOI: 10.1007 / s00216-017-0735-6. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar] 18. Cragnell C, Choi J, Segad M, Lee S, Nilsson L, Skepö M. Бычий β-казеин имеет полидисперсное распределение равновесных мицелл. Пищевой Hydrocoll. 2017; 70: 65–68. DOI: 10.1016 / j.foodhyd.2017.03.021. [CrossRef] [Google Scholar] 19. Сандра К., Ванденхид И., Сандра П. Современные хроматографические и масс-спектрометрические методы для биофармацевтической характеристики белков. J Chromatogr A. 2014; 1335: 81–103. DOI: 10.1016 / j.chroma.2013.11.057. [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar] 20. Шин К., Чой Дж., Чо Дж. Х., Юн М.Ю., Ли С., Чунг Х. Возможность асимметричного фракционирования потока поля-потока как метода обнаружения защитного антигена путем прямого распознавания нанозондов, захваченных мишенью, с увеличенным размером. J Chromatogr A. 2015; 1422: 239–246. DOI: 10.1016 / j.chroma.2015.09.089. [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar] 21. Litzén A, Walter JK, Krischollek H, Wahlund KG. Разделение и количественное определение агрегатов моноклональных антител путем фракционирования по полю с асимметричным потоком и сравнение с гель-проникающей хроматографией.Анальная биохимия. 1993. 212 (2): 469–480. DOI: 10.1006 / abio.1993.1356. [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar] 22. Мадорин М., Ван Хогевест П., Хилфикер Р., Лангвост Б., Кресбах Г.М., Эрат М., Лойенбергер Х. Анализ взаимодействий лекарственное средство / белок плазмы с помощью фракционирования поля-потока с асимметричным потоком. Pharm Res. 1997. 14 (12): 1706–1712. DOI: 10,1023 / А: 1012171511285. [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar] 23. Ли П., Гиддингс Дж. Выделение и измерение коллоидов в плазме человека с помощью мембранно-селективного потокового фракционирования поля-потока: липопротеинов и фармацевтических коллоидов.J Pharm Sci. 1996. 85 (8): 895–898. DOI: 10.1021 / js950335s. [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar] 24. Пак И, Пэнг КДж, Юн Й, Сон Дж.Х., Мун МН. Разделение и селективное обнаружение липопротеиновых частиц у пациентов с ишемической болезнью сердца путем фракционирования с асимметричным потоком на входе фритты. J Chromatogr B Anal Technol Biomed Life Sci. 2002. 780 (2): 415–422. DOI: 10.1016 / S1570-0232 (02) 00630-X. [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar] 25. Дати Ф., Шуман Дж., Томас Л., Агуцци Ф., Бауднер С., Бьенвеню Дж., Блаабьерг О., Блируп-Дженсен С., Карлстром А., Петерсен П. Х., Джонсон А. М., Милфорд-Уорд А., Ричи Р. Ф., Свендсен П. Дж., Уичер Дж.Консенсус группы профессиональных обществ и диагностических компаний по руководящим принципам для промежуточных референсных диапазонов для 14 белков в сыворотке на основе стандартизации справочного материала IFCC / BCR / CAP (CRM 470) Eur J Clin Chem Clin Biochem. 1996. 34 (6): 517–520. [PubMed] [Google Scholar] 26. Аббас А.К., Лихтман А.Х., Побер Я.С. Клеточная и молекулярная иммунология. 4. Филадельфия: W. B. Saunders Co .; 2000. [Google Scholar] 27. Колдуэлл К.Д., Нгуен Т.Т., Майерс М.Н., Гиддингс Дж.С. Наблюдения за аномальным удержанием при фракционировании стерического поля-потока.Sep Sci Technol. 1979; 14 (10): 935–946. DOI: 10.1080 / 014963978103. [CrossRef] [Google Scholar] 28. Уильямс PS, Гиддингс JC. Теория программно-полевого фракционирования потока с поправками на стерические эффекты. Anal Chem. 1994. 66 (23): 4215–4228. DOI: 10.1021 / ac00095a017. [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar] 29. Би Дж. С., Голец Т. Дж., Рагхеб Дж. А. Будущее характеристики белковых частиц и понимание их потенциала для снижения иммуногенности биофармацевтических препаратов: общая точка зрения.J Pharm Sci. 2012. 101 (10): 3580–3585. DOI: 10.1002 / jps.23247. [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar]

Белки и антитела в сыворотке, плазме и цельной крови — определение размера с использованием асимметричного полевого фракционирования потока (AF4)

Anal Bioanal Chem. 2018; 410 (20): 4867–4873.

, ¹ , ² , ¹ , ¹ и ²

Mats Leeman

¹ SOLVE Research & Consultancy AB, Medicon Village, 22381 Lund, Sweden 9022ye 9024i J ² Кафедра пищевых технологий, инженерии и питания, Инженерный факультет, Лундский университет, 22100 Лунд, Швеция

Себастьян Ханссон

¹ SOLVE Research & Consultancy AB, Medicon Village, 22381 Лунд, Швеция

Матильда Улмиус Storm

¹ SOLVE Research & Consultancy AB, Medicon Village, 22381 Лунд, Швеция

Ларс Нильссон

² Кафедра пищевых технологий, инженерии и питания, инженерный факультет, Лундский университет, 22100 Лунд, Швеция

¹ SOLVE Research & Consultancy AB, Medicon Village, 22381 Лунд, Швеция

² Департамент пищевых технологий, Engin eering and Nutrition, Инженерный факультет, Лундский университет, 22100 Лунд, Швеция

Автор, ответственный за переписку.

Поступило 09.03.2018 г .; Пересмотрено 25 апреля 2018 г .; Принято 3 мая 2018 г.

Открытый доступ Эта статья распространяется на условиях Международной лицензии Creative Commons Attribution 4.0 (http://creativecommons.org/licenses/by/4.0/), которая разрешает неограниченное использование, распространение, и воспроизведение на любом носителе при условии, что вы должным образом укажете автора (авторов) и источник, предоставите ссылку на лицензию Creative Commons и укажете, были ли внесены изменения.

Эта статья цитируется в других статьях в PMC.

Abstract

Анализ агрегатов терапевтических белков имеет решающее значение для обеспечения эффективности и безопасности пациентов. Обычно анализ выполняется в готовой рецептуре, чтобы убедиться в отсутствии агрегатов. Однако важный вопрос заключается в том, что происходит с терапевтическими белками в отношении олигомеризации и агрегации после их введения (т.е. в кровь). В этой статье показано разделение цельной крови, плазмы и сыворотки с использованием асимметричного фракционирования потока поля-потока (AF4) с минимальной предварительной обработкой образца.Кроме того, продемонстрированы анализ и характеристика размера флуоресцентного антитела в плазме крови с использованием AF4. Результаты показывают пригодность и эффективность AF4 для анализа крови и открывают новые важные пути анализа и характеристики терапевтических белков в крови.

Электронные дополнительные материалы

Онлайн-версия этой статьи (10.1007 / s00216-018-1127-2) содержит дополнительные материалы, которые доступны авторизованным пользователям.

Ключевые слова: Цельная кровь, антитела, плазма, сыворотка, фракционирование по полю асимметричного потока (AF4), флуоресцентная маркировка

Введение

Белковые препараты являются быстрорастущим сектором фармацевтической промышленности и в настоящее время используются при лечении множества заболеваний.Терапевтические белки сложны в отношении их большого молекулярного размера (сравните с низкомолекулярными лекарствами) и их вторичных и третичных структур, которые необходимо поддерживать для эффективного функционирования в качестве молекул лекарства. Эти внутренние свойства белков, вместе со стрессом окружающей среды, являются одной из причин, по которым белки склонны к агрегации при фармацевтической обработке, приготовлении и хранении. Образование белковых агрегатов может привести к снижению эффективности и / или иммуногенности лекарственного средства, что ставит под угрозу безопасность пациента [1].Следовательно, контроль и устранение белковых агрегатов является важной частью рецептуры белковых продуктов.

Анализ белковых агрегатов может быть сложной задачей из-за широкого диапазона размеров — от небольших олигомеров до крупных невидимых частиц или даже видимых преципитатов [2]. Основным методом определения размера и количества невидимых агрегатов является эксклюзионная хроматография (SEC) в сочетании с подходящими детекторами. Однако в последние годы SEC, хотя и хорошо известна, подвергается сомнению, поскольку может давать ошибочные оценки совокупных уровней [3–5].Регулирующие органы, такие как Управление по санитарному надзору за качеством пищевых продуктов и медикаментов (FDA) США, теперь рекомендуют использовать несколько дополнительных ортогональных методов для проверки измерений. Анализ белковых агрегатов в готовом препарате важен, но еще более важным является понимание потенциала агрегации после введения, включая взаимодействие с компонентами крови [6]. Анализ образования агрегатов терапевтических белков после введения лекарственного средства пациенту без вмешательства в извлеченный образец является предметом долгих поисков и может быть достигнут только путем анализа крови in vivo или ex vivo.

Плазма крови — это богатый белком раствор, в котором взвешены белые и красные кровяные тельца, а также тромбоциты, а сыворотка представляет собой жидкость, оставшуюся после удаления сгустка из цельной крови, в основном с таким же составом, что и плазма, за исключением что фибриногены и факторы свертывания отсутствуют. Концентрация белка в плазме / сыворотке составляет примерно 60–80 мг / мл, из которых около 50–60% составляют альбумины и 40% глобулины (10–20% иммуноглобулин G, IgG) [7, 8]. Распределение компонентов крови по размеру колеблется от небольших молекул и ионов (<1 нм) до примерно 15 мкм для лейкоцитов.Из-за сложной природы и большого диапазона размеров компонентов крови такие пробы трудно анализировать, и обычно требуется обширная предварительная обработка проб. Типичные этапы подготовки проб включают центрифугирование, экстракцию и фильтрацию [9, 10]. Однако эта предварительная обработка может вызвать непреднамеренные артефакты, такие как нежелательная потеря компонентов, загрязнение и агрегация белков. Следовательно, очень желательно иметь возможность анализировать и характеризовать белки в крови с минимизацией изменения условий, т.е.е. поддержание физиологического pH и солености и отказ от поверхностно-активных веществ и органических растворителей.

