Лакто бифидобактерии: Лакто- и бифидобактерии. Что искать в составе полезных йогуртов?

Оба эти рода являются грамположительными (что просто означает, что они имеют толстую клеточную стенку, состоящую из пептидогликана) и являются частью групп, продуцирующих молочную кислоту, и признаны безопасными в качестве пробиотических добавок. ^{2 3} Исследование, состоящее из двух частей, показало, что риск бактериемии, связанной с пробиотиками (по сути, состояния, при котором бактерии попадают в места, в которых они не должны находиться, например, кровь), был всего 0.2%, в то время как исследование, охватывающее семь лет, не показало бактериемии, когда пациенты получали комбинацию пробиотиков. ^{4 5} Это первый пункт, который советует в пользу объединения нескольких штаммов пробиотиков, комбинации не позволяют одному штамму стать доминирующим и захватить.

Bifidobacterium vs Lactobacillus

Здесь важно отметить, что хотя эти Bifidobacterium и Lactobacillus составляют большую часть целого, наши микробиомы состоят примерно из тысячи различных видов.Хотя настоящего рецепта «здорового» микробиома не существует, мы знаем, что баланс — это ключ к счастливому и здоровому кишечнику. ⁶

Имея это в виду, каковы соответствующие преимущества этих типов бактерий?

Преимущества

Во-первых, чтобы перейти к некоторым основам: Bifidobacterium — это род царства бактерий, обитающих в желудочно-кишечном тракте, влагалище и ротовой полости млекопитающих. Они грамположительны, используют глюкозу в качестве топлива вместо кислорода (анаэробные) и обычно имеют разветвленную форму. Bifidobacterium составляет 25% фекальных бактерий взрослых и 80% младенцев, что является феноменально большим числом.

Что отличает этот род от других бактерий, так это особый путь, который позволяет ему сбраживать углеводы. Это полезно для нас, потому что растительные и молочные углеводы в своей естественной форме не перевариваются. Ферментация превращает эти углеводы в жирные кислоты с короткой цепью (SCFA), которые являются основным источником энергии для наших кишечных клеток. ^{7 8}

Мы также обсуждаем SCFA в нашей недавней публикации: Можете ли вы избежать проблем с кишечником?

Но помимо обеспечения нашего организма столь необходимыми SCFA, Bifidocacterium также защищает нас от инфекций.Например, было показано, что B. Infantis обладает широким спектром антимикробных свойств для подавления роста патогенов, а B. animalis DN-173 010 может прилипать к клеткам кишечника, что препятствует проникновению вирусов или бактерий в наш организм. эпителиальные клетки. ⁹

Было обнаружено, что некоторые виды этого рода помогают стимулировать нашу иммунную систему: B. longum увеличивает иммунологические защитные системы у мышей, свободных от микробов, и B.breve YIT4064 усиливает IgA-антитела, которые являются антиген-специфическими для ротавируса, основной причины острой детской диареи, у мышей. ⁹ См. Мою предыдущую запись в блоге, чтобы узнать, что это за мыши: как наши кишечные бактерии могут бороться с ростом опухоли.

Преимущества

Lactobacillus подпадает под тип Firmicutes , которые характеризуются своими грамположительными клеточными стенками и являются единственными бактериями, содержащими ферменты PanK-II, которые являются первым ферментом кофермента. Путь A (CoA).Они не образуют споры, имеют форму палочек и используют транспортные функции как средство выживания, так как им сложно синтезировать аминокислоты и другие клеточные строительные блоки. Как и Bifidobacterium , Lactobacillus ферментирует углеводы в SCFAs. Оба рода встречаются в кишечнике и влагалище млекопитающих.

Лактобациллы использовались для производства молочных продуктов, таких как сыр и йогурт, поскольку они обладают высокой толерантностью к условиям низкого pH, что позволяет им перемещаться по желудочно-кишечному тракту и выдерживать резкие изменения pH в кишечной системе.

Обзор рода Lactobacillus , проведенный в лаборатории Дайан М. Цитрон в Калифорнийском университете в Лос-Анджелесе, нашел коммерческое применение для следующих видов этого рода. ¹⁰

Считается, что Lactobacillus acidophilus обладает пробиотическими свойствами. Он используется в коммерческих целях во многих молочных продуктах. Lactobacillus casei, включая штамм Shirota (YIT9029) (Yakult Honsha Co. Ltd Japan), дополняет рост L. acidophilus, продуцента фермента амилазы, переваривающего углеводы.Он участвует в производстве и созревании сыра чеддер и является доминирующим видом натурально ферментированных сицилийских зеленых оливок.

Lactobacillus brevis , L. fermentum и L. parabuchneri — три основных вида облигатных гетероферментов молочных продуктов, которые, присутствуя в сыре во время созревания, могут влиять на вкус и текстуру конечного продукта. L. parabuchneri также используется для производства хлеба на закваске и ферментации овощей.

Lactobacillus bulgaricus используется для производства йогурта. Он также содержится в других естественно ферментированных продуктах и ​​используется для консервирования молока. Он производит бактериоцины, которые могут быть бактерицидными in vitro.

В то время как бактерии Bifidobacterium и Lactobacilli имеют общие метаболические свойства, лактобациллы обладают гораздо более высоким уровнем филогенетического, фенотипического и экологического разнообразия и насчитывают более 170 признанных видов. Такое разнообразие затрудняет идентификацию новых и существующих видов, что еще больше усложняет потребителям решение, какой сорт включить в свой рацион.Однако ясно одно: выбирая добавку Lactobacillus, старайтесь выбирать продукты, содержащие живые бактерии. Недавнее исследование показало, что процесс сублимационной сушки привел к потере жизнеспособности Lactobacillus из-за кислот, продуцируемых сахарами, используемыми в качестве криопротекторов. ¹¹

В одном исследовании исследователи обнаружили, что у мышей с синдромом раздраженного кишечника наблюдалось снижение тяжести заболевания при введении L. acidophilus , в частности, они обнаружили, что пробиотик подавлял воспалительные цитокины IL-6, TNF-a, IL-1B и IL-17 в толстой кишке и селезенке, а также снижение активации миофибробластов, которые представляют собой иммунные клетки, которые мигрируют в места повреждения и продуцируют воспалительные цитокины. ¹²

Как иммунолог, я сосредоточился на том, как работает иммунная система и что происходит, когда что-то идет не так. Только недавно я начал изучать, как микробиом влияет на результаты наших экспериментов и как пробиотики могут быть использованы для лечения пациентов с раком или аутоиммунным заболеванием.

Несколько исследований также показали преимущества комбинации Bifidobacterium с и Lactobacillus при лечении воспалительных заболеваний кишечника.Одно неконтролируемое исследование показало, что введение B. bifidum Bb12 с Lactobacillus acidophilus в течение трех недель удвоило количество лейкоцитов в периферической крови, которые могут поглощать и уничтожать патогены. ^{13 14}

Кроме того, в двойном слепом плацебо-контролируемом исследовании сообщалось о преимуществах для пациентов с аутоиммунным заболеванием Крона или язвенным колитом с комбинацией из восьми пробиотиков, включая B. longum , B .breve, и B. infantis предотвратил рецидив хронического поучита после ремиссии. ^{15 16} Пациенты с ЯК также, по-видимому, лучше контролировали симптомы при приеме добавки со смесью Lactobacilli La-5 и Bifidobacterium Bb-12, а также ферментированного молока с живыми B. breve , B. bifidum и L. acidophilus YIT 0168. ^{17 18 19}

Итог: смешивание

Итак Выбирая, какие пробиотики добавить в свой рацион, важно выбирать продукты с живыми бактериями, такие как охлажденные пробиотические штаммы, высушенные нагреванием, кефир и ферментированные продукты (кто-нибудь пробовал натто? У нашего местного тестера вкуса Эмбер есть отличный пост о это: тест вкуса Натто: как складывается этот супер-фанк суперпродукт?).

В отличие от S. Boulardii , который дает наибольшую пользу при сублимационной сушке, когда речь идет о лактобациллах, сублимированные пробиотики не дадут вам тех же преимуществ, поскольку иногда у них есть проблемы с жизнеспособностью. Хотя и Lactobacillus , и Bifidobacterium продуцируют SFCA, они обеспечивают защитные свойства различными и взаимодополняющими способами, поэтому документировано смешивание этих двух штаммов для обеспечения наилучшей защитной активности.

Наконец, хотя оба обычно считаются безопасными, были сообщения о побочных эффектах от чрезмерного приема у пациентов с сопутствующими заболеваниями (особенно с заболеваниями, вызывающими кровотечение), поэтому, как всегда, посоветуйтесь с врачом, прежде чем вносить какие-либо серьезные изменения. к вашей диете.

Техническая информация для настоящих вундеркиндов

Если вы хотите узнать немного больше, взгляните на эту диаграмму распределения белков по функциональным категориям геномов COG.

Факторы, участвующие в колонизации и выживании бифидобактерий в желудочно-кишечном тракте | Письма о микробиологии FEMS

» data-legacy-id=»fml12056-sec-0001″> Введение

Бифидобактерии — это грамположительные бактерии, которые вместе с Collinsella составляют два основных представителя класса Actinobacteria , населяющих кишечник человека (Qin et al., 2010). Несколько исследований показали, что бифидобактерии могут встречаться в концентрациях выше 10 ¹⁰ клеток на грамм фекалий, причем их больше у новорожденных и младенцев, чем у взрослых и пожилых людей (Arboleya et al. , 2011). Кроме того, текущие метагеномные исследования подтверждают мнение о том, что бифидобактерии составляют одну из основных бактериальных популяций у здоровых людей (Qin et al. , 2010). Их прием был связан с положительными эффектами, такими как предотвращение диареи и нормализация дисфункции кишечника.Таким образом, около штаммов Bifidobacterium были отнесены к категории пробиотиков.

Для достижения своего эффекта бифидобактерии должны уметь выжить при желудочно-кишечном транзите и сохраняться в течение определенного периода времени в кишечнике. Таким образом, изучение процессов выживания и колонизации, а также метаболических преимуществ, позволяющих этим микроорганизмам оставаться живыми и метаболически активными в желудочно-кишечном тракте (ЖКТ) человека, имеют решающее значение для понимания их функциональной активности.В этом отношении характеристика механизмов, лежащих в основе взаимодействий бифидобактерий с хозяином, в течение многих лет затруднялась из-за отсутствия молекулярных инструментов, адаптированных для этого рода. Однако недавняя разработка экспрессионных векторов и систем генерации мутантов, а также огромный прогресс функциональной геномики и других омических технологий позволили научному сообществу заняться функциональностью бифидобактерий, используя хорошо зарекомендовавшие себя in vitro, и in vivo. модели.Таким образом, были выяснены стрессовые реакции на физико-химические состояния желудочно-кишечного тракта и установлена ​​роль конкретных молекул, участвующих в адгезии и колонизации кишечного эпителия. Кроме того, раскрыты основные метаболические пути усвоения пищевых углеводов, которые не перевариваются в верхних отделах ЖКТ. Эти исследования выявили широкий спектр стратегий, которые бифидобактерии используют для адаптации к конкретным условиям окружающей среды кишечника человека.

» data-legacy-id=»fml12056-sec-0003″> Влияние низкого pH на физиологию бифидобактерий

Сильные кислые условия, создаваемые составом желудочного сока, являются одним из первых барьеров, с которыми бифидобактерии справляются в желудке. За исключением Bifidobacterium animalis , устойчивость бифидобактерий к кислоте низкая. Таким образом, использование пробиотиков требует выделения штаммов с хорошей кислотостойкостью, которые обычно проявляют перекрестную устойчивость к другим технологическим и желудочно-кишечным стрессовым факторам (Sánchez et al., 2008).