В отраслевом руководстве FDA по агрегированному анализу не рекомендуется использовать какой-либо конкретный аналитический метод [5]. Тем не менее, требуется тщательная оценка с использованием квалифицированных методов для исключения присутствия агрегатов, и один из упомянутых методов — это асимметричное фракционирование потока поля-потока (AF4). AF4 — это метод, в котором разделение достигается приложением внешнего поля (поперечного потока) в ленточном открытом канале без неподвижной фазы [11–13].Из-за отсутствия стационарной фазы устраняются некоторые проблемы, связанные с SEC, включая минимизацию неспецифической адсорбции белка, структурную деформацию на поверхности и высокие силы сдвига, которые могут привести к деградации аналитов. Следовательно, AF4 — это очень мощный метод, который все чаще используется для разделения и характеристики биомакромолекул и фармацевтических молекул [14–16]. Было доказано, что это потенциальный инструмент для изучения биологических структур, таких как белки, антигены и антитела [17–21].В предыдущих исследованиях фракционирование в полевом потоке (FFF) использовалось для разделения и характеристики плазмы крови и липопротеинов [22–24]. Ли и др. изучили возможность разделения липопротеинов в плазме крови с помощью симметричного потока FFF, Mädorin et al. основное внимание уделялось взаимодействию между лекарственным средством с низкой молекулярной массой и плазмой и количественному анализу по выделению лекарственного средства после фракционирования с помощью AF4, а также исследованию Park et al. Исследование было сосредоточено на сравнении белков плазмы (липопротеинов и альбумина) у пациентов и здоровых людей, использующих AF4 на входе фритты.Однако во всех случаях образцы плазмы готовились некоторыми методами подготовки (центрифугирование и добавление добавок).

Целью данного исследования является изучение возможности использования AF4 для разделения белков и других компонентов в сыворотке и плазме с высоким разрешением, а также для разделения цельной крови без предварительной обработки образца, такой как центрифугирование и фильтрация. Кроме того, мы исследуем возможность выборочного разделения и обнаружения флуоресцентных антител в матрице.

Материалы и методы

Материалы

Все соли, использованные для приготовления носителя (хлорид натрия, динатрийфосфат, фосфат калия, фосфат калия, хлорид калия и азид натрия), были аналитической степени чистоты (Sigma-Aldrich, St Louis, MS, США). Воду очищали на установке Millipore Plus (Merck Millipore, Дармштадт, Германия). Контрольные образцы миоглобина, бычьего сывороточного альбумина и иммуноглобулина G были получены от Sigma-Aldrich. Сыворотка человека (номер для заказа h5522) была получена от Sigma-Aldrich.Плазма была крысиной, а цельная — мышиной (любезно предоставлена ​​Redoxis AB, Лунд, Швеция). Козье антитело против человеческого IgG, меченное FITC (флуоресцеинизотиоцианат), было получено от Capra Science Antibodies, Ängelholm, Швеция. Нагрузка FITC была оценена как 6,2 / антитело.

Метод

Анализ фракционирования асимметричного потока поля-потока (AF4) был выполнен на Eclipse II (Wyatt Technology, Dernbach, Германия) в сочетании с LC-системой серии 1100, состоящей из вакуумного дегазатора ERC-3415 (ERC). ), насос G1311A, автоматический пробоотборник G1329A, детектор с диодной матрицей U V / VIS G1315A и детектор флуоресценции G1321C (Agilent Technologies, Санта-Клара, Калифорния, США).Детектор многоуглового рассеяния света (MALS) Dawn Heleos II и детектор дифференциального показателя преломления (dRI) Optilab t-Rex были подключены к сети (технология Wyatt) после канала. УФ-детектор контролировался на 250 и 280 нм, флуоресцентный детектор был настроен на длину волны возбуждения 495 нм и контролировал излучение на 525 нм, а MALS использовал лазер с длиной волны 658 нм и измерял рассеянный свет с помощью 17 детекторов в водный жидкий носитель. Детектор dRI работал на длине волны 658 нм.

Сбор данных производился с помощью Astra 6.2 (технология Wyatt). Асимметричный канал разделения потока и поля потока представлял собой канал Wyatt SC, снабженный прокладкой шириной 350 мкм. Для анализа использовали мембрану из регенерированной целлюлозы (RC) 10 или 100 кДа (Merck Millipore). Носитель представлял собой забуференный фосфатом физиологический раствор (PBS), pH 7,4, с 3 мМ азида натрия (добавленный для предотвращения микробной активности). Фракционирование проводили при температуре окружающей среды (приблизительно 22 ° C), и все эксперименты повторяли не менее двух раз для воспроизводимости.

Тестирование производительности разделения AF4, а также проверка обнаружения MALS-RI и определения молярной массы проводились путем анализа растворов миоглобина, бычьего сывороточного альбумина и иммуноглобулина G. Для оценки данных MALS использовался метод Zimm и dRI с приращением показателя преломления dn / dc 0,185 мл / г для определения концентрации для получения молекулярной массы (MW). В методе разделения AF4 используется скорость потока детектора 0,50 мл / мин, что дает давление в системе приблизительно 3-4 бара в зависимости от конфигурации детектора.Перед началом закачки системе давали возможность стабилизировать перетоки и давления в течение 2 минут. Скорость впрыска составляла 0,2 мл / мин, время впрыска 1 мин, время фокусировки 2 мин; поперечный поток во время инъекции и фокусировки был таким же, как и во время элюирования (2,0 мл / мин). Во время элюирования скорость поперечного потока, Q _c , составляла 2,0 мл / мин, которая поддерживалась постоянной в течение 4 минут после начала элюирования, после чего уменьшалась в соответствии с уравнением. 1

, где Q _{c , 0} — объемная скорость перетока в начале распада, t — время и t _½ — скорость распада (4 мин в настоящем исследовании).Когда скорость поперечного потока достигла 0,15 мл / мин, она оставалась постоянной до конца разделения.

Объем инъекции для всех тестов составлял 10 мкл. И сыворотка крови, и плазма крови, и цельная кровь были разбавлены в 100 раз носителем (PBS) перед инъекцией в канал AF4 и разделением по размеру. Предполагая, что содержание белка в сыворотке или плазме составляет примерно 70 мг / мл, это дает, что концентрация белка в образце, поступающем в канал, составляет примерно 700 мкг / мл, а нагрузка образца на канал AF4 составляет примерно 7 мкг.Для тестов с цельной кровью использовалась мембрана с отсечкой молекулярной массы 100 кДа (MWCO) для снижения белковой нагрузки на канал путем удаления белков с более низкой молекулярной массой (таких как сывороточный альбумин), которые могут выходить из канала разделения по размеру через мембрана.

Результаты и обсуждение

Анализ сыворотки крови

Сыворотка крови была разбавлена ​​в 100 раз фосфатно-солевым буфером (PBS) (10 мкл сыворотки, к которой было добавлено 990 мкл PBS) перед разделением AF4. Разбавление было сделано для того, чтобы снизить вязкость раствора.Время элюирования сывороточного компонента сравнивали со временем элюирования, полученным при анализе белков миоглобина, бычьего сывороточного альбумина и иммуноглобулина G с использованием идентичных условий AF4 (фиг.).

AF4-UV-MALS-dRI фрактограммы и молекулярный вес. Ультрафиолетовая кривая при 250 нм (зеленый), кривая dRI (синяя) и LS при кривой 90 ° (красная). а Анализ сыворотки крови. Объем инъекции составлял 10 мкл образца сыворотки, разведенного в 100 раз, т.е. соответствовал 0,1 мкл сыворотки. б Анализ плазмы.Объем инъекции составлял 10 мкл образца плазмы, разбавленной в 100 раз, т.е. соответствовал 0,1 мкл плазмы. c Анализ миоглобина 17 кДа (красный график), 67 кДа бычьего сывороточного альбумина (синий график) и ~ 150 кДа иммуноглобулина G (зеленый график). Образцы BSA и IgG содержат димеры

Образец сыворотки показывает широкое и многомодальное распределение по размерам, обнаруженное детекторами УФ, MALS и dRI. Пик с максимумом на 4,8 мин в образце сыворотки на рис. А хорошо соответствует времени элюирования пика мономера бычьего сывороточного альбумина на рис.c (по размеру похож на сывороточный альбумин человека), а пик на 6,8 мин хорошо соответствует времени элюирования, полученному при анализе иммуноглобулина G (пик мономера на рис. c). Кроме того, данные по молярной массе из MALS дают молярную массу на вершинах пиков как 70 кДа (при 4,8 мин) и 158 кДа (при 6,8 мин). Предполагается, что двумя наиболее распространенными белками в сыворотке крови будут сывороточный альбумин и IgG (на основе литературных значений [7], часто приводимых как приблизительно 40 и 10 мг / мл, соответственно). Из этих сравнений и на основании данных о молекулярной массе мы заключаем, что с очень высокой вероятностью компонент элюируется при 4.8 мин — это в основном сывороточный альбумин, а компоненты, элюирующие около 6,8 мин, — в основном IgG.

Очевидно, учитывая огромное количество различных белков, которые, как ожидается, должны присутствовать в сыворотке крови, можно ожидать, что большое количество (аналогичного размера) белков и других компонентов сыворотки элюируется совместно с сывороточным альбумином и IgG. . Однако сывороточный альбумин и IgG являются наиболее распространенными белками и классами белков, которые можно ожидать в крови, и, вероятно, они вносят наибольший вклад в обнаруженные пики.

Идентичность компонентов сыворотки, элюированных после IgG (8–11 мин на рис. A), неизвестна, но известно, что сыворотка содержит белки больше, чем IgG, такие как альфа-2-макроглобулин (720 кДа, ~ 3 мг / мл в сыворотка) и IgM (950 кДа, ~ 1 мг / мл в сыворотке) [25]. Кроме того, существует вероятность того, что некоторые из обнаруженных компонентов представляют собой более мелкие белки, которые агрегированы или связаны с другими белками, что делает их размер больше (тем самым элюируя позже), чем у отдельного мономерного белка.

Анализ плазмы крови

Плазма крови анализировалась с использованием тех же настроек, что и для сыворотки крови. Профиль элюции (рис. B) аналогичен профилю, полученному для сыворотки крови с компонентами, обнаруженными при таком же времени элюирования, как сывороточный альбумин и иммуноглобулин G. Наиболее заметное различие между профилем элюции сыворотки и плазмы состоит в том, что имеется большее количество компонентов. элюируется в интервале времени элюирования от 3 до 6 мин (более высокая интенсивность пика при 4–6 мин в образце плазмы) на рис.б. Можно предположить, что это может быть связано с фибриногеном (белок 340 кДа), который, как ожидается, должен присутствовать в плазме, но не должен присутствовать в сыворотке (удаляется центрифугированием после свертывания крови). Эти результаты показывают более высокое разрешение разделения плазмы крови с помощью методов FFF и более чувствительное обнаружение, чем результаты предыдущих исследований [22–24].

Флуоресцентно меченые антитела в PBS и плазме

И сыворотка, и плазма содержат широкий спектр антител (по оценкам,> 10 ⁷ различных антител [26].Иммуноглобулин G подразделяется на четыре класса (IgG1 – IgG4), каждый из которых, в свою очередь, состоит из огромного набора антител, часто очень незначительно различающихся по размеру и молярной массе. Разделить их физически по размеру невозможно с помощью AF4 из-за недостаточного разрешения. Таким образом, антитела, элюируемые из AF4, будут элюироваться как смесь многих антител. Следовательно, чтобы иметь возможность обнаруживать и контролировать один конкретный тип антител, необходимо избирательное обнаружение. Обнаружение флуоресценции может предложить такое избирательное обнаружение, если интересующее антитело флуоресцентно помечено.Чтобы исследовать, можно ли контролировать флуоресцентно меченые антитела в плазме крови, использовали козьи антитела типа IgG, которые были помечены флуоресцентным маркером FITC. Для справки, флуоресцентно меченное антитело анализировали в PBS в концентрации 100 мкг / мл, объем образца 10 мкл, чтобы обеспечить обнаружение УФ, MALS и dRI (рис. А). Меченое антитело элюируется при времени элюирования 6,75 мин, аналогичном времени элюирования IgG в сыворотке и плазме (6,8 мин). Отмечено наличие плеча на пике (8–9 мин), что интерпретируется как обнаружение (не полностью разрешенных) димеров.

AF4-UV-MALS-dRI-FL фрактограммы. Обнаруживается УФ при 250 нм (зеленая кривая), MALS (красная кривая), FL при 495/525 нм (оранжевая кривая) и dRI (синяя кривая). a Анализ флуоресцентно меченых антител в PBS. Объем инъекции составлял 10 мкл раствора 100 мкг / мл (массовая нагрузка = 1 мкг). b Анализ флуоресцентно меченых антител в плазме крови. В плазму добавляли концентрацию 10 мкг флуоресцентно меченного антитела / мл плазмы. Затем добавленную плазму разбавляли в 100 раз носителем PBS перед анализом (объем образца составлял 10 мкл, что соответствует массовой нагрузке 1 нг флуоресцентно меченного антитела на канал). c Анализ флуоресцентно меченых антител в PBS (зеленая кривая) и в плазме крови (красная кривая). В плазму добавляли концентрацию 100 мкг флуоресцентно меченых антител / мл плазмы. Затем добавленную плазму разбавляли в 100 раз носителем PBS перед анализом (объем образца составлял 10 мкл, что соответствует массовой нагрузке 10 нг флуоресцентно меченого антитела на канал)

Флуоресцентно меченное антитело добавляли в плазму до концентрации 10 мкг / мл плазмы и анализировали.Детектор флуоресценции обнаруживает меченый IgG (рис. B), в то время как детекторы УФ, MALS и dRI обнаруживают все другие компоненты плазмы. При повышенной концентрации (10 мкг / мл плазмы) количество меченого IgG в канале составляет 1 нг, что слишком мало для обнаружения детекторами УФ, MALS или dRI.

Более подробное сравнение профиля элюции FICT-меченного IgG в PBS и в плазме показывает, что существуют различия, отслеживаемые детектором флуоресценции (рис. C). Меченный FICT IgG в PBS (зеленые кривые на рис.c) имеет вершину на 6,75 мин и показывает хвост на основном пике (на 8–9 мин), интерпретируемый как димер (как указано выше). Для сравнения, когда FICT-IgG вводится в плазму (красная кривая на рис. C), пик смещается на 6,9 мин. Кроме того, плечо (димер) намного более выражено (более высокая интенсивность), когда образец находится в плазме. Данные получены на одном и том же оборудовании, проанализированы рядом друг с другом, в двух экземплярах, в двух разных случаях, с использованием одних и тех же условий как для плазмы, так и для PBS.Когда Ab-FICT анализируется вместе с компонентами плазмы, становится очевидным, что как сдвиг основного пика, указывающий на то, что он действует так, как он был немного больше во время разделения, так и большее увеличение антитела, имеющего размер, аналогичный димера антитела. Вывод заключается в том, что между компонентами плазмы и FICT-меченным IgG происходит взаимодействие. Для выяснения природы взаимодействия требуются дальнейшие исследования.

Анализ цельной крови

Свежая кровь мыши была получена для исследования способности AF4 разделять даже более сложную матрицу, чем показано выше (т.е., включая клетки крови). Время между взятием пробы у мышей и анализом было коротким (примерно 30 мин), чтобы минимизировать гемолиз. ЭДТА добавляли для предотвращения свертывания крови. Кровь разбавляли в 100 раз носителем (PBS) непосредственно перед анализом, а затем кровь вводили непосредственно в канал AF4. Для этих анализов использовали мембрану 100 кДа для удаления белков с более низкой молекулярной массой из канала, что привело к снижению белковой нагрузки на канал. Обратите внимание, что эти разделения были выполнены на другой мембране, что дало различную толщину каналов и, следовательно, разное время элюирования по сравнению с приведенными выше результатами.

На фрактограмме (рис.) Виден пик (6,0 мин), совпадающий с пиком IgG, и пик 8–10 мин. В отличие от данных по сыворотке и плазме, имеется также большое количество компонентов большего размера, элюируемых в интервале времени от 10 до 20 мин, идентичность которых неизвестна. Сигнал светорассеяния показывает несколько узких пиков с высокой интенсивностью (шум). Предположительно, это происходит из-за элюирования крупных компонентов с очень высокой молекулярной массой или частиц цельной крови, которых относительно мало (например, целых клеток крови или их фрагментов).

Анализ цельной крови с помощью AF4-UV-MALS-dRI. Ультрафиолетовая кривая при 250 нм (зеленый), кривая dRI (синяя) и LS при кривой 90 ° (красная). Объем инъекции составлял 10 мкл образца крови, разбавленного в 100 раз, т.е. соответствует 0,1 мкл цельной крови.

Эритроциты имеют размер примерно 0,5 × 8 мкм и находятся за пределами диапазона броуновского режима AF4 [27, 28]. Поскольку цель анализа не заключалась в разделении этих больших компонентов, не ожидается, что они будут должным образом разделены. Скорее, цель заключалась в том, чтобы проверить, можно ли ввести образец крови с минимальной предварительной обработкой образца и без удаления каких-либо компонентов.Единственное нарушение в крови заключается в добавлении ЭДТА (для предотвращения свертывания крови) и в том, что образец был разбавлен носителем (PBS) перед инъекцией (для снижения вязкости). Фильтрация, центрифугирование или добавление модификаторов растворителей не производились, и кровь анализируется в носителе PBS, который имеет ионную силу и pH, очень близкие к крови. В той степени, в которой цельная кровь может быть проанализирована с помощью AF4, этот тест показывает, что это можно сделать; IgG и другие белки были элюированы, и матрица цельной крови не приводила к нарушению разделения по размерам.

Однако за эритроцитами из-за их цвета можно было наблюдать визуально, когда они вводились в канал, и было отмечено, что они прилипают к мембране (см. Дополнительный электронный материал (ESM), рис. S1). После анализа канал промывали (прокачка носителя PBS через канал со скоростью 0,5 мл / мин, отсутствие перетока), и примерно через 1 ч в канале не было визуально никаких красных следов. Это интерпретируется как то, что либо (а) клетки были вымыты, либо (б) клетки были гемолизированы и, таким образом, потеряли свой цвет (возможно, вымывшиеся фрагменты).Очевидно, что если бы цельная кровь анализировалась рутинно, это потребовало бы исследования и оптимизации типа и химического состава мембраны, состава носителя и протоколов промывки. Кроме того, вызывает беспокойство возможность засорения потоковых линий как в автосамплере, так и в детекторах, хотя во время этих повторных анализов засорения не наблюдалось.

Выводы

Три наиболее распространенных типа образцов крови (сыворотка, плазма и цельная кровь) были успешно разделены по размеру с помощью AF4.Возможность анализировать образцы крови в условиях, близких к естественным (например, ионная сила, pH, отсутствие фильтрации, центрифугирование, добавление органических модификаторов / растворителей или детергентов) открывает возможность для:

1. Профилирование размеров белков крови — исследование различий в распределении крови по размеру между образцами и изменений во времени

2. Исследования терапевтических белков (флуоресцентно меченных) в крови.

Обычно изучают терапевтические белки в составе, например, чтобы исследовать, происходит ли агрегация или разложение, обычно как часть контроля качества или во время разработки состава.Однако возможность использования AF4 для разделения по размеру в крови делает возможным изучение агрегации или деградации в среде, в которой должен присутствовать терапевтический белок (т. Е. В крови). В этом исследовании показано, что можно анализировать антитела в плазме крови. Результаты помогут ответить на вопрос о том, что происходит с терапевтическими белками после их введения [29]. В свете этого возможно, что AF4 является единственным доступным в настоящее время методом ex vivo анализа белковых агрегатов (размером <1 мкм), который может вызывать иммуногенность, требуя минимальной предварительной обработки образца.Требования к таким исследованиям состоят в том, чтобы можно было использовать метод селективного обнаружения, такой как флуоресценция (путем введения флуоресцентной метки на интересующее соединение). Масс-спектрометрия - еще один интересный метод, который можно использовать для селективного обнаружения терапевтических белков, разделенных, как описано в этой статье, что не требует флуоресцентного мечения. Флуоресцентное мечение было бы привлекательным, чтобы избежать, поскольку оно вносит изменения в химические свойства белка, которые, в свою очередь, могут повлиять на склонность к образованию агрегатов.

Электронный дополнительный материал

ESM 1 ^{(128K, pdf)}

(PDF 127 kb)

Благодарности

Авторы благодарят Redoxis AB, Лунд, Швеция, за предоставленные образцы плазмы и цельной крови.

Информация о финансировании

Это исследование финансировалось Винновским центром компетенций NextBioForm.

Соблюдение этических стандартов

Конфликт интересов

Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.

Сноски

Электронные дополнительные материалы

Онлайн-версия этой статьи (10.1007 / s00216-018-1127-2) содержит дополнительные материалы, которые доступны авторизованным пользователям.