Ферменты, участвующие в расщеплении неперевариваемых олигосахаридов и гликанов хозяина у бифидобактерий

Ферменты, участвующие в расщеплении неперевариваемых олигосахаридов и гликанов хозяина у бифидобактерий

В толстой кишке неперевариваемые олигосахариды могут расщепляться бифидобактериями до моносахаридов. Затем моносахариды будут обрабатываться центральным углеводным катаболическим путем бифидобактерий, так называемым фруктозо-6-фосфатным шунтом или бифидным шунтом. Некоторые из самых распространенных диетических неперевариваемых олигосахаридов, присутствующих в нижних отделах ЖКТ, — это ксилоолигосахариды.Недавние исследования показали их бифидогенный эффект (Gilad et al. , 2010). Ксилоолигосахариды транспортируются в клетку транспортными системами ABC, а затем разлагаются внутриклеточно до d-ксилозы под действием ксилозидаз. Недавно были охарактеризованы ферменты, разрушающие ксилоолигосахариды, такие как экзоолигоксиланазы из Bifidobacterium adolescentis (Lagaert et al. , 2011). Различные исследования показали, что B. animalis subsp. lactis BB12 способен использовать ксилоолигосахариды в качестве источника углерода, но не может ферментировать ксилан, арабиноксилан или ксилозу (Gilad et al., 2010). Напротив, другие результаты показывают, что B. longum NCC2705 способен ферментировать ксилозу как единственный источник углерода (Liu et al. , 2011). Эти результаты предполагают наличие определенных адаптационных возможностей в зависимости от вида и штамма и указывают на то, что некоторые виды, такие как B. longum , могут иметь адаптивные преимущества перед другими видами, менее знакомыми с кишечной средой человека, такими как B. animalis subsp . . Лактис .

С другой стороны, несколько исследований in vitro и in vivo показали, что добавленные в рацион галактоолигосахариды могут изменять профиль кишечной микробиоты за счет увеличения количества бифидобактерий.Эти галактоолигосахариды гидролизуются β-галактозидазами. Обращает на себя внимание способность некоторых β-галактозидаз из бифидобактерий продуцировать другие классы пребиотиков за счет трансферазной активности галактозильных групп по отношению к лактозе и синтезировать трансгалактоолигосахариды. Недавно несколько исследований открывают возможность использования штаммов Bifidobacterium для производства новых пребиотиков с видоспецифическим бифидогенным действием (Davis et al. , 2011).

Инулин и фруктоолигосахариды представляют собой неперевариваемые олигосахариды, присутствующие в некоторых фруктах и ​​овощах, и, как сообщается, они стимулируют рост бифидобактерий.Β-фруктофуранозидаза — это фермент, ответственный за гидролиз фруктана и сахарозы. Ген, кодирующий этот фермент, был охарактеризован у B. animalis subsp. lactis DSM 10140 (Янер и др. , 2004). Короткоцепочечные фруктоолигосахариды обычно предпочтительны в качестве субстрата для роста, и многие виды не могут расти на инулине. В предыдущем исследовании 18 штаммов Bifidobacterium были сгруппированы в соответствии с их способностью полностью или частично ферментировать олигофруктозу, инулин или и то, и другое (Falony et al., 2009).

Крахмал не переваривается и попадает в толстую кишку, являясь отличным источником углеводов для кишечных бактерий, способных вырабатывать амилолитические ферменты. Несколько исследований показали наличие активности α-амилазы и пуллуланазы у различных штаммов бифидобактерий, способных использовать крахмал, амилопектин и пуллулан. Была очищена и охарактеризована одна внеклеточная амилаза (AmyB) из B. adolescentis (Rhim et al. , 2006). Кроме того, ген apuB , кодирующий внеклеточную амилопуллуланазу типа II, был обнаружен у B.breve UCC2003. Этот ген необходим для метаболизма крахмала или длинноцепочечных мальтоолигосахаридов (Покусаева и др. , 2011).

Недавно у бифидобактерий был охарактеризован путь галакто- N -биоза-лакто- N -биоза I. Посредством этого пути дисахариды из молока расщепляются активными внеклеточными гликозидазами олигосахаридов грудного молока (фукозидазы, сиалидазы, лакто- N -биозидазы, β-галактозидазы) и галакто- N -биоза.Кроме того, галакто- N -биоза является основной структурой сахара типа муцина, образованного активными внеклеточными гликозидазами, такими как эндо-α- N -ацетилгалактозаминидаза (EngBF) и α-l-фукозидаза (AfcA), действующие на муцин. гликопротеины (Turroni et al. , 2011a). Анализ экспрессии генов B. longum subsp . longum , выращенный в присутствии грудного молока, показал повышенную регуляцию генов, участвующих в пути галактоза / лакто- N -биоза (González et al., 2008). С другой стороны, остатки лакто- N -биозы олигосахаридов грудного молока могут действовать как бифидогенный фактор у младенцев, находящихся на грудном вскармливании. Они используются в качестве источника углеводов штаммами, которые обычно колонизируют ЖКТ младенцев, такими как B. longum subsp. infantis , B. longum subsp. longum, B. bifidum и B. breve . Эти олигосахариды не оказывали пребиотического действия на штаммы, обнаруженные во взрослом желудочно-кишечном тракте, такие как B.adolescentis , Bifidobacterium catenulatum , Bifidobacterium angulatum и Bifidobacterium dentium , а также на других молочнокислых и кишечных бактериях (Xiao et al. , 2010). Этот пребиотический эффект подтверждается информацией, содержащейся в геномах бифидобактерий из ЖКТ младенцев. Типичные виды от младенцев (например, B. longum subsp. infantis и B. breve ) имеют больше генов, которые, по прогнозам, участвуют в утилизации олигосахаридов грудного молока, чем виды, обычно населяющие ЖКТ взрослых, которые имеют больше генов, участвующих в метаболизме. сложных углеводов растительного происхождения (Таблица 2).Некоторые исследования показали, что B. longum subsp . Infantis , B. breve и B. bifidum могли расти на олигосахаридах грудного молока в качестве единственного источника углерода (Ward et al. , 2007; Turroni et al. , 2011b). В этом контексте олигосахариды грудного молока могут играть роль в укрепляющих здоровье свойствах грудного молока человека, а также важную роль в питании младенцев во время и после отлучения от груди.

Наконец, муцин кишечника является одним из наиболее распространенных метаболических ресурсов бактерий, населяющих кишечник человека.В связи с этим несколько исследований продемонстрировали способность различных бифидобактерий метаболизировать кишечную слизь человека, например B. longum , B. breve и B. bifidum (Ruas-Madiedo et al. , 2008 ). Кроме того, анализ последовательности генома B. bifidum PRL2010 продемонстрировал его способность метаболизировать муцин и предполагает, что эта способность может способствовать колонизации кишечника младенца (Turroni et al. , 2010).

Набор ферментов, упомянутых выше, обеспечивает бифидобактерии способность разлагать источники углерода, специфически обнаруженные в кишечнике человека, и эта способность дает избирательное преимущество перед другими бактериями, менее приспособленными к использованию этих метаболических ресурсов. Следовательно, эти метаболические возможности дают бифидобактериям преимущество с точки зрения выживания и колонизации в ЖКТ человека.

«> Благодарности

Авторы благодарят Министерство науки и инноваций Испании (MICINN) и «Plan Nacional I + D + i» за финансовую поддержку исследовательской работы в рамках проектов AGL2010-14952 и RM2010-00012-00-00. Б.С. был получателем постдокторского контракта Хуана де ла Сьервы, а И.Г.-Р.был получателем гранта FPI от MICINN. L.R. имел контракт JAE-Predoctoral, финансируемый CSIC.

Заметки автора

© 2013 Федерация европейских микробиологических обществ. Опубликовано Blackwell Publishing Ltd. Все права защищены

границ | Неэффективный метаболизм олигосахаридов молока человека Лакто-N-тетраоза и лакто-N-неотетраоза сдвигает Bifidobacterium longum subsp.младенческая физиология

Введение

Грудное вскармливание имеет решающее значение для развития и здоровья младенцев в отсутствие заменителей молока. Грудное молоко содержит высокую концентрацию неперевариваемых олигосахаридов, а также других питательных молекул, которые способствуют росту, который наблюдается в раннем возрасте (1–5). Олигосахариды грудного молока (HMOs) представляют собой неперевариваемые углеводы, растворимые в материнском молоке, и состоят из пяти моносахаридов: D-глюкозы (Glc), D-галактозы (Gal), N, -ацетилглюкозамина (GlcNAc), L-фукозы (Fuc). ) и N, -ацетилнейраминовая кислота (Neu5Ac или сиаловая кислота) с различной степенью полимеризации и разветвления (6–9).Эти олигосахариды не метаболизируются непосредственно младенцем; однако комменсальные бифидобактерии одновременно эволюционировали в кишечнике грудного ребенка, чтобы использовать HMO (10, 11).

Bifidobacterium longum subsp. infantis ( B. infantis ) колонизирует грудного ребенка и обычно преобладает в микробиоме кишечника младенца (12–15). Модель B . infantis Геном кодирует набор гликозилгидролаз, переносчиков олигосахаридов и катаболических ферментов, которые делают возможной утилизацию HMO (10, 16-19).Как гликозилгидролазы, так и трансмембранные переносчики питают олигосахариды молока и их производные по центральному ферментативному пути бифидобактериальной фруктозо-6-фосфатфосфокетолазы (F6PPK). F6PPK считается уникальным для рода Bifidobacterium , который генерирует АТФ из гексоз посредством фосфорилирования на уровне субстрата, что приводит к секреции конечных продуктов для рециклирования кофакторов (20–23). Бифидобактерии первоначально превращают один моль фруктозо-6-фосфата в один моль эритрозо-4-фосфата и один моль ацетилфосфата через F6PPK (EC 4.1.2.22). Трансальдолаза (EC 2.2.1.2) и транскетолаза (EC 2.2.1.1) превращают эритрозо-4-фосфат и один моль фруктозо-6-фосфата в два моля ксилулозо-5-фосфата, которые превращаются в два моля ацетилфосфата. и глицеральдегид-3-фосфат за счет активности ксилулозо-5-фосфат-фосфокетолазы (EC 4.1.2.9). Ацетилфосфат дефосфорилируется в ацетат ацетаткиназой (EC 2.7.2.1), сопровождаемый одним АТФ на ацетилфосфат (24). Кроме того, глицеральдегид-3-фосфат окисляется до пирувата с образованием единственного АТФ.Пируват превращается в лактат лактатдегидрогеназой (EC 1.1.1.27) вместе с рециркуляцией NAD ⁺ из NADH (25). На каждые 2 моля гексозы, попадающей в путь F6PPK, образуется 3 моля ацетата и 2 моля лактата (то есть соотношение 1,5). На основании транскриптомных данных вполне вероятно, что B. infantis катаболизирует моносахариды, полученные из HMO, через путь F6PPK с образованием АТФ (26). Это потенциально связывает физиологию бифидобактерий (то есть поток через путь F6PPK) с питанием и здоровьем младенцев, как B.Infantis приносит пользу своему развивающемуся хозяину (27, 28).

В целом, все штаммов B. infantis , исследованные на сегодняшний день, эффективно используют ОПЗ, полученные от нескольких матерей-доноров, за исключением одной (29–33, 34). Тетрасахариды лакто- N -тетраоза (LNT) и лакто- N -неотетраоза (LNnT) представляют собой очень распространенные олигосахариды, секретируемые с грудным молоком (2, 6). LNT (Galβ1-3GlcNAcβ1-3Galβ1-4Glc) классифицируется как HMO типа I, который включает лактозил, связанный с остатком лакто- N -биозы (LNB) (Galβ1-3GlcNAc).Напротив, LNnT (Galβ1-4GlcNAcβ1-3Galβ1-4Glc) является изомером LNT и классифицируется как олигосахарид типа II, связывающий концевой лактозил с N -ацетиллактозамином (LacNAc) (Galβ1-4GlcNAc). Эти изомеры идентичны, за исключением единственной гликозидной связи (т. Е. Β1-3 против β1-4), что приводит к гипотезе о том, что эта структурная вариация отвечает за различные фенотипы в использовании бифидобактериями этих основных HMO.