Ссылки

1. Frokjaer S, Otzen DE. Стабильность белкового лекарственного средства: проблема рецептуры. Nat Rev Drug Disc. 2005. 4 (4): 298–306. DOI: 10,1038 / NRD1695. [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar] 2. Ден Энгельсман Дж., Гаридель П., Смолдерс Р., Колл Х., Смит Б., Бассараб С., Зайдл А., Хайнцл О., Джискут В.Стратегии оценки белковых агрегатов при разработке фармацевтических биотехнологических продуктов. Pharm Res. 2011; 28 (4): 920–933. DOI: 10.1007 / s11095-010-0297-1. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar] 3. Мэннинг Р.Р., Холкомб Р.Э., Уилсон Г.А., Генри К.С., Мэннинг М.С. Обзор методов, ортогональных к SEC для количественного определения и характеристики белковых агрегатов. Biopharm Int. 2014; 27 (12): 32. [Google Scholar] 4. Карпентер Дж. Ф., Рэндольф Т. В., Джискут В., Кроммелин Д. А., Миддо К. Р., Винтер Г. Потенциальное неточное количественное определение и определение размеров белковых агрегатов с помощью эксклюзионной хроматографии: существенная необходимость в использовании ортогональных методов для обеспечения качества терапевтических белковых продуктов.J Pharm Sci. 2010. 99 (5): 2200–2208. DOI: 10.1002 / jps.21989. [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar]

5. USFDA (2014) Руководство по промышленной оценке иммуногенности терапевтических белковых продуктов.

6. Ван В., Сингх С.К., Ли Н., Толер М.Р., Кинг К.Р., Нема С. Иммуногенность белковых агрегатов — проблемы и реальность. Int J Pharm. 2012; 431 (1–2): 1–11. [PubMed] [Google Scholar] 7. Барретт К.Е., Брукс Х., Бойтано С., Бармен С.М. Обзор медицинской физиологии Ганонга. 23. Нью-Йорк: McGraw-Hill Medical; 2010 г.[Google Scholar] 8. Gonzalez-Quintela A, Alende R, Gude F, Campos J, Rey J, Meijide LM, Fernandez-Merino C, Vidal C. Сывороточные уровни иммуноглобулинов (IgG, IgA, IgM) у взрослого населения в целом и их связь с потреблением алкоголя , курение и общие нарушения обмена веществ. Clin Exp Immunol. 2008. 151 (1): 42–50. DOI: 10.1111 / j.1365-2249.2007.03545.x. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar] 9. Pretlow TG, Pretlow TP. Разделение клеток: методы и избранные применения. Кембридж: Academic Pr; 1983 г.[Google Scholar] 10. Питт В.Г., Ализаде М., Хусейни Г.А., Макклеллан Д.С., Бьюкенен К.М., Бледсо К.Г., Робисон Р.А., Бланко Р., Родер Б.Л., Мелвилл М., Хантер А.К. Быстрое отделение бактерий от крови — обзор и перспективы. Biotechnol Prog. 2016; 32 (4): 823–839. DOI: 10.1002 / btpr.2299. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar] 11. Валунд К.Г., Нильссон Л. Flow FFF — основы и ключевые приложения. В: Williams SKR, Caldwell K, редакторы. Полевое фракционирование в биополимерном анализе. Вена: Springer Verlag; 2012 г.С. 1–21. [Google Scholar] 12. Litzén A, Wahlund KG. Расширение и разбавление зон в прямоугольных и трапециевидных асимметричных каналах фракционирования потока. Anal Chem. 1991. 63 (10): 1001–1007. DOI: 10.1021 / ac00010a013. [CrossRef] [Google Scholar] 13. Валунд К.Г., Литцен А. Применение канала фракционирования с асимметричным потоком поля-потока для разделения и характеристики белков, плазмид, фрагментов плазмид, полисахаридов и одноклеточных водорослей. J Chromatogr. 1989. 461: 73–87. DOI: 10.1016 / S0021-9673 (00) 94276-6. [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar] 14. Куреши Р.Н., Кок В.Т. Применение фракционирования потока поля потока для характеристики макромолекул, представляющих биологический интерес: обзор. Anal Bioanal Chem. 2011. 399 (4): 1401–1411. DOI: 10.1007 / s00216-010-4278-3. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar] 15. Rambaldi DC, Reschiglian P, Zattoni A. Фракционирование потока поля-потока: последние тенденции в анализе белков. Anal Bioanal Chem. 2011. 399 (4): 1439–1447. DOI: 10.1007 / s00216-010-4312-5.[PubMed] [CrossRef] [Google Scholar] 16. Нильссон Л. Разделение и характеристика макромолекул пищевых продуктов с использованием фракционирования в полевом потоке: обзор. Пищевой Hydrocoll. 2013; 30 (1): 1–11. DOI: 10.1016 / j.foodhyd.2012.04.007. [CrossRef] [Google Scholar] 17. Чой Дж., Ли С., Линарес-Пастен Дж., Нильссон Л. Исследование олигомеризации глутаматдекарбоксилазы из Lactobacillus brevis с использованием фракционирования поля-потока с асимметричным потоком (AF4) с методами светорассеяния. Anal Bioanal Chem. 2018; 410 (2): 451–458. DOI: 10.1007 / s00216-017-0735-6. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar] 18. Cragnell C, Choi J, Segad M, Lee S, Nilsson L, Skepö M. Бычий β-казеин имеет полидисперсное распределение равновесных мицелл. Пищевой Hydrocoll. 2017; 70: 65–68. DOI: 10.1016 / j.foodhyd.2017.03.021. [CrossRef] [Google Scholar] 19. Сандра К., Ванденхид И., Сандра П. Современные хроматографические и масс-спектрометрические методы для биофармацевтической характеристики белков. J Chromatogr A. 2014; 1335: 81–103. DOI: 10.1016 / j.chroma.2013.11.057. [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar] 20. Шин К., Чой Дж., Чо Дж. Х., Юн М.Ю., Ли С., Чунг Х. Возможность асимметричного фракционирования потока поля-потока как метода обнаружения защитного антигена путем прямого распознавания нанозондов, захваченных мишенью, с увеличенным размером. J Chromatogr A. 2015; 1422: 239–246. DOI: 10.1016 / j.chroma.2015.09.089. [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar] 21. Litzén A, Walter JK, Krischollek H, Wahlund KG. Разделение и количественное определение агрегатов моноклональных антител путем фракционирования по полю с асимметричным потоком и сравнение с гель-проникающей хроматографией.Анальная биохимия. 1993. 212 (2): 469–480. DOI: 10.1006 / abio.1993.1356. [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar] 22. Мадорин М., Ван Хогевест П., Хилфикер Р., Лангвост Б., Кресбах Г.М., Эрат М., Лойенбергер Х. Анализ взаимодействий лекарственное средство / белок плазмы с помощью фракционирования поля-потока с асимметричным потоком. Pharm Res. 1997. 14 (12): 1706–1712. DOI: 10,1023 / А: 1012171511285. [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar] 23. Ли П., Гиддингс Дж. Выделение и измерение коллоидов в плазме человека с помощью мембранно-селективного потокового фракционирования поля-потока: липопротеинов и фармацевтических коллоидов.J Pharm Sci. 1996. 85 (8): 895–898. DOI: 10.1021 / js950335s. [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar] 24. Пак И, Пэнг КДж, Юн Й, Сон Дж.Х., Мун МН. Разделение и селективное обнаружение липопротеиновых частиц у пациентов с ишемической болезнью сердца путем фракционирования с асимметричным потоком на входе фритты. J Chromatogr B Anal Technol Biomed Life Sci. 2002. 780 (2): 415–422. DOI: 10.1016 / S1570-0232 (02) 00630-X. [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar] 25. Дати Ф., Шуман Дж., Томас Л., Агуцци Ф., Бауднер С., Бьенвеню Дж., Блаабьерг О., Блируп-Дженсен С., Карлстром А., Петерсен П. Х., Джонсон А. М., Милфорд-Уорд А., Ричи Р. Ф., Свендсен П. Дж., Уичер Дж.Консенсус группы профессиональных обществ и диагностических компаний по руководящим принципам для промежуточных референсных диапазонов для 14 белков в сыворотке на основе стандартизации справочного материала IFCC / BCR / CAP (CRM 470) Eur J Clin Chem Clin Biochem. 1996. 34 (6): 517–520. [PubMed] [Google Scholar] 26. Аббас А.К., Лихтман А.Х., Побер Я.С. Клеточная и молекулярная иммунология. 4. Филадельфия: W. B. Saunders Co .; 2000. [Google Scholar] 27. Колдуэлл К.Д., Нгуен Т.Т., Майерс М.Н., Гиддингс Дж.С. Наблюдения за аномальным удержанием при фракционировании стерического поля-потока.Sep Sci Technol. 1979; 14 (10): 935–946. DOI: 10.1080 / 014963978103. [CrossRef] [Google Scholar] 28. Уильямс PS, Гиддингс JC. Теория программно-полевого фракционирования потока с поправками на стерические эффекты. Anal Chem. 1994. 66 (23): 4215–4228. DOI: 10.1021 / ac00095a017. [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar] 29. Би Дж. С., Голец Т. Дж., Рагхеб Дж. А. Будущее характеристики белковых частиц и понимание их потенциала для снижения иммуногенности биофармацевтических препаратов: общая точка зрения.J Pharm Sci. 2012. 101 (10): 3580–3585. DOI: 10.1002 / jps.23247. [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar]

Белки и антитела в сыворотке, плазме и цельной крови — определение размера с использованием асимметричного полевого фракционирования потока (AF4)

Anal Bioanal Chem. 2018; 410 (20): 4867–4873.

, ¹ , ² , ¹ , ¹ и ²

Mats Leeman

¹ SOLVE Research & Consultancy AB, Medicon Village, 22381 Lund, Sweden 9022ye 9024i J ² Кафедра пищевых технологий, инженерии и питания, Инженерный факультет, Лундский университет, 22100 Лунд, Швеция

Себастьян Ханссон

¹ SOLVE Research & Consultancy AB, Medicon Village, 22381 Лунд, Швеция

Матильда Улмиус Storm

¹ SOLVE Research & Consultancy AB, Medicon Village, 22381 Лунд, Швеция

Ларс Нильссон

² Кафедра пищевых технологий, инженерии и питания, инженерный факультет, Лундский университет, 22100 Лунд, Швеция

¹ SOLVE Research & Consultancy AB, Medicon Village, 22381 Лунд, Швеция

² Департамент пищевых технологий, Engin eering and Nutrition, Инженерный факультет, Лундский университет, 22100 Лунд, Швеция

Автор, ответственный за переписку.

Поступило 09.03.2018 г .; Пересмотрено 25 апреля 2018 г .; Принято 3 мая 2018 г.

Открытый доступ Эта статья распространяется на условиях Международной лицензии Creative Commons Attribution 4.0 (http://creativecommons.org/licenses/by/4.0/), которая разрешает неограниченное использование, распространение, и воспроизведение на любом носителе при условии, что вы должным образом укажете автора (авторов) и источник, предоставите ссылку на лицензию Creative Commons и укажете, были ли внесены изменения.

Эта статья цитируется в других статьях в PMC.

Abstract

Анализ агрегатов терапевтических белков имеет решающее значение для обеспечения эффективности и безопасности пациентов. Обычно анализ выполняется в готовой рецептуре, чтобы убедиться в отсутствии агрегатов. Однако важный вопрос заключается в том, что происходит с терапевтическими белками в отношении олигомеризации и агрегации после их введения (т.е. в кровь). В этой статье показано разделение цельной крови, плазмы и сыворотки с использованием асимметричного фракционирования потока поля-потока (AF4) с минимальной предварительной обработкой образца.Кроме того, продемонстрированы анализ и характеристика размера флуоресцентного антитела в плазме крови с использованием AF4. Результаты показывают пригодность и эффективность AF4 для анализа крови и открывают новые важные пути анализа и характеристики терапевтических белков в крови.

Электронные дополнительные материалы

Онлайн-версия этой статьи (10.1007 / s00216-018-1127-2) содержит дополнительные материалы, которые доступны авторизованным пользователям.

Ключевые слова: Цельная кровь, антитела, плазма, сыворотка, фракционирование по полю асимметричного потока (AF4), флуоресцентная маркировка

Введение

Белковые препараты являются быстрорастущим сектором фармацевтической промышленности и в настоящее время используются при лечении множества заболеваний.Терапевтические белки сложны в отношении их большого молекулярного размера (сравните с низкомолекулярными лекарствами) и их вторичных и третичных структур, которые необходимо поддерживать для эффективного функционирования в качестве молекул лекарства. Эти внутренние свойства белков, вместе со стрессом окружающей среды, являются одной из причин, по которым белки склонны к агрегации при фармацевтической обработке, приготовлении и хранении. Образование белковых агрегатов может привести к снижению эффективности и / или иммуногенности лекарственного средства, что ставит под угрозу безопасность пациента [1].Следовательно, контроль и устранение белковых агрегатов является важной частью рецептуры белковых продуктов.

Анализ белковых агрегатов может быть сложной задачей из-за широкого диапазона размеров — от небольших олигомеров до крупных невидимых частиц или даже видимых преципитатов [2]. Основным методом определения размера и количества невидимых агрегатов является эксклюзионная хроматография (SEC) в сочетании с подходящими детекторами. Однако в последние годы SEC, хотя и хорошо известна, подвергается сомнению, поскольку может давать ошибочные оценки совокупных уровней [3–5].Регулирующие органы, такие как Управление по санитарному надзору за качеством пищевых продуктов и медикаментов (FDA) США, теперь рекомендуют использовать несколько дополнительных ортогональных методов для проверки измерений. Анализ белковых агрегатов в готовом препарате важен, но еще более важным является понимание потенциала агрегации после введения, включая взаимодействие с компонентами крови [6]. Анализ образования агрегатов терапевтических белков после введения лекарственного средства пациенту без вмешательства в извлеченный образец является предметом долгих поисков и может быть достигнут только путем анализа крови in vivo или ex vivo.

Плазма крови — это богатый белком раствор, в котором взвешены белые и красные кровяные тельца, а также тромбоциты, а сыворотка представляет собой жидкость, оставшуюся после удаления сгустка из цельной крови, в основном с таким же составом, что и плазма, за исключением что фибриногены и факторы свертывания отсутствуют. Концентрация белка в плазме / сыворотке составляет примерно 60–80 мг / мл, из которых около 50–60% составляют альбумины и 40% глобулины (10–20% иммуноглобулин G, IgG) [7, 8]. Распределение компонентов крови по размеру колеблется от небольших молекул и ионов (<1 нм) до примерно 15 мкм для лейкоцитов.Из-за сложной природы и большого диапазона размеров компонентов крови такие пробы трудно анализировать, и обычно требуется обширная предварительная обработка проб. Типичные этапы подготовки проб включают центрифугирование, экстракцию и фильтрацию [9, 10]. Однако эта предварительная обработка может вызвать непреднамеренные артефакты, такие как нежелательная потеря компонентов, загрязнение и агрегация белков. Следовательно, очень желательно иметь возможность анализировать и характеризовать белки в крови с минимизацией изменения условий, т.е.е. поддержание физиологического pH и солености и отказ от поверхностно-активных веществ и органических растворителей.

В отраслевом руководстве FDA по агрегированному анализу не рекомендуется использовать какой-либо конкретный аналитический метод [5]. Тем не менее, требуется тщательная оценка с использованием квалифицированных методов для исключения присутствия агрегатов, и один из упомянутых методов — это асимметричное фракционирование потока поля-потока (AF4). AF4 — это метод, в котором разделение достигается приложением внешнего поля (поперечного потока) в ленточном открытом канале без неподвижной фазы [11–13].Из-за отсутствия стационарной фазы устраняются некоторые проблемы, связанные с SEC, включая минимизацию неспецифической адсорбции белка, структурную деформацию на поверхности и высокие силы сдвига, которые могут привести к деградации аналитов. Следовательно, AF4 — это очень мощный метод, который все чаще используется для разделения и характеристики биомакромолекул и фармацевтических молекул [14–16]. Было доказано, что это потенциальный инструмент для изучения биологических структур, таких как белки, антигены и антитела [17–21].В предыдущих исследованиях фракционирование в полевом потоке (FFF) использовалось для разделения и характеристики плазмы крови и липопротеинов [22–24]. Ли и др. изучили возможность разделения липопротеинов в плазме крови с помощью симметричного потока FFF, Mädorin et al. основное внимание уделялось взаимодействию между лекарственным средством с низкой молекулярной массой и плазмой и количественному анализу по выделению лекарственного средства после фракционирования с помощью AF4, а также исследованию Park et al. Исследование было сосредоточено на сравнении белков плазмы (липопротеинов и альбумина) у пациентов и здоровых людей, использующих AF4 на входе фритты.Однако во всех случаях образцы плазмы готовились некоторыми методами подготовки (центрифугирование и добавление добавок).

Целью данного исследования является изучение возможности использования AF4 для разделения белков и других компонентов в сыворотке и плазме с высоким разрешением, а также для разделения цельной крови без предварительной обработки образца, такой как центрифугирование и фильтрация. Кроме того, мы исследуем возможность выборочного разделения и обнаружения флуоресцентных антител в матрице.

Материалы и методы

Материалы

Все соли, использованные для приготовления носителя (хлорид натрия, динатрийфосфат, фосфат калия, фосфат калия, хлорид калия и азид натрия), были аналитической степени чистоты (Sigma-Aldrich, St Louis, MS, США). Воду очищали на установке Millipore Plus (Merck Millipore, Дармштадт, Германия). Контрольные образцы миоглобина, бычьего сывороточного альбумина и иммуноглобулина G были получены от Sigma-Aldrich. Сыворотка человека (номер для заказа h5522) была получена от Sigma-Aldrich.Плазма была крысиной, а цельная — мышиной (любезно предоставлена ​​Redoxis AB, Лунд, Швеция). Козье антитело против человеческого IgG, меченное FITC (флуоресцеинизотиоцианат), было получено от Capra Science Antibodies, Ängelholm, Швеция. Нагрузка FITC была оценена как 6,2 / антитело.

Метод

Анализ фракционирования асимметричного потока поля-потока (AF4) был выполнен на Eclipse II (Wyatt Technology, Dernbach, Германия) в сочетании с LC-системой серии 1100, состоящей из вакуумного дегазатора ERC-3415 (ERC). ), насос G1311A, автоматический пробоотборник G1329A, детектор с диодной матрицей U V / VIS G1315A и детектор флуоресценции G1321C (Agilent Technologies, Санта-Клара, Калифорния, США).Детектор многоуглового рассеяния света (MALS) Dawn Heleos II и детектор дифференциального показателя преломления (dRI) Optilab t-Rex были подключены к сети (технология Wyatt) после канала. УФ-детектор контролировался на 250 и 280 нм, флуоресцентный детектор был настроен на длину волны возбуждения 495 нм и контролировал излучение на 525 нм, а MALS использовал лазер с длиной волны 658 нм и измерял рассеянный свет с помощью 17 детекторов в водный жидкий носитель. Детектор dRI работал на длине волны 658 нм.

Сбор данных производился с помощью Astra 6.2 (технология Wyatt). Асимметричный канал разделения потока и поля потока представлял собой канал Wyatt SC, снабженный прокладкой шириной 350 мкм. Для анализа использовали мембрану из регенерированной целлюлозы (RC) 10 или 100 кДа (Merck Millipore). Носитель представлял собой забуференный фосфатом физиологический раствор (PBS), pH 7,4, с 3 мМ азида натрия (добавленный для предотвращения микробной активности). Фракционирование проводили при температуре окружающей среды (приблизительно 22 ° C), и все эксперименты повторяли не менее двух раз для воспроизводимости.

Тестирование производительности разделения AF4, а также проверка обнаружения MALS-RI и определения молярной массы проводились путем анализа растворов миоглобина, бычьего сывороточного альбумина и иммуноглобулина G. Для оценки данных MALS использовался метод Zimm и dRI с приращением показателя преломления dn / dc 0,185 мл / г для определения концентрации для получения молекулярной массы (MW). В методе разделения AF4 используется скорость потока детектора 0,50 мл / мин, что дает давление в системе приблизительно 3-4 бара в зависимости от конфигурации детектора.Перед началом закачки системе давали возможность стабилизировать перетоки и давления в течение 2 минут. Скорость впрыска составляла 0,2 мл / мин, время впрыска 1 мин, время фокусировки 2 мин; поперечный поток во время инъекции и фокусировки был таким же, как и во время элюирования (2,0 мл / мин). Во время элюирования скорость поперечного потока, Q _c , составляла 2,0 мл / мин, которая поддерживалась постоянной в течение 4 минут после начала элюирования, после чего уменьшалась в соответствии с уравнением. 1

, где Q _{c , 0} — объемная скорость перетока в начале распада, t — время и t _½ — скорость распада (4 мин в настоящем исследовании).Когда скорость поперечного потока достигла 0,15 мл / мин, она оставалась постоянной до конца разделения.

Объем инъекции для всех тестов составлял 10 мкл. И сыворотка крови, и плазма крови, и цельная кровь были разбавлены в 100 раз носителем (PBS) перед инъекцией в канал AF4 и разделением по размеру. Предполагая, что содержание белка в сыворотке или плазме составляет примерно 70 мг / мл, это дает, что концентрация белка в образце, поступающем в канал, составляет примерно 700 мкг / мл, а нагрузка образца на канал AF4 составляет примерно 7 мкг.Для тестов с цельной кровью использовалась мембрана с отсечкой молекулярной массы 100 кДа (MWCO) для снижения белковой нагрузки на канал путем удаления белков с более низкой молекулярной массой (таких как сывороточный альбумин), которые могут выходить из канала разделения по размеру через мембрана.

Результаты и обсуждение

Анализ сыворотки крови

Сыворотка крови была разбавлена ​​в 100 раз фосфатно-солевым буфером (PBS) (10 мкл сыворотки, к которой было добавлено 990 мкл PBS) перед разделением AF4. Разбавление было сделано для того, чтобы снизить вязкость раствора.Время элюирования сывороточного компонента сравнивали со временем элюирования, полученным при анализе белков миоглобина, бычьего сывороточного альбумина и иммуноглобулина G с использованием идентичных условий AF4 (фиг.).

AF4-UV-MALS-dRI фрактограммы и молекулярный вес. Ультрафиолетовая кривая при 250 нм (зеленый), кривая dRI (синяя) и LS при кривой 90 ° (красная). а Анализ сыворотки крови. Объем инъекции составлял 10 мкл образца сыворотки, разведенного в 100 раз, т.е. соответствовал 0,1 мкл сыворотки. б Анализ плазмы.Объем инъекции составлял 10 мкл образца плазмы, разбавленной в 100 раз, т.е. соответствовал 0,1 мкл плазмы. c Анализ миоглобина 17 кДа (красный график), 67 кДа бычьего сывороточного альбумина (синий график) и ~ 150 кДа иммуноглобулина G (зеленый график). Образцы BSA и IgG содержат димеры

Образец сыворотки показывает широкое и многомодальное распределение по размерам, обнаруженное детекторами УФ, MALS и dRI. Пик с максимумом на 4,8 мин в образце сыворотки на рис. А хорошо соответствует времени элюирования пика мономера бычьего сывороточного альбумина на рис.c (по размеру похож на сывороточный альбумин человека), а пик на 6,8 мин хорошо соответствует времени элюирования, полученному при анализе иммуноглобулина G (пик мономера на рис. c). Кроме того, данные по молярной массе из MALS дают молярную массу на вершинах пиков как 70 кДа (при 4,8 мин) и 158 кДа (при 6,8 мин). Предполагается, что двумя наиболее распространенными белками в сыворотке крови будут сывороточный альбумин и IgG (на основе литературных значений [7], часто приводимых как приблизительно 40 и 10 мг / мл, соответственно). Из этих сравнений и на основании данных о молекулярной массе мы заключаем, что с очень высокой вероятностью компонент элюируется при 4.8 мин — это в основном сывороточный альбумин, а компоненты, элюирующие около 6,8 мин, — в основном IgG.