Материалы и методы

Бактериальные штаммы и размножение

Штаммы бактерий, использованные в этом исследовании, сведены в Таблицу 1.Штаммы бифидобактерий размножали в среде De Man Rogosa Sharp (MRS, Oxoid, Hampshire, England) с добавлением 0,05% (вес / объем) гидрохлорида L-цистеина (Sigma-Aldrich, Сент-Луис, Миссури) (35) при 37 ° C. в анаэробных условиях (Coy Laboratory Products, Grass Lake, MI). Бактериальные штаммы обычно проверяли с использованием бифидобактериально-специфичного анализа фосфокетолазы (36) и бифидобактериально-специфической ПЦР, нацеленной на последовательность гена 16S рРНК, с использованием ранее разработанных Bif164-F (5′-GGGTGGTAATGCCGGATG-3 ‘) и Bif662-RGGTAAC -3 ′) (37).Кроме того, был проведен анализ соотношения Bifidobacterium longum / infantis (BLIR) на основе ПЦР для проверки подвидов, как описано ранее (38).

Таблица 1 . Список штаммов, использованных в этом исследовании ^a .

Анализ роста для микропланшетов

Для оценки фенотипов роста в 96-луночном формате ночные культуры инокулировали 1% (об. / Об.) В модифицированную среду MRS (mMRS; определенный углеводный субстрат и без ацетата).Углеводные субстраты, используемые в этом исследовании, включают глюкозу (Sigma-Aldrich Co. Сент-Луис, Миссури), галактозу (Sigma-Aldrich Co. Сент-Луис, Миссури), лактозу (Sigma-Aldrich Co. Сент-Луис, Миссури), L. -фукоза (Sigma-Aldrich Co., Сент-Луис, Миссури), N -ацетилглюкозамин (GlcNAc) (Tokyo Chemical Industry Co, Токио, Япония), лакто- N -тетраоза (LNT) (Elicityl-oligotech, Crolles, Франция) и лакто- N -неотетраоза (LNnT) (Elicityl-oligotech, Crolles, Франция) в конечной концентрации 2% (мас. / Об.) В качестве единственного источника углерода.Источники углеводов были включены в культуральную среду в неограничивающих концентрациях. Анализ роста проводили в анаэробных условиях при 37 ° C в течение 48 часов путем оценки оптической плотности при 600 нм (OD _{600 нм} ) на автоматическом спектрофотометре для микропланшетов PowerWave HT (BioTek Instruments, Inc. Winooski, VT), помещенном в анаэробную камеру. Каждый штамм оценивали в трех биологических повторностях с тремя техническими повторностями. Инокулированная среда mMRS в отсутствие углеводных субстратов служила отрицательным контролем.Кинетику роста бактерий рассчитывали с использованием Wolfram Mathematica 10.3 Student Edition с помощью приведенного ниже уравнения, как описано у Dai et al. (39).

ΔOD _asym — это уровень роста в стационарной фазе, где k представляет скорость роста, а tc — точка перегиба, указывающая время достижения максимальной скорости роста.

Характеристика конечных продуктов метаболизма микробов

Конечные продукты бактериальной ферментации количественно определяли с помощью ВЭЖХ.Первоначально штаммы бактерий размножали, как описано выше. Бесклеточные супернатанты из ростков микропланшетов получали на ранней стационарной фазе и фильтровали через фильтр 0,22 мкм (Sartorius Corp, Богемия, Нью-Йорк) после центрифугирования и хранили при -20 ° C до дальнейшего анализа. Органические кислоты определяли количественно с использованием системы ВЭЖХ Schimadzu, оснащенной детектором показателя преломления 20A (Schimadzu Corp., Киото, Япония). Разделение проводили с использованием колонки Aminex HPX-87H (7,8 мм ID × 300 мм, Bio Rad Laboratories, Hercules, CA) при 30 ° C в подвижной фазе 5 мМ H ₂ SO ₄ при скорости потока 0.6 мл / мин при объеме инъекции 20 мкл. Стандарты, включая органические кислоты (например, уксусную кислоту, молочную кислоту, муравьиную кислоту), этанол и углеводы (например, глюкозу, галактозу, лактозу и GlcNAc), были приобретены у Sigma-Aldrich Co. (Сент-Луис, Миссури). Концентрации метаболитов рассчитывали по стандартным кривым, полученным из внешних стандартов для шести концентраций (0,5, 1, 5, 10, 20 и 50 мМ). Профилирование метаболитов проводили в трех экземплярах, и каждое измерение проводили в двух экземплярах. Профили метаболитов для каждого штамма, присутствующего на панели углеводов, анализировали с помощью MetaboAnalyst 3.0 (http://www.metaboanalyst.ca) (40). Потребление сахара в процентах рассчитывали путем деления количества моно- и дисахаридов, потребленных после ферментации, на концентрацию источника углеводов перед ферментацией. Процентное извлечение углерода рассчитывали путем деления общего количества углерода, извлеченного из метаболитов, на общее количество углерода, присутствующего в процессе предварительной ферментации, за вычетом общего количества углерода в источнике углеводов после ферментации.

Количественный анализ ПЦР в реальном времени

Б.Экспрессию гена infantis проводили количественной ПЦР в реальном времени (qRT-PCR) на относительной основе. Образцы объемом 1 мл собирали в середине экспоненциальной фазы (OD _{600 нм} ~ 0,4–0,6 варьируется в зависимости от источника углеводов), осаждали при 12000 × g в течение 2 мин и хранили в 1 мл Ambion RNAlater (Life Technologies, Carlsbad, CA ). Экстракцию РНК и преобразование кДНК проводили, как описано ранее (26). Вкратце, образцы центрифугировали при 12000 × g в течение 2 минут для сбора осадка клеток.Осадок дважды промывали буфером PBS для удаления остатков RNAlater и центрифугировали при 12000 × g в течение 2 минут. Тотальную РНК экстрагировали с использованием набора Ambion RNAqeous-Mini (LifeTechnologies, Carlsbad, CA) в соответствии с инструкциями производителя. Клетки, суспендированные в буфере для лизиса, переносили в пробирки Lysing Matrix E (MP Biomedicals LLC, Солон, Огайо) для разрушения клеточных стенок путем двукратного биения шариков со скоростью 5,5 м / с в течение 30 с с использованием гранулы FastPrep 24 (MP Biomedicals, Санта-Ана, Калифорния). ). Тотальную РНК элюировали в 50 мкл раствора EB и немедленно подвергали обработке ДНКазой Ambion Turbo DNA-free (Invitrogen, Вильнюс, Литва) с использованием 1 мкл ДНКазы I в течение 30 мин.Впоследствии общую РНК преобразовывали в кДНК с использованием набора для обратной транскрипции кДНК высокой емкости (Applied Biosystems, Карлсбад, Калифорния) в соответствии с инструкциями производителя. Полученную кДНК количественно оценивали на спектрофотометре Nanodrop 2000 (Thermo Fisher Scientific Inc., Agawam, MA). QRT-PCR выполняли в системе 7500 Fast Real-Time PCR System (Applied Biosystems, Сингапур) с PowerUP SYBR Green Master Mix (Applied Biosystems, Foster City, CA) с использованием 200 нг входящей кДНК. Условия реакции были указаны в соответствии с рекомендациями производителя и оптимизированы для конкретного целевого локуса.Праймеры для qRT-PCR были сконструированы с использованием программного обеспечения Primer3 (таблица S1; http: // frodo.wi.mit.edu). Ген Blon_0393, кодирующий цистеинил-тРНК синтетазу, как и ранее использовали в качестве эндогенного контроля (16, 41). Рост на лактозе (2% масс. / Об.) Служил эталонным условием для экспрессии гена. Результаты были выражены как кратное изменение относительно эталона. Эти эксперименты были проведены в трех экземплярах, а технические измерения были выполнены в трех повторностях. После обработки ДНКазой отсутствие геномной ДНК подтверждали с использованием общей РНК в качестве матрицы с помощью qRT-PCR (т.е.е., эндогенная контрольная реакция).

Статистический анализ

Отношения между асимптотической OD _{600 нм} , темпами роста и метаболитами были охарактеризованы с помощью анализа главных компонентов (PCA) и иерархической кластеризации с помощью метода Варда и евклидовых расстояний с использованием R (R.3.4.0). Выбросы определялись в соответствии с их расстоянием до среднего в пределах биологических повторов, которые не учитывались, чтобы сохранить как минимум три биологических повтора. Когда рост сахаров не наблюдался, значения были присвоены как «0» для анализа функции PCA (prcomp), и графики PCA были построены с использованием ggbiplot в R.Кинетику роста, концентрации метаболитов, кратное изменение экспрессии генов в культуре клеток для B. infantis ATCC 15697 подвергали однофакторному дисперсионному анализу (ANOVA) и тесту HSD Тьюки для множественных сравнений между источниками углеводов. Кратность изменения экспрессии гена B. infantis , кинетику роста и метаболиты между штаммами анализировали с помощью двухфакторного дисперсионного анализа. Простые эффекты и эффекты основных факторов были определены с помощью теста HSD Тьюки для множественных сравнений источников углеводов для одного и того же штамма и между штаммами для определенного источника углеводов.

Биоинформатический анализ данных транскриптома

Транскриптомные данные (т.е. необработанные считывания) B. infantis ATCC 15697 при выращивании на лактозе, LNT и LNnT были получены из ранее проведенного исследования RNA-seq (26), публично депонированного в базе данных NCBI Gene Expression Omnibus (http : //www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/) под регистрационным номером GSE58773 (и личное общение с Даниэль Лемей). Эти данные были загружены в Зеленый кластер высокопроизводительных вычислений штата Массачусетс (MGHPCC), который использовался для всех вычислительных / статистических анализов, если не указано иное.Считывания РНК-seq были сопоставлены со ссылкой B. longum subsp. infantis Геном ATCC 15697 (NC_011593.1). Кодирующие области генома ATCC 15697 были подвергнуты этому анализу. Для анализа дифференциальной экспрессии были получены общие и уникальные считывания генов, совпадающие с конкретным геномным локусом (т. Е. Тегом локуса), а также рассчитанные необработанные подсчеты.

Дифференциальная экспрессия генов

Чтобы идентифицировать и количественно оценить величину дифференциально экспрессируемых генов, R-пакет DESeq2 был использован для анализа необработанных данных подсчета (42).Гены со средним числом <200 были исключены из анализа предварительной фильтрацией. DESeq2 применяет тест Вальда для статистического анализа. Скорректированные p ≤ 0,05 были определены как статистически значимые.

Противовоспалительный анализ, проведенный на клеточной культуре модели

Линии клеток Caco-2 (ATCC HTB 37) обычно культивировали в среде Игла, модифицированной по Дульбекко с высоким содержанием глюкозы (DMEM) (Corning, Manassas, VA), с добавлением NaHCO ₃ (Sigma-Aldrich, Сент-Луис, Миссури), 1 % заменимых аминокислот (Gibco, Дублин, Ирландия), 100 Ед / мл пенициллин-стрептомицин (Gibco, Дублин, Ирландия), 10% (об. / об.) фетальной бычьей сыворотки (Seradigm VWR, Radnor, PA) и 7 mM HEPES (Gibco, Дублин, Ирландия).Клетки Caco-2 обычно выращивали в 20-сантиметровых чашках Петри и субкультивировали при 80% конфлюэнтности и поддерживали при 37 ° C в увлажненной атмосфере с 5% (об. / Об.) CO ₂ в воздухе.

Клетки дифференцировали на пассажах 30–32 и собирали путем диссоциации 90% конфлюэнтной исходной культуры с 0,25% трипсином / ЭДТА (Gibco, Дублин, Ирландия). Для анализа воспаления клетки Caco-2 высевали в 24-луночный планшет в концентрации 1-2 × 10 ⁵ клеток / см ² и дифференцировали в течение 17 дней, меняя среду каждые 2-3 дня.Репликационные супернатанты, собранные из B. infantis ATCC 15697, растущих на лактозе, LNT и LNnT, смешивали в равном объеме и добавляли в DMEM до конечной концентрации 15% (об. / Об.). Сто микролитров контрольных образцов уксусной кислоты, молочной кислоты и муравьиной кислоты смешивали с DMEM. Затем среду добавляли в каждую лунку в трех экземплярах и инкубировали при 37 ° C в атмосфере 5% CO ₂ в течение 2 часов. Для отрицательного и положительного контролей трижды засевали только DMEM.После инкубации в лунки добавляли 10 мкл 5 мг / мл липополисахарида (LPS, Sigma-Aldrich, Сент-Луис, Миссури) в PBS и инкубировали в течение 24 часов для обработок. В качестве отрицательного контроля использовали только ЛПС. Только PBS служил раствором-носителем и контрольным образцом. После инкубации клетки отделяли от поверхности планшета инкубацией с трипсином / ЭДТА, суспендировали в 500 мкл раствора RNAlater и хранили при -80 ° C до экстракции РНК.

Относительную экспрессию гена интерлейкина-8 (IL-8), связанную с экспрессией LPS-индуцированного воспаления, количественно оценивали с помощью qRT-PCR.Тотальную РНК экстрагировали с использованием набора для экстракции Ambion RNAqeous-Total RNA (Invitrogen, Вильнюс, Литва) в соответствии с инструкциями производителя. Клетки, суспендированные в буфере для лизиса, переносили в пробирки Lysing Matrix D, специфичные для культуры эукариотических клеток и тканей (MP Biomedicals LLC, Солон, Огайо), и подвергали воздействию скорости 5,5 м / сек в течение 30 секунд дважды с использованием гранулы FastPrep 24 ( MP Biomedicals, Санта-Ана, Калифорния). Общую РНК элюировали в 50 мкл раствора EB и немедленно подвергали обработке ДНКазой Ambion Turbo DNA-free (Invitrogen, Вильнюс, Литва) с использованием 1 мкл ДНКазы I в течение получаса.Суммарную РНК преобразовывали в кДНК с использованием набора для обратной транскрипции кДНК высокой емкости (Applied Biosystems, Карлсбад, Калифорния) в соответствии с инструкциями производителя. Полученную кДНК количественно оценивали на спектрофотометре Nanodrop 2000 (Thermo Fisher Scientific Inc., Agawam, MA). Анализ qRT-PCR выполняли с использованием системы 7500 Fast Real-Time PCR System (Applied Biosystems, Сингапур) с PowerUP SYBR Green Master Mix (Applied Biosystems, Foster City, CA) с использованием 200 нг кДНК с праймерами GAPDH-F (5 ′ -GTCGCTGTTGAAGTCAGAGG-3 ‘) и GAPDH-R (5′-GAAACTGTGGCGTGATGG-3′) для эндогенного контроля и праймеры IL-8-F (5’-GACCACACTGCGCCAACAC-3 ‘) и IL-8-R (5’-CTTCTCCACAAC 3 ′) (43).Условия цикла ПЦР применялись в соответствии с рекомендациями производителя и специально адаптированы к целевым генам. Дополнительные маркеры воспаления были протестированы с использованием праймеров IL-10-F (5′-GGTTGCCAAGCCTTGTCTGA-3 ′), IL-10-R (5′-AGGGAGTTCACATGCGCCT-3 ′) (44) и TNF-α-F (5 ′ -TCAACCTCCTCTCTGCCATC-3 ‘), TNF-α-R (5′-CCAAAGTACACCTGCCCAGA-3’) (45).

Результаты

Для понимания B.Infantis метаболизма HMO, типовой штамм ATCC 15697 подвергали выращиванию на очищенных видах HMO и составляющих моно- и дисахаридах. Соответственно, B. infantis ATCC 15697 активно росли на лактозе (OD _{600 нм} , _asym = 1,27 ± 0,12, k = 0,56 ± 0,03 h ^-1 ), а также на галактозе (OD _{600 нм} , _asym = 1,20 ± 0,13, k = 0,61 ± 0,02 ч ⁻¹ ) (рисунок 1). Вид HMO LNT использовался в качестве единственного источника углеводов в аналогичной степени (OD _{600 нм} , _asym = 1.19 ± 0,24, k = 0,51 ± 0,02 ч ^-1 ) в качестве этих двух составляющих остатков (рисунок 1). Интересно, что структурный изомер LNnT способствовал более умеренному профилю роста (OD _{600 нм} , _asym = 0,85 ± 0,09, k = 0,57 ± 0,04 ч ^-1 ) ( p <0,05) (Рисунок 1). Штамм B. infantis не рос на составляющих HMO GlcNAc и фукозе в качестве единственного источника углеводов. Примечательно, что рост на глюкозе был непостоянным с точки зрения конечной OD _{600 нм} ; поэтому сравнение с другими углеводами было ограничено.Значительная разница между использованием LNT и LNnT ( p <0,05) предполагает, что эти HMO метаболизируются посредством различных механизмов, которые различаются по эффективности (рис. 1A). Различия в скорости роста между видами ОПЗ не наблюдались, что указывает на эквивалентное предпочтение LNT и LNnT (рис. 1B). B. infantis ATCC 15697 демонстрировал аналогичные скорости роста для лактозы, галактозы и LNnT ( p > 0,05). Хотя эффективность роста галактозы и LNT одинакова (рис. 1A), B.Infantis ATCC 15697 предпочитает галактозу LNT, о чем свидетельствует скорость роста ( p <0,05). В совокупности единственное структурное различие между LNT и LNnT напрямую связано с эффективностью, с которой B. infantis использует эти виды HMO. Предыдущие исследования показывают, что ATCC 15697 растет как на LNT, так и на LNnT, достигая OD _{600 нм} > 0,8, однако в этих исследованиях не сообщалось о специфическом асимптотическом росте (т.е. эффективности) или скорости роста (т.е. предпочтении) при выращивании на этих участках. два вида ОПЗ (17, 26, 46, 47).Таким образом, важно, что ATCC 15697 демонстрирует четкие различия в использовании между LNT и LNnT при накоплении биомассы до значений OD _{600 нм} > 0,8.

Рисунок 1 . B. longum subsp. infantis ATCC 15697 кинетика роста при использовании углеводов молока. Конечная асимптотическая OD _{600 нм} (A) и скорость роста (k, h ^-1 ) (B) для B. infantis ATCC15697, существующих на среде mMRS, содержащей 2% (мас. / Об.) Галактозы (Gal), лактоза (Lac), лакто- N -тетраоза (LNT) или лакто- N -неотетраоза (LNnT).Кинетика роста рассчитывалась с помощью Wolfram Mathematica 10.3. Данные представляют собой среднее значение ± SD трех независимых экспериментов. Одиночная звездочка (*) указывает на значительные различия между использованием углеводов, оцененных с помощью одностороннего дисперсионного анализа и множественного сравнения Тьюки ( p <0,05).

Конечные продукты метаболизма дифференцированно секретируются в зависимости от олигосахаридного субстрата молока: лакто-

Конечные продукты ферментации были профилированы, чтобы детализировать метаболические последствия потока углеводов HMO через путь F6PPK.Во время ферментации гексозы уксусная кислота и молочная кислота обычно секретируются в теоретическом соотношении 1,5. Напротив, образование муравьиной кислоты не ожидается в большинстве испытанных на сегодняшний день условий (20, 47). Абсолютные концентрации молочной кислоты, уксусной кислоты, муравьиной кислоты, этанола и соотношения между этими метаболитами показаны на рисунке 2. B. infantis ATCC 15697 производит аналогичные концентрации молочной кислоты при росте на галактозе, лактозе и LNT ( 42,5 ± 5,7, 47.8 ± 5,7 и 46,5 ± 2,5 мМ соответственно) ( p > 0,05, рисунок 2A). Однако при использовании LNnT выделялась гораздо более низкая концентрация молочной кислоты (29,5 ± 5,9 мМ) по сравнению с метаболизмом других углеводов ( p <0,05). Интересно, что концентрации муравьиной кислоты и этанола были значительно выше при выращивании на LNnT (16,3 ± 4,1 и 2,5 ± 1,1 мМ соответственно). Это контрастирует с относительно меньшими концентрациями при росте на LNT, лактозе и галактозе ( p <0.05, рисунки 2C, D).

Рисунок 2 . B. longum subsp. infantis ATCC 15697 конечные продукты ферментации при использовании углеводов молока через путь F6PPK. Абсолютные концентрации молочной кислоты (A) , уксусной кислоты (B) , муравьиной кислоты (C) и этанола (D) . Кроме того, отношение уксусной кислоты к молочной кислоте (E) , отношение муравьиной кислоты к молочной кислоте (F) , отношение муравьиной кислоты к уксусной кислоте (G) и отношение этанола к молочной кислоте (H) .Все панели представляют собой B. infantis ATCC15697, растущие на среде mMRS, содержащей 2% (масс. / Об.) Галактозы (Gal), лактозы (Lac), лакто- N -тетраозы (LNT) или лакто- N -неотетраозы. (LNnT). Средние значения из независимых биологических повторов (трех или более) показаны столбиками, представляющими стандартные отклонения средних значений. Значения производства органической кислоты выражены в миллимолярных (мМ) абсолютных концентрациях. Одиночная звездочка (*) обозначает значительные различия между продукцией метаболитов, оцененной с помощью однофакторного дисперсионного анализа и теста множественного сравнения Тьюки ( p <0.05).

LNnT привел к самой высокой концентрации секретируемой уксусной кислоты (84,8 ± 4,4 мМ, рис. 2B) и значительно отличался от метаболизма LNnT ( p <0,05). В целом ожидается, что концентрации ферментативных конечных продуктов будут положительно коррелировать с конечной биомассой (48), поскольку большее количество углеводов, обрабатываемых путем F6PPK, приводит к большему секреции органических кислот. Следовательно, ожидается, что концентрации молочной и уксусной кислот будут выше, когда будет достигнута большая биомасса (47).Однако концентрации уксусной кислоты при использовании галактозы, лактозы и LNnT существенно не отличались друг от друга ( p > 0,05). В целом, эти данные подтверждают гипотезу о том, что B. infantis использует другой механизм при использовании LNnT, чем LNT.

Соотношение секретируемых конечных продуктов указывает на альтернативный путь метаболизма лакто-

бифидобактерий, включая B. infantis , катаболизируют 2 моля гексозы с выделением 2 моль молочной кислоты и 3 моль уксусной кислоты через путь F6PPK (рис. 3).Этот теоретический выход (т.е. соотношение ацетат: лактат 1,5) был достигнут во время роста на галактозе и лактозе (1,56 ± 0,01 и 1,58 ± 0,01, соответственно, рис. 2E). Во время метаболизма HMO, использование LNT и LNnT изменило соотношение в сторону большей продукции уксусной кислоты (1,84 ± 0,01 и 2,08 ± 0,14, соответственно, p <0,05, рис. 2E). Вероятно, это связано с деацетилированием остатка GlcNAc, по крайней мере частично. Примечательно, что это соотношение значительно различается между использованием LNT и LNnT, причем последний испытывает более сильный сдвиг ( p <0.05). Если оба изомера HMO увеличивают относительную долю уксусной кислоты посредством деацетилирования GlcNAc, более высокое соотношение во время метаболизма LNnT связано либо со снижением продукции молочной кислоты, либо с увеличением продукции уксусной кислоты в результате превращения ацетил-КоА.