Очевидно, учитывая огромное количество различных белков, которые, как ожидается, должны присутствовать в сыворотке крови, можно ожидать, что большое количество (аналогичного размера) белков и других компонентов сыворотки элюируется совместно с сывороточным альбумином и IgG. . Однако сывороточный альбумин и IgG являются наиболее распространенными белками и классами белков, которые можно ожидать в крови, и, вероятно, они вносят наибольший вклад в обнаруженные пики.

Идентичность компонентов сыворотки, элюированных после IgG (8–11 мин на рис. A), неизвестна, но известно, что сыворотка содержит белки больше, чем IgG, такие как альфа-2-макроглобулин (720 кДа, ~ 3 мг / мл в сыворотка) и IgM (950 кДа, ~ 1 мг / мл в сыворотке) [25]. Кроме того, существует вероятность того, что некоторые из обнаруженных компонентов представляют собой более мелкие белки, которые агрегированы или связаны с другими белками, что делает их размер больше (тем самым элюируя позже), чем у отдельного мономерного белка.

Анализ плазмы крови

Плазма крови анализировалась с использованием тех же настроек, что и для сыворотки крови. Профиль элюции (рис. B) аналогичен профилю, полученному для сыворотки крови с компонентами, обнаруженными при таком же времени элюирования, как сывороточный альбумин и иммуноглобулин G. Наиболее заметное различие между профилем элюции сыворотки и плазмы состоит в том, что имеется большее количество компонентов. элюируется в интервале времени элюирования от 3 до 6 мин (более высокая интенсивность пика при 4–6 мин в образце плазмы) на рис.б. Можно предположить, что это может быть связано с фибриногеном (белок 340 кДа), который, как ожидается, должен присутствовать в плазме, но не должен присутствовать в сыворотке (удаляется центрифугированием после свертывания крови). Эти результаты показывают более высокое разрешение разделения плазмы крови с помощью методов FFF и более чувствительное обнаружение, чем результаты предыдущих исследований [22–24].

Флуоресцентно меченые антитела в PBS и плазме

И сыворотка, и плазма содержат широкий спектр антител (по оценкам,> 10 ⁷ различных антител [26].Иммуноглобулин G подразделяется на четыре класса (IgG1 – IgG4), каждый из которых, в свою очередь, состоит из огромного набора антител, часто очень незначительно различающихся по размеру и молярной массе. Разделить их физически по размеру невозможно с помощью AF4 из-за недостаточного разрешения. Таким образом, антитела, элюируемые из AF4, будут элюироваться как смесь многих антител. Следовательно, чтобы иметь возможность обнаруживать и контролировать один конкретный тип антител, необходимо избирательное обнаружение. Обнаружение флуоресценции может предложить такое избирательное обнаружение, если интересующее антитело флуоресцентно помечено.Чтобы исследовать, можно ли контролировать флуоресцентно меченые антитела в плазме крови, использовали козьи антитела типа IgG, которые были помечены флуоресцентным маркером FITC. Для справки, флуоресцентно меченное антитело анализировали в PBS в концентрации 100 мкг / мл, объем образца 10 мкл, чтобы обеспечить обнаружение УФ, MALS и dRI (рис. А). Меченое антитело элюируется при времени элюирования 6,75 мин, аналогичном времени элюирования IgG в сыворотке и плазме (6,8 мин). Отмечено наличие плеча на пике (8–9 мин), что интерпретируется как обнаружение (не полностью разрешенных) димеров.

AF4-UV-MALS-dRI-FL фрактограммы. Обнаруживается УФ при 250 нм (зеленая кривая), MALS (красная кривая), FL при 495/525 нм (оранжевая кривая) и dRI (синяя кривая). a Анализ флуоресцентно меченых антител в PBS. Объем инъекции составлял 10 мкл раствора 100 мкг / мл (массовая нагрузка = 1 мкг). b Анализ флуоресцентно меченых антител в плазме крови. В плазму добавляли концентрацию 10 мкг флуоресцентно меченного антитела / мл плазмы. Затем добавленную плазму разбавляли в 100 раз носителем PBS перед анализом (объем образца составлял 10 мкл, что соответствует массовой нагрузке 1 нг флуоресцентно меченного антитела на канал). c Анализ флуоресцентно меченых антител в PBS (зеленая кривая) и в плазме крови (красная кривая). В плазму добавляли концентрацию 100 мкг флуоресцентно меченых антител / мл плазмы. Затем добавленную плазму разбавляли в 100 раз носителем PBS перед анализом (объем образца составлял 10 мкл, что соответствует массовой нагрузке 10 нг флуоресцентно меченого антитела на канал)

Флуоресцентно меченное антитело добавляли в плазму до концентрации 10 мкг / мл плазмы и анализировали.Детектор флуоресценции обнаруживает меченый IgG (рис. B), в то время как детекторы УФ, MALS и dRI обнаруживают все другие компоненты плазмы. При повышенной концентрации (10 мкг / мл плазмы) количество меченого IgG в канале составляет 1 нг, что слишком мало для обнаружения детекторами УФ, MALS или dRI.

Более подробное сравнение профиля элюции FICT-меченного IgG в PBS и в плазме показывает, что существуют различия, отслеживаемые детектором флуоресценции (рис. C). Меченный FICT IgG в PBS (зеленые кривые на рис.c) имеет вершину на 6,75 мин и показывает хвост на основном пике (на 8–9 мин), интерпретируемый как димер (как указано выше). Для сравнения, когда FICT-IgG вводится в плазму (красная кривая на рис. C), пик смещается на 6,9 мин. Кроме того, плечо (димер) намного более выражено (более высокая интенсивность), когда образец находится в плазме. Данные получены на одном и том же оборудовании, проанализированы рядом друг с другом, в двух экземплярах, в двух разных случаях, с использованием одних и тех же условий как для плазмы, так и для PBS.Когда Ab-FICT анализируется вместе с компонентами плазмы, становится очевидным, что как сдвиг основного пика, указывающий на то, что он действует так, как он был немного больше во время разделения, так и большее увеличение антитела, имеющего размер, аналогичный димера антитела. Вывод заключается в том, что между компонентами плазмы и FICT-меченным IgG происходит взаимодействие. Для выяснения природы взаимодействия требуются дальнейшие исследования.

Анализ цельной крови

Свежая кровь мыши была получена для исследования способности AF4 разделять даже более сложную матрицу, чем показано выше (т.е., включая клетки крови). Время между взятием пробы у мышей и анализом было коротким (примерно 30 мин), чтобы минимизировать гемолиз. ЭДТА добавляли для предотвращения свертывания крови. Кровь разбавляли в 100 раз носителем (PBS) непосредственно перед анализом, а затем кровь вводили непосредственно в канал AF4. Для этих анализов использовали мембрану 100 кДа для удаления белков с более низкой молекулярной массой из канала, что привело к снижению белковой нагрузки на канал. Обратите внимание, что эти разделения были выполнены на другой мембране, что дало различную толщину каналов и, следовательно, разное время элюирования по сравнению с приведенными выше результатами.

На фрактограмме (рис.) Виден пик (6,0 мин), совпадающий с пиком IgG, и пик 8–10 мин. В отличие от данных по сыворотке и плазме, имеется также большое количество компонентов большего размера, элюируемых в интервале времени от 10 до 20 мин, идентичность которых неизвестна. Сигнал светорассеяния показывает несколько узких пиков с высокой интенсивностью (шум). Предположительно, это происходит из-за элюирования крупных компонентов с очень высокой молекулярной массой или частиц цельной крови, которых относительно мало (например, целых клеток крови или их фрагментов).

Анализ цельной крови с помощью AF4-UV-MALS-dRI. Ультрафиолетовая кривая при 250 нм (зеленый), кривая dRI (синяя) и LS при кривой 90 ° (красная). Объем инъекции составлял 10 мкл образца крови, разбавленного в 100 раз, т.е. соответствует 0,1 мкл цельной крови.

Эритроциты имеют размер примерно 0,5 × 8 мкм и находятся за пределами диапазона броуновского режима AF4 [27, 28]. Поскольку цель анализа не заключалась в разделении этих больших компонентов, не ожидается, что они будут должным образом разделены. Скорее, цель заключалась в том, чтобы проверить, можно ли ввести образец крови с минимальной предварительной обработкой образца и без удаления каких-либо компонентов.Единственное нарушение в крови заключается в добавлении ЭДТА (для предотвращения свертывания крови) и в том, что образец был разбавлен носителем (PBS) перед инъекцией (для снижения вязкости). Фильтрация, центрифугирование или добавление модификаторов растворителей не производились, и кровь анализируется в носителе PBS, который имеет ионную силу и pH, очень близкие к крови. В той степени, в которой цельная кровь может быть проанализирована с помощью AF4, этот тест показывает, что это можно сделать; IgG и другие белки были элюированы, и матрица цельной крови не приводила к нарушению разделения по размерам.

Однако за эритроцитами из-за их цвета можно было наблюдать визуально, когда они вводились в канал, и было отмечено, что они прилипают к мембране (см. Дополнительный электронный материал (ESM), рис. S1). После анализа канал промывали (прокачка носителя PBS через канал со скоростью 0,5 мл / мин, отсутствие перетока), и примерно через 1 ч в канале не было визуально никаких красных следов. Это интерпретируется как то, что либо (а) клетки были вымыты, либо (б) клетки были гемолизированы и, таким образом, потеряли свой цвет (возможно, вымывшиеся фрагменты).Очевидно, что если бы цельная кровь анализировалась рутинно, это потребовало бы исследования и оптимизации типа и химического состава мембраны, состава носителя и протоколов промывки. Кроме того, вызывает беспокойство возможность засорения потоковых линий как в автосамплере, так и в детекторах, хотя во время этих повторных анализов засорения не наблюдалось.

Выводы

Три наиболее распространенных типа образцов крови (сыворотка, плазма и цельная кровь) были успешно разделены по размеру с помощью AF4.Возможность анализировать образцы крови в условиях, близких к естественным (например, ионная сила, pH, отсутствие фильтрации, центрифугирование, добавление органических модификаторов / растворителей или детергентов) открывает возможность для:

1. Профилирование размеров белков крови — исследование различий в распределении крови по размеру между образцами и изменений во времени

2. Исследования терапевтических белков (флуоресцентно меченных) в крови.