Рисунок 3 . Bifidobacterium longum subsp. infantis метаболических путей для использования лакто- N -тетраозы (LNT) и лакто- N -неотетраозы (LNnT) и составляющих их моносахаридов.LNT и LNnT перемещаются через клеточную мембрану при помощи переносчиков ABC. Внутриклеточные гликозилгидролазы перерабатывают HMO в составляющие моносахариды для вступления в центральный путь ферментации. Этот путь включает характерную активность фруктозо-6-фосфатфосфокетолазы (F6PPK), обозначенную синим цветом. Гены, кодирующие внутриклеточные метаболические ферменты, изображены рядом со стрелками в соответствии с их меткой локуса в геноме ATCC 15697. Сплошные стрелки представляют собой прямые преобразования, а пунктирные стрелки показывают последовательные действия нескольких ферментов.Прогнозируемые катаболические операции, которые влияют на путь F6PPK и соответствующие им продукты, обозначены фиолетовым цветом. Стехиометрические коэффициенты секретируемых метаболитов, АТФ и NAD ⁺ , образующихся в процессе метаболизма, отмечены красным. Включены экспериментальные наблюдения, представленные на рисунках 1, 2, включая стехиометрию.

LNnT характеризовался значительным увеличением продукции муравьиной кислоты и этанола, несмотря на более низкую биомассу. Соответственно, соотношение муравьиной кислоты к молочной кислоте было значительно выше во время метаболизма LNnT ( p <0.05, рисунок 2F). Точно так же метаболизм LNnT значительно увеличил отношение муравьиной кислоты к уксусной кислоте ( p <0,05, рис. 2G). Теоретическое соотношение муравьиной кислоты и уксусной кислоты составляет 2: 5 при более чем 50% превращении ацетил-КоА в уксусную кислоту (25). Это соотношение было достигнуто во время метаболизма LNnT (рис. 2G). Это отчасти означает, что пируват перемещается в сторону ацетил-КоА, что приводит к большему образованию муравьиной и уксусной кислоты, чем молочной кислоты. Соответственно, соотношение этанола и молочной кислоты во время ферментации LNnT значительно отличалось от LNT, а также других углеводов ( p <0.05, рисунок 2H). Теоретическое соотношение составляет 1: 1, когда 50% ацетил-КоА превращается в этанол. Более высокое отношение этанола к молочной кислоте в LNnT указывает на то, что образование этанола происходит для регенерации NAD ⁺ . Теоретическое соотношение не было достигнуто (~ 0,08), таким образом, это объясняет, что ацетил-КоА был в основном преобразован в уксусную кислоту, а не в этанол для увеличения производства АТФ вместо рециркуляции NAD ⁺ . Это указывает на явный метаболический сдвиг в сторону этих конечных продуктов при питании LNnT.

Экспрессия гена транспорта олигосахаридов остается одинаковой вне зависимости от субстратов лакто-

Как и другие бифидобактерии, исследованные на сегодняшний день, B. infantis ATCC 15697 кодирует несколько белков, связывающих растворенные вещества (F1SBP) семейства 1, АТФ-связывающих доменов и пермеаз, которые собираются в переносчики ABC с предсказанным сродством к олигосахаридам (10, 16, 49 ). Экспрессия четырех F1SBP и родственных им пермеаз ABC во время использования LNT и LNnT была оценена для проверки гипотезы о том, что транспорт вносит вклад в дифференциальные метаболические фенотипы (Фигуры 4A, B).Ранее было идентифицировано, что эти F1SBP связывают гликаны, которые включают фрагменты HMO (16). Три F1SBP (Blon_0883, Blon_2344 и Blon_2347) и четыре пермеазы ABC (Blon_2175, Blon_2176, Blon_2345 и Blon_2346) индуцировались более чем в 2 раза во время роста на LNT или LNnT в качестве единственного источника углерода по сравнению с лактозой ( p ). Только экспрессия Blon_2347 значительно различалась между метаболизмом двух видов HMO ( p <0,05, фиг. 4A). Интересно, что и LNT, и LNnT индуцировали F1SBP Blon_0883, хотя соседние с ним белки пермеазы Blon_0884 и Blon_0885 не индуцировались ( p > 0.05). Анализ основного эффекта с помощью двустороннего дисперсионного анализа показывает, что Blon_2347 демонстрирует самую сильную индукцию среди четырех генов F1SBP независимо от субстрата ( p <0,05, фиг. 4A). Примечательно, что среди пермеаз наибольшая относительная экспрессия наблюдалась при транскрипции Blon_2346, за которым следует Blon_2345 ( p <0,05, фиг. 3B). Эти гены расположены в катаболическом кластере размером 40 т.п.н., специально предназначенном для метаболизма HMO (10). Это указывает на то, что B. infantis развертывает кластерные переносчики HMO, одновременно используя как LNT, так и LNnT, который значительно отличается от его соответствующего компонента, лактозы.Дифференциальные метаболические фенотипы между LNT и LNnT не связаны с экспрессией этих транспортных генов, что указывает на то, что это, вероятно, функция внутриклеточных катаболических операций.

Рисунок 4 . Экспрессия гена ATCC 15697 при питании олигосахаридами молока в качестве единственного источника углерода. Ось абсцисс представляет метки локусов генов семейства 1 растворенных связывающих белков (A) , пермеаз ABC (B) и GlcNAc-активных генов (C) .На оси ординат отложены кратные изменения экспрессии гена относительно контрольной лактозы, измеренные с помощью qRT-PCR. LNT и LNnT обозначены фиолетовым и серым цветом. Планки ошибок показывают стандартные отклонения трех биологических повторов, за исключением LNnT. * p <0,05 при оценке с помощью однофакторного дисперсионного анализа и множественного сравнения Тьюки.

Во время гидролиза HMO GlcNAc высвобождается из олигосахарида и, вероятно, подвергается дезаминированию и деацетилированию перед вступлением в путь F6PPK (рис. 3).Это катализируется GlcNAc-6-фосфатдеацетилазой ( nagA ; Blon_0882, EC 3.5.1.25) и глюкозамин-6-фосфат-изомеразой / дезаминазой ( nagB ; Blon_0881, EC 3.5.99.6). И Blon_0881, и Blon_0882 продемонстрировали значительную активацию при росте на LNT и LNnT по сравнению с лактозой ( p <0,05). В частности, LNnT индуцировал кратные изменения на 19,34 ± 3,21 и 21,84 ± 3,90 для Blon_0881 и Blon_0882 соответственно, тогда как LNnT вызывал аналогичную индукцию, измеренную при 18.71 ± 5,43 и 20,61 ± 6,19 (рис. 4С). Эта повышающая регуляция интерпретируется как совместимая с катаболизмом GlcNAc, что свидетельствует о том, что деацетилирование происходит во время использования LNT и LNnT. Существенных различий в экспрессии этих генов GlcNAc между метаболизмом LNT и LNnT не обнаружено. Этот профиль экспрессии может отражать сходство скорости роста между LNT и LNnT, как показано на рисунке 1B.

Транскриптом

Модель B.Infantis ATCC 15697 транскриптом при использовании HMOs ранее был охарактеризован с помощью RNA-seq (26). Учитывая дифференциальный метаболизм, наблюдаемый в текущем исследовании, определенные пути, которые, как предполагалось, имеют отношение к использованию LNT и LNnT, были изучены более глубоко в соответствии с дифференциальной экспрессией генов за пределами нормализованного количества. Соответственно, необработанные считывания были извлечены и подвергнуты анализу дифференциальной экспрессии (т. Е. 2-кратному изменению) кластерных генов утилизации HMO, катаболических генов галактозы (т.е., путь Лелуара), GlcNAc-родственные гены, гликозилгидролазы и путь F6PPK, как указано в таблице S2.

Гены, участвующие в метаболизме галактозы (Blon_2171, Blon_2172 и Blon_2174) и соседние переносчики ABC (Blon_2175, Blon_2176 и Blon_2177), сильно активируются как LNT, так и LNnT по сравнению с лактозой ( p <0,05) (Рисунок 5). Более того, LNnT вызывает более сильную индукцию этих генов по сравнению с LNT ( p <0,05). Точно так же F1SBP и пермеасы, локализованные в кластере использования ОПЗ (т.е., Blon_2344-2352) активировались как LNT, так и LNnT по сравнению с контролем лактозы ( p <0,05). Кроме того, Blon_2344, Blon_2347 и Blon_2352 были значительно активированы во время ферментации LNT по сравнению с LNnT ( p <0,05).

Рисунок 5 . Относительная экспрессия генов в глобальном транскриптоме изображена как log2-кратное изменение. Логарифмически двукратное изменение экспрессии гена из независимых биологических дубликатов выполняли из необработанных считываний с использованием R-пакета DESeq2.Выражения с двукратным изменением были подвергнуты иерархической кластеризации с использованием евклидова расстояния и отображены как z-значения. Аннотации генов и предсказанные функции представлены в таблице S2.

Гены использования GlcNAc Blon_0881 ( nagB ) и Blon_0882 ( nagA ) были значительно активированы, в то время как B. infantis использует как LNT, так и LNnT относительно лактозы ( p <0,05, рис. 5). Однако нет существенной разницы между метаболизмом LNT и LNnT ( p > 0.05). Это согласуется с анализом экспрессии гена qRT-PCR.

Было высказано предположение, что ключевой фермент фруктозо-6-фосфат фосфокетолаза ( xfp , Blon_1722) высоко экспрессируется независимо от углеводного субстрата (26). Интересно, что гены пути F6PPK подавляются LNT по сравнению с лактозой и LNnT ( p <0,05, рис. 5). Кроме того, LNnT продемонстрировал сильную активацию этих генов по сравнению с лактозой ( p <0,05), за исключением Blon_1722, Blon_1096 и Blon_1368, которые существенно не различались ( p > 0.05). Это интересно, поскольку биомасса и скорость роста, достигнутые с LNT или лактозой, существенно не различались ( p > 0,05, рисунок 1). Несмотря на потенциал для большего потока через центральный путь ферментации в соответствии с транскриптомом, LNnT вызывал меньшую продукцию биомассы ( p <0,05). Кроме того, лактатдегидрогеназа ( ldh; Blon_0840, EC 1.1.1.37) превращает пируват в лактат для рециклирования кофакторов и значительно индуцируется LNnT по сравнению с лактозой и LNT ( p <0.05). Связь между экспрессией ldh и LNnT, индуцирующей более низкие концентрации молочной кислоты, неясна. Это потенциально указывает на вариацию между физиологическим состоянием клеток во время сбора образца (т. Е. Среднеэкспоненциальная или стационарная фаза). Соответственно, высокие уровни молочной кислоты наблюдались в начале ферментации олигофруктозы B. animalis и заменялись муравьиной кислотой на более поздних стадиях (50).

Интересно, что ацетаткиназа ( ack ; Blon_1731, EC 2.7.2.1) был более активным при потреблении LNnT по сравнению с лактозой и LNT ( p <0,05). Ацетаткиназа катализирует фосфорилирование на уровне субстрата в пути F6PPK, который участвует как в превращении фосфокетолазы в ацетил-P, так и в превращении ацетил-коА в ацетат, и, таким образом, отражает относительно более высокую секрецию уксусной кислоты во время ферментации LNnT.

Поскольку использование LNnT характеризуется повышенным образованием муравьиной кислоты, предполагаемые гены, участвующие в этом пути, были исследованы.Примечательно, что этот метаболический процесс у бифидобактерий не полностью охарактеризован. Формиатацетилтрансфераза (Blon_1715, EC 2.3.1.54) и пируватформиатлиаза (Blon_1714, EC 1.97.1.4) потенциально превращают пируват в ацетил-коА и продуцируют муравьиную кислоту. Соответственно, Blon_1715 высоко экспрессируется во время использования LNnT по сравнению с лактозой и LNT ( p <0,05). Напротив, метаболизм LNT не характеризуется повышенной продукцией муравьиной кислоты и вызывает подавление как Blon_1714, так и Blon_1715 по сравнению с лактозой и LNnT ( p <0.05). Хотя LNnT активировал гены F6PPK по сравнению с лактозой, наиболее сильное изменение наблюдалось в формиатацетилтрансферазе (2-кратное изменение = 1,20). Опять же, это согласуется с повышенной продукцией муравьиной кислоты во время метаболизма LNnT, чтобы предоставить доказательства того, что дифференциальные фенотипы, проявляемые между LNnT и LNT, регулируются на уровне экспрессии генов, по крайней мере, частично.

Двадцать пять ключевых гликозилгидролаз (GH) были отобраны для дальнейшего анализа (рис. 5) (10, 17, 51).Всего 13 локусов значительно различаются между LNT и LNnT метаболизмом ( p <0,05). Среди β-галактозидаз Blon_2016 (семейство GH 42) и Blon_2334 (семейство GH 2) подавлялись во время использования LNT по сравнению с лактозой и LNnT ( p <0,05). Это интересно, потому что было показано, что Blon_2016 обладает специфичностью к HMO типа I, таким как LNT (52), и было показано, что Blon_2334 конститутивно экспрессируется при использовании объединенных HMOs и других сложных олигосахаридов (26, 51).Уровень β-глюкозидазы Blon_1905 был значительно повышен как LNT, так и LNnT по сравнению с лактозой ( p <0,05), причем экспрессия во время роста LNnT была значительно выше, чем LNT ( p <0,05).

Характерная для общего метаболизма HMO, α-L-фукозидаза Blon_0248 (семейство GH 29) была значительно усилена LNnT по сравнению с лактозой и LNT ( p <0,05). Интересно, что другая α-L-фукозидаза GH 29 (Blon_0426) сильно активируется LNT, тогда как LNnT подавляет ее ( p <0.05). Другие фукозидазы Blon_2335 и Blon_2336 были сильно активированы LNT, а не LNnT ( p <0,05). Гликозилгидролазы, Blon_0625 и Blon_2460 были подавлены в обоих видах HMO по сравнению с лактозой, со значительно более сильным подавлением, наблюдаемым в LNnT, чем LNT ( p <0,05). Blon_2468, эндо-β- N -ацетилглюкозаминидаза, которая обычно высвобождает N -гликанов из гликопротеинов грудного молока, активируется LNT, в то время как LNnT понижает ( p <0.05).

Чтобы оценить потенциальную фенотипическую изменчивость в пределах B. infantis , три штамма в дополнение к ATCC 15697 были подвергнуты росту на глюкозе, галактозе, лактозе, LNT и LNnT в качестве единственного источника углерода (Таблица S3). И B. infantis, UMA299 и UMA300 использовали GlcNAc в качестве единственного углеводного субстрата в отличие от ATCC 15697.Ни в одном из протестированных штаммов B. infantis фукоза не использовалась в качестве единственного ферментативного субстрата. UMA299 показал более низкий рост на LNT (OD _{600 нм} , _asym = 0,69 ± 0,09, k = 0,57 ± 0,05 ч ^-1 ) и LNnT (OD _{600 нм} , _asym = 0,71 ± 0,06, k = 0,68 ± 0,06 ч ^-1 ) по сравнению с составляющими углеводными остатками в HMO ( p <0,05, таблица S3). Это важно, поскольку UMA299 не использует эффективно объединенные ОПЗ, в отличие от других B.Infantis штаммов (31). Вероятно, это связано с отсутствием двух генов-транспортеров F1SBP (Blon_2344 и Blon_2351) в его катаболическом кластере HMO (30). Интересно, что, несмотря на ограниченный рост, UMA299 продемонстрировал более высокое предпочтение LNnT при значительно более низкой скорости роста на LNT ( p <0,05). Кроме того, UMA299 показал OD _{600 нм} , _asym 0,42 ± 0,09 на растворимом GlcNAc со скоростью роста 0,16 ± 0,01 ч ^-1 , что значительно ниже по сравнению с другими протестированными углеводами ( p <0.05).

B. infantis UMA300 эффективно использовал LNnT (OD _{600 нм} , _asym = 1,30 ± 0,12, k = 0,51 ± 0,05 ч ^-1 ), что в той же степени, что и LNT (OD _{600 нм} , _asym = 0,99 ± 0,20, k = 0,71 ± 0,05 ч ⁻¹ ). Штамм утилизировал галактозу в клеточных концентрациях, аналогичных LNT и LNnT, и неэффективно утилизировал лактозу и GlcNAc (Таблица S3). Что касается скорости роста (k), UMA300 продемонстрировал самую высокую скорость роста на LNT и галактозе со значительно более низкой скоростью роста на LNnT ( p <0.05). Это является дополнительным свидетельством того, что два вида ОПЗ используются различными механизмами штаммами B. infantis . Несмотря на достижение наивысших концентраций биомассы на LNnT, предпочтение UMA300, определяемое скоростью роста, существенно не варьировалось между LNnT и лактозой ( p > 0,05). Низкая скорость роста UMA300 на GlcNAc предполагает, что этот аминосахар не является предпочтительным по сравнению с другими протестированными углеводами ( p <0,05).

В отличие от UMA300, B.Infantis UMA301 показал интенсивный рост на лактозе (OD _{600 нм} , _asym = 1,29 ± 0,05, k = 0,56 ± 0,05 ч ^-1 ), затем на галактозе (OD _{600 нм} , _asym = 1,22 ± 0,05 , k = 0,63 ± 0,06 ч ^-1 ) и LNT (OD _{600 нм} , _asym = 1,01 ± 0,17, k = 0,44 ± 0,06 ч ^-1 ), все из которых существенно не различаются ( p > 0,05, таблица S3). UMA301, однако, достиг значительно более низких концентраций биомассы на LNnT (OD _{600 нм} , _asym = 0.86 ± 0,04, k = 0,40 ± 0,01 ч ⁻¹ ) при более низкой скорости роста. Это предполагает явное предпочтение LNT, а не LNnT между этими двумя тетрасахаридами HMO. Как и ATCC 15697, UMA301 не использует GlcNAc в качестве единственного источника углеводов.

В соответствии с ростом, ATCC 15697, UMA299 и UMA301 потребляли галактозу и лактозу> 40%, тогда как UMA300 потребляли лактозу на уровне 25% ( p <0,05, рисунок S1A). Точно так же UMA299 потреблял GlcNAc в большей степени, чем UMA300.

Для определения фенотипической изменчивости в зависимости от источника углеводов и штамма B. infantis был проведен анализ главных компонентов (PCA) и иерархическая кластеризация. Этот анализ включал как окончательную асимптотическую OD _{600 нм} , так и данные о скорости роста для штаммов, растущих на отдельных субстратах (Фиг.6). Первый главный компонент (PC1) объясняет 40,8% вариации значений OD _{600 нм} , _asym , тогда как PC2 фиксирует вариацию 37,7% (рис. 6A).Баллы каждого компонента, сгруппированного как штаммы, сгруппированы близко (то есть в пределах нормальной вероятности). Это указывает на то, что ростки одинаковы среди биологических реплик независимо от ферментативного субстрата. Стрелки, ориентированные в одном направлении, обозначают, что рост конкретного углевода коррелирует с этим компонентом ПК, причем угол между стрелками указывает на аналогичный профиль ответа. Векторы использования LNT и галактозы исходят в сходных направлениях, что отрицательно коррелирует с обоими ПК (рис. 6А).Эти два вектора выровнены вдоль PC1, где сгруппированы ростки ATCC 15697 и UMA301. Однако рост UMA300 положительно согласовывался с PC1 в том же направлении, что и вектор использования LNnT. Это указывает на то, что UMA300 хорошо использует LNnT по сравнению с другими углеводами и штаммами. Это согласуется с зависимым от штамма использованием, поскольку UMA300 имел более высокий конечный OD _{600 нм} , _asym во время использования LNnT по сравнению с другими штаммами (фигура 7D). Интересно, что векторы утилизации LNnT и лактозы были ориентированы в противоположных направлениях, что предполагает различия в утилизации между ними.Использование GlcNAc и глюкозы имеет аналогичное выравнивание и положительно коррелирует с обоими компонентами, в которых кластеризуется UMA299, что согласуется с его ограниченной способностью эффективно использовать HMO.

Рисунок 6 . Штамм-зависимые вариации использования олигосахаридов грудного молока. Панели (A, C) отображают двухмерный анализ главных компонент (PCA), выполненный для окончательной асимптотической OD _{, 600,} и скорости роста (k, h ^-1 ) соответственно.Стрелки на графике PCA представляют корреляцию переменных с главными компонентами (PC1 и PC2). Баллы представляют собой оценки каждого компонента, сгруппированного как биологические копии. Эллипсы, охватывающие каждый штамм, улавливают 68% нормальной вероятности оценок в рамках соответствующих штаммов. Панели (B, D) показывают дендрограмму иерархической кластеризации штаммов на конечной асимптотической OD _{600 нм} и скорости роста (k, h ^-1 ) с использованием метода Уорда и Евклидова расстояния.По оси ординат измеряется близость отдельных штаммов или кластеров. Прямоугольники показывают 95% кластеризации и близости штаммов.

Рисунок 7 . Кинетика роста B. longum subsp. infantis штаммов, питающихся углеводами молока. Конечная асимптотическая OD _{600 нм} и скорость роста (k, h ^-1 ) штаммов B. infantis при выращивании на среде mMRS, содержащей 2% (мас. / Об.) Галактозы (A) , лактозы ( B) , лакто- N -тетраоза (LNT) (C) и лакто- N -неотетраоза (LNnT) (D) .Кинетика роста была рассчитана с помощью Wolfram Mathematica 10.3 и представляет собой среднее значение ± SD трех независимых экспериментов. Фиолетовые и красные столбики указывают на рост и скорость роста бактерий соответственно. Звездочки указывают на существенные различия между штаммами, оцененными с помощью однофакторного дисперсионного анализа и множественного сравнения Тьюки. * p <0,05, ** p <0,005, *** p <0,0005 и **** p <0,0001. Кинетика роста глюкозы и GlcNAc не была включена, поскольку не все штаммы потребляют эти моносахариды.

Иерархическая кластеризация использовалась для определения количественного сходства между штаммами. Высота между линиями указывает расстояния между штаммами и их биологическими репликами (рис. 6В). PCA и иерархическая кластеризация были согласованы и показали, что ATCC 15697 и UMA301 сгруппированы вместе с высотой <4 (рисунок 6B). Интересно, что это отражает филогенетическое родство между ATCC 15697 и UMA301 (30).

В дополнение к полученной конечной биомассе, PCA скоростей роста, наблюдаемых на множественных субстратах, разделился на PC1, чтобы охватить 51.6% вариабельность для каждого штамма и положительно коррелировала со всеми углеводами, кроме лактозы (рис. 6С). Это интересно, поскольку ранее было установлено, что штаммы Bifidobacterium обладают предпочтением лактозы перед глюкозой (41), причем лактоза часто используется в качестве положительного контроля и для размножения штаммов бифидобактерий. ATCC 15697 и UMA301 объединились в кластеры и отрицательно коррелировали с PC1. Эти два штамма показали одинаковую степень использования для всех протестированных субстратов. Интересно, что темпы роста UMA300 на галактозе, LNT, глюкозе и GlcNAc были аналогичны и отчетливо сгруппированы по сравнению с другими штаммами (Рисунок 6C) со значительно более высокими значениями для этих источников углеводов по сравнению с другими штаммами ( p <0.05, рисунок 7). Иерархическая кластеризация с использованием метода Уорда подтвердила PCA (рис. 6D). Иерархическая кластеризация скорости роста также согласуется с тем же анализом конечной биомассы (OD _{600 нм} , _asym ), который дает аналогичную топологию расстояний. Учитывая совокупность эмпирических данных, B. infantis использование LNT и LNnT различается в зависимости от штамма.