Обычно изучают терапевтические белки в составе, например, чтобы исследовать, происходит ли агрегация или разложение, обычно как часть контроля качества или во время разработки состава.Однако возможность использования AF4 для разделения по размеру в крови делает возможным изучение агрегации или деградации в среде, в которой должен присутствовать терапевтический белок (т. Е. В крови). В этом исследовании показано, что можно анализировать антитела в плазме крови. Результаты помогут ответить на вопрос о том, что происходит с терапевтическими белками после их введения [29]. В свете этого возможно, что AF4 является единственным доступным в настоящее время методом ex vivo анализа белковых агрегатов (размером <1 мкм), который может вызывать иммуногенность, требуя минимальной предварительной обработки образца.Требования к таким исследованиям состоят в том, чтобы можно было использовать метод селективного обнаружения, такой как флуоресценция (путем введения флуоресцентной метки на интересующее соединение). Масс-спектрометрия - еще один интересный метод, который можно использовать для селективного обнаружения терапевтических белков, разделенных, как описано в этой статье, что не требует флуоресцентного мечения. Флуоресцентное мечение было бы привлекательным, чтобы избежать, поскольку оно вносит изменения в химические свойства белка, которые, в свою очередь, могут повлиять на склонность к образованию агрегатов.

Электронный дополнительный материал

ESM 1 ^{(128K, pdf)}

(PDF 127 kb)

Благодарности

Авторы благодарят Redoxis AB, Лунд, Швеция, за предоставленные образцы плазмы и цельной крови.

Информация о финансировании

Это исследование финансировалось Винновским центром компетенций NextBioForm.

Соблюдение этических стандартов

Конфликт интересов

Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.

Сноски

Электронные дополнительные материалы

Онлайн-версия этой статьи (10.1007 / s00216-018-1127-2) содержит дополнительные материалы, которые доступны авторизованным пользователям.

Ссылки

1. Frokjaer S, Otzen DE. Стабильность белкового лекарственного средства: проблема рецептуры. Nat Rev Drug Disc. 2005. 4 (4): 298–306. DOI: 10,1038 / NRD1695. [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar] 2. Ден Энгельсман Дж., Гаридель П., Смолдерс Р., Колл Х., Смит Б., Бассараб С., Зайдл А., Хайнцл О., Джискут В.Стратегии оценки белковых агрегатов при разработке фармацевтических биотехнологических продуктов. Pharm Res. 2011; 28 (4): 920–933. DOI: 10.1007 / s11095-010-0297-1. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar] 3. Мэннинг Р.Р., Холкомб Р.Э., Уилсон Г.А., Генри К.С., Мэннинг М.С. Обзор методов, ортогональных к SEC для количественного определения и характеристики белковых агрегатов. Biopharm Int. 2014; 27 (12): 32. [Google Scholar] 4. Карпентер Дж. Ф., Рэндольф Т. В., Джискут В., Кроммелин Д. А., Миддо К. Р., Винтер Г. Потенциальное неточное количественное определение и определение размеров белковых агрегатов с помощью эксклюзионной хроматографии: существенная необходимость в использовании ортогональных методов для обеспечения качества терапевтических белковых продуктов.J Pharm Sci. 2010. 99 (5): 2200–2208. DOI: 10.1002 / jps.21989. [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar]

5. USFDA (2014) Руководство по промышленной оценке иммуногенности терапевтических белковых продуктов.

6. Ван В., Сингх С.К., Ли Н., Толер М.Р., Кинг К.Р., Нема С. Иммуногенность белковых агрегатов — проблемы и реальность. Int J Pharm. 2012; 431 (1–2): 1–11. [PubMed] [Google Scholar] 7. Барретт К.Е., Брукс Х., Бойтано С., Бармен С.М. Обзор медицинской физиологии Ганонга. 23. Нью-Йорк: McGraw-Hill Medical; 2010 г.[Google Scholar] 8. Gonzalez-Quintela A, Alende R, Gude F, Campos J, Rey J, Meijide LM, Fernandez-Merino C, Vidal C. Сывороточные уровни иммуноглобулинов (IgG, IgA, IgM) у взрослого населения в целом и их связь с потреблением алкоголя , курение и общие нарушения обмена веществ. Clin Exp Immunol. 2008. 151 (1): 42–50. DOI: 10.1111 / j.1365-2249.2007.03545.x. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar] 9. Pretlow TG, Pretlow TP. Разделение клеток: методы и избранные применения. Кембридж: Academic Pr; 1983 г.[Google Scholar] 10. Питт В.Г., Ализаде М., Хусейни Г.А., Макклеллан Д.С., Бьюкенен К.М., Бледсо К.Г., Робисон Р.А., Бланко Р., Родер Б.Л., Мелвилл М., Хантер А.К. Быстрое отделение бактерий от крови — обзор и перспективы. Biotechnol Prog. 2016; 32 (4): 823–839. DOI: 10.1002 / btpr.2299. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar] 11. Валунд К.Г., Нильссон Л. Flow FFF — основы и ключевые приложения. В: Williams SKR, Caldwell K, редакторы. Полевое фракционирование в биополимерном анализе. Вена: Springer Verlag; 2012 г.С. 1–21. [Google Scholar] 12. Litzén A, Wahlund KG. Расширение и разбавление зон в прямоугольных и трапециевидных асимметричных каналах фракционирования потока. Anal Chem. 1991. 63 (10): 1001–1007. DOI: 10.1021 / ac00010a013. [CrossRef] [Google Scholar] 13. Валунд К.Г., Литцен А. Применение канала фракционирования с асимметричным потоком поля-потока для разделения и характеристики белков, плазмид, фрагментов плазмид, полисахаридов и одноклеточных водорослей. J Chromatogr. 1989. 461: 73–87. DOI: 10.1016 / S0021-9673 (00) 94276-6. [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar] 14. Куреши Р.Н., Кок В.Т. Применение фракционирования потока поля потока для характеристики макромолекул, представляющих биологический интерес: обзор. Anal Bioanal Chem. 2011. 399 (4): 1401–1411. DOI: 10.1007 / s00216-010-4278-3. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar] 15. Rambaldi DC, Reschiglian P, Zattoni A. Фракционирование потока поля-потока: последние тенденции в анализе белков. Anal Bioanal Chem. 2011. 399 (4): 1439–1447. DOI: 10.1007 / s00216-010-4312-5.[PubMed] [CrossRef] [Google Scholar] 16. Нильссон Л. Разделение и характеристика макромолекул пищевых продуктов с использованием фракционирования в полевом потоке: обзор. Пищевой Hydrocoll. 2013; 30 (1): 1–11. DOI: 10.1016 / j.foodhyd.2012.04.007. [CrossRef] [Google Scholar] 17. Чой Дж., Ли С., Линарес-Пастен Дж., Нильссон Л. Исследование олигомеризации глутаматдекарбоксилазы из Lactobacillus brevis с использованием фракционирования поля-потока с асимметричным потоком (AF4) с методами светорассеяния. Anal Bioanal Chem. 2018; 410 (2): 451–458. DOI: 10.1007 / s00216-017-0735-6. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar] 18. Cragnell C, Choi J, Segad M, Lee S, Nilsson L, Skepö M. Бычий β-казеин имеет полидисперсное распределение равновесных мицелл. Пищевой Hydrocoll. 2017; 70: 65–68. DOI: 10.1016 / j.foodhyd.2017.03.021. [CrossRef] [Google Scholar] 19. Сандра К., Ванденхид И., Сандра П. Современные хроматографические и масс-спектрометрические методы для биофармацевтической характеристики белков. J Chromatogr A. 2014; 1335: 81–103. DOI: 10.1016 / j.chroma.2013.11.057. [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar] 20. Шин К., Чой Дж., Чо Дж. Х., Юн М.Ю., Ли С., Чунг Х. Возможность асимметричного фракционирования потока поля-потока как метода обнаружения защитного антигена путем прямого распознавания нанозондов, захваченных мишенью, с увеличенным размером. J Chromatogr A. 2015; 1422: 239–246. DOI: 10.1016 / j.chroma.2015.09.089. [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar] 21. Litzén A, Walter JK, Krischollek H, Wahlund KG. Разделение и количественное определение агрегатов моноклональных антител путем фракционирования по полю с асимметричным потоком и сравнение с гель-проникающей хроматографией.Анальная биохимия. 1993. 212 (2): 469–480. DOI: 10.1006 / abio.1993.1356. [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar] 22. Мадорин М., Ван Хогевест П., Хилфикер Р., Лангвост Б., Кресбах Г.М., Эрат М., Лойенбергер Х. Анализ взаимодействий лекарственное средство / белок плазмы с помощью фракционирования поля-потока с асимметричным потоком. Pharm Res. 1997. 14 (12): 1706–1712. DOI: 10,1023 / А: 1012171511285. [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar] 23. Ли П., Гиддингс Дж. Выделение и измерение коллоидов в плазме человека с помощью мембранно-селективного потокового фракционирования поля-потока: липопротеинов и фармацевтических коллоидов.J Pharm Sci. 1996. 85 (8): 895–898. DOI: 10.1021 / js950335s. [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar] 24. Пак И, Пэнг КДж, Юн Й, Сон Дж.Х., Мун МН. Разделение и селективное обнаружение липопротеиновых частиц у пациентов с ишемической болезнью сердца путем фракционирования с асимметричным потоком на входе фритты. J Chromatogr B Anal Technol Biomed Life Sci. 2002. 780 (2): 415–422. DOI: 10.1016 / S1570-0232 (02) 00630-X. [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar] 25. Дати Ф., Шуман Дж., Томас Л., Агуцци Ф., Бауднер С., Бьенвеню Дж., Блаабьерг О., Блируп-Дженсен С., Карлстром А., Петерсен П. Х., Джонсон А. М., Милфорд-Уорд А., Ричи Р. Ф., Свендсен П. Дж., Уичер Дж.Консенсус группы профессиональных обществ и диагностических компаний по руководящим принципам для промежуточных референсных диапазонов для 14 белков в сыворотке на основе стандартизации справочного материала IFCC / BCR / CAP (CRM 470) Eur J Clin Chem Clin Biochem. 1996. 34 (6): 517–520. [PubMed] [Google Scholar] 26. Аббас А.К., Лихтман А.Х., Побер Я.С. Клеточная и молекулярная иммунология. 4. Филадельфия: W. B. Saunders Co .; 2000. [Google Scholar] 27. Колдуэлл К.Д., Нгуен Т.Т., Майерс М.Н., Гиддингс Дж.С. Наблюдения за аномальным удержанием при фракционировании стерического поля-потока.Sep Sci Technol. 1979; 14 (10): 935–946. DOI: 10.1080 / 014963978103. [CrossRef] [Google Scholar] 28. Уильямс PS, Гиддингс JC. Теория программно-полевого фракционирования потока с поправками на стерические эффекты. Anal Chem. 1994. 66 (23): 4215–4228. DOI: 10.1021 / ac00095a017. [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar] 29. Би Дж. С., Голец Т. Дж., Рагхеб Дж. А. Будущее характеристики белковых частиц и понимание их потенциала для снижения иммуногенности биофармацевтических препаратов: общая точка зрения.J Pharm Sci. 2012. 101 (10): 3580–3585. DOI: 10.1002 / jps.23247. [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar]

Сыворотка человека и ее важная роль в исследованиях

Сыворотка человека и ее важная роль в исследованиях

15 апреля 2019

Человеческая сыворотка — один из важнейших инструментов в современных лабораториях, и не зря — человеческая сыворотка позволяет ученым выращивать человеческие клетки, проверять эффективность лекарств, глубже понимать иммунную систему и проводить инновационные исследования.Хотя обработка человеческой сыворотки для использования в исследованиях сложна, в результате получается продукт, который обеспечивает надежные и повторяемые результаты в лаборатории.