Сравнительный анализ конечных продуктов ферментации молочной кислоты, уксусной кислоты, муравьиной кислоты и этанола был проведен на панели B.Infantis штаммов. Эти конечные продукты секретируются в результате потока углерода через путь F6PPK, данные представлены в виде тепловой карты с иерархическим кластерным анализом (рис. 8A). Как и ожидалось, производство уксусной кислоты и молочной кислоты сгруппировано более тесно друг с другом, чем производство этанола и муравьиной кислоты, поскольку эти два конечных продукта секретируются независимо от субстрата (рис. 8A).

Рисунок 8 . Анализ штаммов B. longum subsp infantis секретировали конечные продукты ферментации при использовании углеводов молока.На панели (A) показаны метаболиты, секретируемые штаммами B. infantis для каждого углевода, сгруппированного по евклидовому расстоянию, рассчитанному с помощью MetaboAnalyst 3.0. Масштабирование выполняли путем центрирования среднего и деления на стандартное отклонение каждого метаболита. Красный цвет означает более низкие концентрации метаболита, желтый — приближение к более высоким концентрациям. Панели (B, E) отображают двумерный график анализа главных компонентов (PCA), изображающий отношения уксусной кислоты к молочной кислоте и отношения уксусной кислоты к молочной кислоте к муравьиной кислоте соответственно.Стрелки на графике PCA представляют корреляцию переменных с главными компонентами (PC1 и PC2). Баллы представляют собой оценки каждого компонента, сгруппированного как биологические копии. Эллипсы для каждого штамма включают 68% нормальной вероятности оценок для соответствующих штаммов. Панели (C, F) представляют собой дендрограмму иерархической кластеризации штаммов согласно отношениям уксусной кислоты к молочной кислоте и отношения уксусной кислоты к молочной кислоте к муравьиной кислоте с использованием метода Уорда и Евклидова расстояния.По оси ординат измеряется близость либо отдельных штаммов, либо их рассчитанных кластеров. Панели (D, G) представляют иерархическую кластеризацию на основе значений p , вычисленных с помощью многоуровневого бутстреппинга между отношением уксусной кислоты к молочной кислоте и соотношением уксусной кислоты к молочной кислоте и муравьиной кислоте. По оси ординат измеряется близость отдельных подложек или кластеров в соответствии с двумя показателями: приблизительное несмещенное значение p (AU красным) и значение Bootstrap Probability (BP синим).Кластеры со значениями AU> 95% выделены прямоугольниками.

Метаболический профиль ATCC 15697 и UMA301 при ферментации галактозы, лактозы и LNT тесно сгруппированы вместе с высоким содержанием уксусной кислоты и молочной кислоты и меньшим производством муравьиной кислоты и этанола (рис. 8A). Интересно, что UMA299 продуцирует более высокие концентрации муравьиной кислоты и этанола при использовании GlcNAc, глюкозы, LNT и LNnT по сравнению с другими углеводами (рис. 8A). Это указывает на то, что UMA299 использует LNT по другой метаболической траектории относительно других штаммов.Это согласуется с его конечной биомассой и общим фенотипом как атипичного потребителя ОПЗ (рис. 7С).

ATCC 15697, UMA301 и UMA299 Метаболизм LNnT был связан с более высокими концентрациями муравьиной кислоты и этанола. UMA300, напротив, демонстрировал значительно иной метаболический профиль, который тесно связан с LNT, с меньшим образованием муравьиной кислоты и этанола, чем другие штаммы (рис. 8A). Это не сильно отличалось от метаболизма галактозы, лактозы и глюкозы. Это говорит о том, что UMA300, в отличие от других штаммов, предпочтительно превращает пируват в молочную кислоту, а не в ацетил-КоА, независимо от субстрата, за исключением GlcNAc.

Извлечение углерода, наблюдаемое в секретируемых метаболитах после использования моно- и дисахаридов, показано на рисунке S1B. UMA299 восстановил почти 100% углерода для всех сахаров, кроме галактозы. Все штаммы восстанавливали <100% углерода при ферментации галактозы. ATCC 15697, UMA299 и UMA301 достигли почти 100% извлечения углерода при использовании лактозы. Интересно, что UMA300 показал 138% извлечения углерода, как определено секретируемым метаболитом после роста на лактозе. Это было значительно выше, чем у ATCC 15697 и UMA301 ( p <0.05). Это может быть связано с гидролизом оставшейся лактозы в глюкозу и галактозу в среде после ферментации, при этом UMA300 потенциально может иметь преимущество в использовании моносахаридов перед лактозой.

Сравнивали отношения уксусная кислота: молочная кислота, секретируемая после ферментированных субстратов штаммов B. infantis (Фигуры 8B-D). Соответственно, PC1 и PC2 охватывают 50,7 и 31,2% вариации этих соотношений (рис. 8B). UMA300 и UMA301 показали положительную корреляцию с PC1, тогда как ATCC 15697 и UMA299 имели отрицательную корреляцию.Это связано с более высокими значениями соотношения штаммов по конкретному углеводу, при этом каждый штамм отчетливо кластеризуется на PC2. Иерархическая кластеризация штаммов соответствовала PCA (рис. 8C). Это связано с тем, что UMA299 показал значительно более высокое соотношение в метаболизме LNT и LNnT по сравнению с другими штаммами ( p <0,05, фигура 9A). Кроме того, направление векторов LNT и LNnT имеет отрицательную ориентацию, причем оба компонента имеют очень похожую величину и направление в PCA (рис. 8B).Это объясняет тесную кластеризацию LNT и LNnT на основе евклидова расстояния (<0,95), тогда как углеводные составляющие HMO отделены от обоих видов HMO (рис. 8D). Агломеративная кластеризация штаммов не выявила различий для LNT и LNnT. Это потенциально связано с деацетилированием GlcNAc, увеличивающим продукцию уксусной кислоты во время использования HMO.

Рисунок 9 . Соотношение конечных продуктов B. longum subsp. Конечные продукты ферментации штамма infantis при использовании углеводов молока.Отношение уксусной кислоты к молочной кислоте (A) , отношение уксусной кислоты к молочной кислоте к муравьиной кислоте (B) и отношение этанола к молочной кислоте (C) . Цвета указывают на следующие углеводные субстраты: фиолетовый, галактоза; красный, лактоза; темно-синий, лакто- N -тетраоза; зеленый, лакто- N -неотетраоза. Средние значения из независимых биологических повторов (по крайней мере, трех повторов) показаны столбиками, представляющими стандартное отклонение от среднего. Звездочки указывают на значительные различия, оцененные с помощью двухфакторного дисперсионного анализа и множественного сравнения Тьюки.* p <0,05, ** p <0,005, *** p <0,0005 и **** p <0,0001.

Производство муравьиной кислоты лежит в основе различных механизмов метаболизма LNT и LNnT (Рисунки 8E – G). Соответственно, PCA, выполненный на соотношениях уксусная кислота: молочная кислота: муравьиная кислота, четко указывает на то, что ферментация LNT и LNnT происходит по разным метаболическим маршрутам, поскольку эти векторы ориентированы в противоположных направлениях вдоль PC1 (захват 52,0% вариации) (рис. 8E).Это говорит о том, что штаммы B. infantis шунтируют катаболизм LNnT в сторону превращения пирувата в ацетил-КоА, а не в молочную кислоту, чтобы впоследствии секретировать муравьиную кислоту.

UMA300 был положительно позиционирован вдоль PC1, тогда как ATCC 15697 и UMA301 в первую очередь объяснялись PC2. Интересно, что ATCC 15697 и UMA301 не группируются вместе, как показано на Фигуре 8F, несмотря на проявление фенотипического и филогенетического сходства. Однако, если значение высоты в иерархической кластеризации увеличивается, они группируются вместе, и только UMA300 остается отдельно.Это связано с тем, что UMA300 не выделяет в значительной степени муравьиную кислоту, за исключением ферментации GlcNAc (фиг. 8A). B. infantis ATCC 15697 и UMA301 продуцировали значительно больше муравьиной кислоты во время ферментации LNnT, чем LNT, что привело к снижению соотношения ( p <0,05, фиг. 9B).

Отношение этанола к молочной кислоте зависело от источника углеводов и штамма (рис. 9C). UMA300 не продуцировал этанол независимо от субстрата, тогда как UMA299 показал более высокое соотношение как для LNT, так и для LNnT по сравнению с другими штаммами ( p <0.05). Интересно, что UMA301 имел ограниченное производство этанола во время ферментации LNnT, тогда как соотношение увеличивалось при использовании LNnT. Это означает, что все штаммы, кроме UMA300, используют LNnT аналогичным метаболическим путем. Таким образом, использование LNnT с помощью ATCC 15697 и UMA301 может включать регенерацию NAD ⁺ посредством производства этанола, тогда как рециркуляция NAD ⁺ во время использования LNT, скорее всего, происходит по мере превращения пирувата в молочную кислоту.

Использование углеводов в человеческом молоке снижает индуцированную липополисахаридами экспрессию IL-8 в эпителиальных клетках Caco-2

Известно, что метаболизм определенных углеводов может влиять на взаимодействия бифидобактерий с эпителием кишечника при определенных условиях.Объединенные бифидобактерии, выращенные на HMO, снижают воспалительные маркеры по сравнению с бифидобактериями, выращенными на глюкозе или лактозе (53, 54). В этих предыдущих исследованиях изучались адгезивные свойства бифидобактерий и бактериальная транслокация при экспоненциальном росте вместо бесклеточных супернатантов, собранных в стационарной фазе. Дифференциальный метаболизм LNT и LNnT вдохновил гипотезу о том, что на взаимодействия между хозяином и микробом можно влиять олигосахаридно-зависимым образом. Чтобы решить эту проблему, метаболиты присутствуют в отработанной среде после B.Infantis на лактозу, LNT и LNnT оценивали на предмет их способности уменьшать воспаление. В частности, была выдвинута гипотеза, что более высокие концентрации уксусной кислоты и муравьиной кислоты, секретируемые в результате метаболизма LNnT, будут по-разному влиять на воспаление. Экспрессию гена цитокинового маркера воспаления IL-8 измеряли в клетках Caco-2 после индуцированного липополисахаридом воспаления (фиг. 10). Соответственно, использованные среды от всех трех ферментаций значительно снижали экспрессию IL-8 по сравнению с отрицательным контролем ( p <0.05). Однако существенной разницы между тремя углеводами молока не было. Кроме того, маркеры воспаления IL-10 и TNF-α были проанализированы и дали противоречивые и, следовательно, неубедительные результаты. Хотя метаболизм B. infantis этих углеводов грудного молока защищает от воспаления, неясно, в какой степени только B. infantis отвечает за противовоспалительный эффект. Кроме того, были протестированы очищенная уксусная кислота, молочная кислота и муравьиная кислота, однако результаты были неубедительными из-за различий между биологическими повторениями.

Рисунок 10 . Экспрессия гена воспалительного маркера интерлейкина-8 в эпителиальных клетках Caco-2, подвергшихся воздействию отработанной среды после ферментации олигосахаридов молока. Ось y представляет собой кратное изменение экспрессии IL-8 по сравнению с фосфатным буферным раствором (PBS). По оси абсцисс показаны источники метаболитов B. infantis , которые используются для обработки клеток Сасо-2 после индукции липополисахаридов (ЛПС). Планки погрешностей показывают стандартные отклонения биологических дубликатов, каждый из которых измерен с тремя техническими повторностями.Одиночные звездочки (*) указывают на значимые различия, оцененные с помощью однофакторного дисперсионного анализа и множественного сравнения Тьюки ( p <0,05).