Человеческая кровь содержит более 4000 компонентов, каждый из которых имеет свое назначение. Основными компонентами цельной крови являются эритроциты, лейкоциты, плазма и тромбоциты. Человеческая кровь на 55 процентов состоит из плазмы и на 45 процентов состоит из клеток. Красные кровяные тельца переносят кислород, а белые кровяные тельца борются с инфекцией. Плазма — это водянистая прозрачная жидкость желтого цвета, в которой находятся клетки и тромбоциты, а также сахара, липиды, витамины, минералы, гормоны, ферменты, антитела, другие белки и факторы свертывания крови.

После осторожного взятия крови у доноров, чтобы не повредить клетки крови, специалисты лаборатории используют центрифугу для отделения клеток от плазмы. Лаборатории могут дополнительно отделить сыворотку от плазмы. Плазма и сыворотка человека похожи, за исключением наличия факторов свертывания крови. Эти факторы свертывания, особенно фибриноген, необходимы для свертывания. Когда лаборатории отделяют человеческую сыворотку и плазму от цельной крови, плазма удерживает фибриноген, а сыворотка — нет.Это означает, что человеческая сыворотка не свертывается и не свертывается, потому что она не содержит фиброгена фактора свертывания крови.

Хотя человеческая сыворотка не содержит фибриногена, она содержит гормоны, минералы, белки и углекислый газ. Альбумин — важный белок в сыворотке крови человека, поскольку он переносит стероиды, жирные кислоты и гормоны щитовидной железы в кровь. Сыворотка человека также является важным источником электролитов.

Сыворотка человека позволяет веществам прилипать к молекулам в сыворотке, эффективно связывая вещество с кровью, что позволяет сыворотке транспортировать жирные кислоты, гормоны щитовидной железы и другие вещества.Поскольку он работает как циркулирующий носитель, производители лекарств создают белковые препараты, которые связываются с альбумином

Производители лекарств используют функцию альбумина в качестве носителя, создавая белковые лекарства, которые связываются с альбумином — затем альбумин переносит лекарства через кровоток в ткань или орган-мишень. Альбумин в сыворотке крови человека связывается с излечиваемыми веществами в антибиотиках, например, что позволяет антибиотикам переноситься по всему телу.

Области применения человеческой сыворотки

Исследователи используют человеческую сыворотку там, где сыворотка животного не является подходящей заменой, например, в исследованиях ДНК, исследованиях терапии рака и т. Д. Ученые часто используют человеческую сыворотку в качестве добавки к питательной среде, поскольку для удовлетворительного роста многим человеческим клеткам требуется человеческая сыворотка, а не животная.

Сыворотка человека обеспечивает превосходные результаты при культивировании многих типов клеток человека, но особенно клеток, связанных с иммунной системой человека.Исследователи используют человеческую сыворотку в качестве дополнения к питательной среде для лимфоцитов, которая поддерживает рост человеческих лимфоцитов и дендритных клеток, играющих важную роль в иммунитете. Они используют человеческую сыворотку в процедурах иммуногистохимического окрашивания — процесса, который идентифицирует чужеродные антигены, вызывающие иммунный ответ. Ученые также используют человеческую сыворотку в приложениях для тканевого типирования человеческого лейкоцитарного антигена (HLA), которые проверяют совместимость между донором и реципиентом при трансплантации органов.

Сыворотка вне сгустка крови человека идеальна для метаболических исследований.Чтобы собрать человеческую сыворотку вне сгустка, лаборатории позволяют цельной крови свертываться естественным путем и без воздействия антикоагулянтов после сбора. Затем лаборатория использует центрифугу для отделения сыворотки от клеточных компонентов, прежде чем сыворотка подвергнется вторичному свертыванию. Повторное свертывание сыворотки обеспечивает полное удаление всех оставшихся компонентов свертывания. Затем лаборатории снова центрифугируют образец перед тем, как удалить оставшуюся сыворотку и упаковать ее в соответствии с требованиями исследователей.

Человеческая сыворотка AB имеет важное значение для исследований применения клеточной терапии, трансплантации и тканевой инженерии. Лаборатории собирают человеческую сыворотку AB от доноров, у которых кровь типа AB, в которой отсутствуют антитела против антигенов группы A и B.

Сыворотка комплемента человека предназначена только для исследований in vitro и исследований биосовместимости. Сыворотка комплемента человека представляет собой сложную смесь белков сыворотки, активируемую, когда антитела у иммунного субъекта взаимодействуют с соответствующими антигенами.

Сыворотка человека позволяет ученым проводить инновационные исследования в лабораториях и открывать новые лекарства, методы лечения и процедуры для улучшения здоровья человека. Для получения дополнительной информации о человеческой сыворотке обратитесь в службу BioChemed Services.

Тепловая инактивация сыворотки влияет на состав короны белка и поглощение наночастиц

В последние несколько лет возникли поразительные новые парадигмы бионанологии и наномедицины. Мы начинаем понимать, насколько взаимодействия между наноразмерными объектами и живыми организмами отличаются от более традиционных взаимодействий молекула-организм.Например, на уровне клетки и ткани механизмы эндогенного переноса обрабатывают объекты нанометрового размера, что приводит к энергозависимому перемещению в клетку. Этому следует противопоставить чисто физическую кинетику (диффузию), в которой преобладает равновесие, применимое к молекулярным видам, таким как низкомолекулярные лекарственные средства.

Дополнительным элементом в этой недавно появившейся истории является растущее осознание того, что «поверхность» наночастиц, как в чистом виде, так и с различными поверхностными трансплантатами, сильно модифицируется окружающей средой, в которой она применяется или вводится.Например, в плазме для большинства материалов, специально не разработанных для того, чтобы этого избежать, номинальная поверхность наночастиц модифицируется белковой (и липидной) «короной», которая полностью покрывает поверхность, скрывая свойства материала без покрытия [1], [2] , [3], [4]. Хотя в первые несколько часов после контакта с биологической средой происходят некоторые перегруппировки белков с наивысшим сродством связываться с поверхностью частицы, время обмена коронным разрядом настолько велико (обычно много часов), что клетка вряд ли сможет «увидеть» чистые свойства материала для многих острых ударов или других более краткосрочных биологических процессов [5], [6], [7].Последствия этого глубоки, поскольку это предполагает, что невозможно полностью оценить биологические последствия взаимодействия наночастица-клетка (барьер, орган или другое) в отсутствие контекста или биологической среды. Это, естественно, будет иметь значение, например, при сравнении исследований in vitro, и in vivo, , поскольку в in vitro биологических исследованиях обычно используются низкие количества (разведение 10% или меньше, в зависимости от типа клеток) животного происхождения. сыворотка вместо полной плазмы, которая присутствует в исследованиях in vivo , и, таким образом, короны наночастиц образуются при очень разных соотношениях белка и наночастиц в условиях in vitro и in vivo .Насколько исследования in vitro, информативны относительно результатов in vivo, требуют дальнейшего рассмотрения и интерпретации. Помимо этого, существует довольно серьезная проблема (отсутствия) воспроизводимости наблюдаемых результатов. Рассмотрим даже простейший пример (внутриклеточной) дозы в токсикологическом исследовании in vitro . Здесь можно увидеть, что если разные условия сыворотки или сыворотки применяются между исследователями (инактивированная теплом сыворотка или нет, но также потенциально разные партии сыворотки), может возникнуть очевидная невоспроизводимость с точки зрения природы короны белка и стабильности дисперсии наночастиц [ 2], [5].

Мы рассмотрим интересное (и весьма применимое) проявление этого явления. Тепловая инактивация — это процедура, обычно применяемая в культуре клеток, которая разрушает активность комплемента в сыворотке — некоторые клетки могут быть чувствительны к присутствию комплемента [8], хотя не все типы клеток требуют тепловой инактивации сыворотки [9]. Конечно, тепловая инактивация сыворотки, если ее не контролировать и не проводить должным образом, может изменить качество самой сыворотки, таким образом влияя на рост клеток, разрушая желаемые активные компоненты или создавая преципитаты в среде для культивирования клеток [10], [11].Температуру и продолжительность процедуры необходимо надлежащим образом контролировать, без чего в конечную белковую композицию можно внести значительные изменения. Более того, сообщалось об агрегации иммуноглобулинов как следствие процедуры нагревания, и это может повлиять на последующие иммунологические тесты [11].

Если комплемент удаляется должным образом, естественно спросить, затронута ли корона белка на наночастицах, и имеет ли это какое-либо значение для интернализации наночастиц (или действительно для функциональных воздействий).Фактически рецепторы комплемента активируют несколько путей захвата [12], [13], и это может повлиять на захват наночастиц, даже in vitro, , в то время как in vivo, адсорбция белков комплемента и иммуноглобулинов из сыворотки на поверхность наночастиц может активировать дополняют и потенциально вызывают удаление наночастиц макрофагами классическими и / или альтернативными путями. Уже опубликовано несколько работ, в которых исследовалось влияние активации комплемента на удаление чужеродных наночастиц фагоцитарными клетками [14], [15], [16].В других примерах обсуждается роль специфических рецепторов, участвующих в удалении частиц, таких как рецепторы скавенджеров, которые также связаны с фагоцитарной активностью и белками комплемента [17]. В частности, было продемонстрировано, что рецепторы поглотителей участвуют в фагоцитозе наночастиц кремнезема, а также в удалении наночастиц полистирола макрофагами [18], [19], [20]. В других случаях активность комплемента также была связана с фагоцитарной активностью неспециализированных клеток, таких как эпителий легких [13].

Очевидно, что для тех типов клеток, которые чувствительны к комплементу, эффект наночастицы комплемента-короны может быть довольно сложным, и его трудно отделить от других механизмов поглощения. Однако, например, клетки A549, используемые в этом исследовании, относительно нечувствительны к присутствию белков комплемента и регулярно растут в сыворотках обоих типов, и как таковые представляют собой хорошую модель для выяснения влияния белков комплемента на поглощение наночастиц.