Обсуждение

Bifidobacterium longum subsp. infantis эволюционировал для использования гликанов, секретируемых с грудным молоком, для выработки АТФ, а также в качестве субстрата для анаболических процессов. Соответственно, его геном включает локус размером 40 т.п.н., посвященный утилизации олигосахаридов грудного молока, который сохраняется у всех B.Infantis штаммов, выделенных к настоящему времени (10, 30). Активности, кодируемые кластером генов HMO, выделяют продукты деградации для дальнейшего метаболизма до вступления в путь F6PPK, характерный путь ферментации, уникальный для рода Bifidobacterium (20). HMOs уклоняются от переваривания во время транзита через желудочно-кишечный тракт и, таким образом, доступны для B. infantis для внутриклеточной транслокации (16, 29). Путь F6PPK неизменно заканчивается внеклеточной секрецией уксусной кислоты и молочной кислоты, при этом муравьиная кислота и этанол образуются в меньшей степени при определенных условиях (20–23).Потенциал B. infantis дифференцированно метаболизировать очищенные виды HMO полностью не исследован. Тетрасахариды HMO LNT и LNnT отличаются связью β1-3 и β1-4 между галактозой и N -ацетилглюкозамином на невосстанавливающем конце соответственно. Принимая во внимание эту структурную вариацию, мы предположили, что LNT и LNnT по-разному метаболизируются после инициации различных транскриптомных каскадов для обработки этих HMOs.

Предыдущее исследование, проведенное на B.Infantis предоставил предварительные наблюдения, чтобы сформировать эту гипотезу (17, 26). В данном исследовании модельный штамм B. infantis ATCC 15697, потребляющий HMO, демонстрирует более высокую эффективность роста (т.е. асимптотическую конечную OD) при метаболизме LNT, а не LNnT. Это произошло из-за отсутствия предпочтения LNT перед LNnT, экстраполированным из их аналогичных темпов роста. Таким образом, ATCC 15697 может испытывать повышенную приспособленность при обнаружении LNT в кишечнике младенца, хотя это еще предстоит проверить в системе in vivo .Более того, ATCC 15697 расходится в метаболической судьбе углеродов во время использования LNT или LNnT. Отношение секретируемой уксусной кислоты к молочной кислоте (AA: LA) значительно выше для LNT и LNnT, чем для других углеводов. Важно отметить, что LNnT способствует значительно более высокому соотношению AA: LA по сравнению с LNT. Деацетилирование GlcNAc посредством деацетилазной активности (EC 3.5.1.25, рис. 3), вероятно, способствует увеличению относительных концентраций уксусной кислоты во время метаболизма LNT.

Особенно важно то, что метаболизм LNnT значительно увеличивает выработку муравьиной кислоты.Это не наблюдается во время метаболизма LNnT и представляет собой серьезный метаболический сдвиг, связанный исключительно с изомерным составом LNnT. Таким образом, соотношение AA: LA увеличивается во время ферментации LNnT, вероятно, из-за деацетилирования GlcNAc и одновременного снижения молочной кислоты в шунтирующем пирувате в сторону производства муравьиной кислоты. Превращение пирувата в ацетил-КоА, а затем в уксусную кислоту во время использования LNnT приводит к образованию муравьиной кислоты и этанола. Модуляция производства уксусной кислоты приводит к повышению уровня АТФ во время ферментации LNnT.Это согласуется с относительной неэффективностью использования LNnT для получения биомассы, поскольку ограниченный АТФ ограничивает рост клеток. Известно, что бифидобактерии увеличивают секрецию муравьиной кислоты при неэффективном метаболизме неблагоприятных субстратов (25, 50, 55–57). Примечательно, что в предыдущих исследованиях наблюдался рост клеток значительно ниже, чем накопленная биомасса, генерируемая на LNnT в настоящем исследовании.

Кроме того, увеличенное производство этанола во время метаболизма LNnT рециркулирует NAD ⁺ после восстановления ацетил-коА.Поскольку муравьиная кислота образуется за счет молочной кислоты, восстановление NAD ⁺ имеет решающее значение, поскольку при производстве молочной кислоты кофакторы рециклируются и не образуются АТФ (23). На молярной основе 2-углеродный путь, заканчивающийся этанолом, улавливает вдвое больше NAD ⁺ , чем 3-углеродное ответвление (т. Е. От пирувата до молочной кислоты). Хотя очевидно, что LNnT сдвигает метаболизм в сторону производства муравьиной кислоты и этанола, молекулярные механизмы, лежащие в основе этих альтернативных путей, остаются не полностью понятыми.Ясно, однако, что концевое соединение β1-4 в LNnT вызывает этот дивергентный физиологический ответ.

В попытке определить вклад глобальной экспрессии генов в метаболизм LNT и LNnT, ранее сгенерированные данные RNA-seq были проанализированы в дополнение к нацеливанию на ключевые локусы с помощью qRT-PCR. Предыдущее исследование Bifidobacterium breve UCC2003 пришло к выводу, что существуют перекрывающиеся метаболические транскрипционные сети с некоторыми важными особенностями, которые уникальны для метаболизма LNT и LNnT (58).Примечательно, что B. breve развил способность гидролизовать HMO внеклеточно и импортировать продукты распада. Имеются ограниченные доказательства того, что B. infantis может это делать, что указывает на фундаментальное физиологическое различие между двумя видами. Поскольку B. infantis захватывает HMO из внеклеточной среды, комплемент и экспрессия транспортных белков могут катализировать или ограничивать метаболизм данного вида HMO. В этом исследовании экспрессия F1SBP Blon_2347 различалась между двумя видами HMO, тогда как Blon_2177 и Blon_2344 экспрессировались независимо от конкретной HMO.Интересно, что глобальный транскриптом показал другой профиль экспрессии для этих конкретных генов. Требуются дополнительные исследования для разрешения конфликта между экспрессией транспортеров, которые, по прогнозам, будут активными в отношении гликанов типа I (то есть LNT) (16), которые, как было обнаружено, индуцированы LNnT типа II. Дальнейшая характеристика функциональных взаимодействий между транспортными системами и субстратами HMO может быть существенной для устранения этих несоответствий.

Остаток аминосахара GlcNAc является составной частью LNT, LNnT и всех HMO со степенью полимеризации ≥4.Перед вступлением в путь F6PPK GlcNAc процессируется двумя ферментами, предположительно кодируемыми в геноме ATCC 15697. Это включает деацетилазу GlcNAc-6-P ( nagA ; Blon_0882), которая деацетилирует GlcNAc перед дезаминированием глюкозамин-6-P изомеразой ( nagB ; Blon_0881). B. infantis экспрессирует оба этих белка при выращивании на объединенной HMO, как сообщалось в предыдущем исследовании (51). В этом исследовании и LNT, и LNnT активировали эти локусы, подтверждая постулат, что связанный с HMO метаболизм GlcNAc вносит вклад в искажение соотношения AA: LA.Повышенное соотношение AA: LA наблюдалось для объединенных HMOs и LNT в предыдущем исследовании, в котором основное внимание уделялось галактоолигосахаридам (47). Важно отметить, что GlcNAc-связанный в HMO может не полностью катаболизироваться посредством пути F6PPK, поскольку GlcNAc может служить субстратом в анаболизме, включая пептидогликан и другие процессы биосинтеза (17). Интересно, что ATCC 15697 не использует GlcNAc при поставке в качестве единственного источника углерода в среде, в отличие от других штаммов B. infantis .Это может быть связано с генетическими или регуляторными вариациями, присущими штамму. Более того, гены гексозаминадазы экспрессировались одинаково независимо от конкретного изомера HMO. Эти ферменты высвобождают GlcNAc из галактозы путем гидролиза связи β1-3, которая присутствует как в LNT, так и в LNnT.

Конечная галактоза, напротив, связана с GlcNAc через связь β1-3 в LNT и связь β1-4 в LNnT. Таким образом, было неожиданным, что гликано-активная (например, LNT) β-галактозидаза (Blon_2016) типа I подавляется LNT, а не LNnT ( p <0.05) (52). Это может быть связано с конститутивной экспрессией других β-галактозидаз, которые расщепляют концевую галактозу in vivo . Важно отметить, что оба изомера HMO активируют два гена, которые, как предполагается, будут подпитывать галактозу пути F6PPK. Сюда входят гал-1-P-уридилилтрансфераза ( galT ; Blon_2172) и уридин-5′-дифосфо-глюкозо-4-эпимераза (UDP-glc-эпимераза, galE ; Blon_2171), которые локализованы рядом с переносчиками HMO на ATCC 15697. хромосома.Более того, LNnT индуцирует эти гены в большей степени, чем LNT. Это обеспечивает детализацию механизмов физиологических различий между ферментацией LNnT и LNT.

Интересно, что LNT и LNnT усиливают экспрессию гена α-L-фукозидазы, несмотря на отсутствие фукозильных фрагментов в их соответствующей структуре олигосахаридов. Соответственно, LNT сильно активирует две фукозидазы, локализованные в катаболическом кластере HMO. Это говорит о том, что существуют частично совпадающие регуляторные системы или B.Infantis распознает LNT и LNnT в качестве сигнальных молекул для подготовки к метаболизму фукозилированных HMO. Тетрасахариды HMO используются на ранней стадии ферментации объединенных HMO до фукозилированных гликанов (19).

Составляющие моносахариды, связанные в HMO, превращаются в субстраты, катаболизированные посредством пути F6PPK. Соответственно, LNnT активирует несколько генов в этом центральном метаболическом пути, вероятно, чтобы удовлетворить потребность в энергии от более неэффективно метаболизируемого олигосахарида.Интересно, что и ацетаткиназа, и лактатдегидрогеназа активируются LNnT по сравнению с LNT или лактозой. Первое ожидается с учетом физиологических доказательств повышенной секреции уксусной кислоты. Повышенная регуляция лактатдегидрогеназы может быть следствием полной активации центрального метаболического регулона для поддержания гомеостаза NAD ⁺ / NADH. Существует значительная связь между производством муравьиной кислоты и процессами транскрипции. LNnT сильно индуцирует формиатацетилтрансферазу ( pfl ; EC 2.3.1.54), который катализирует образование муравьиной кислоты и ацетил-КоА из пирувата. Напротив, LNT подавляет этот ген, а также пируватформиатлиазу, последняя из которых, по-видимому, конститутивно экспрессируется во время ферментации LNnT. Это представляет собой сильную механистическую связь между структурой LNnT и геномными особенностями B. infantis , определяющими метаболический фенотип.

Поскольку бактериальные штаммы данного таксона могут проявлять совершенно разные фенотипы, еще три B.Infantis было исследовано штаммов. B. infantis UMA301 демонстрирует очень похожий метаболический ответ на LNT и LNnT по сравнению с ATCC 15697. Интересно, что эти два штамма тесно связаны филогенетически (30), что предполагает, что метаболическая сигнатура может быть функцией филогенетической дивергенции для B. Infantis Утилизация ОПЗ. Подобно ATCC15697, LNnT сдвигает метаболизм UMA301 в сторону муравьиной кислоты и увеличивает соотношение секреции уксусной кислоты и молочной кислоты.

Напротив, UMA300 эффективно использует как LNnT, так и LNT и не производит муравьиную кислоту и этанол ни на одном из субстратов в такой же степени, как ATCC 15697 и UMA301. Вероятно, это функция того, что UMA300 эффективно обрабатывает LNnT, как LNT, что устраняет необходимость метаболического сдвига. Неэффективный потребитель HMO UMA299 демонстрирует метаболический ответ, соответствующий этому уникальному фенотипу среди B. infantis , исследованных на сегодняшний день (30). Ограниченная способность использовать HMO была приписана генетическим дефектам в ее геномном кластере HMO и обеспечивает контрольный штамм, связывающий генотип с метаболическими фенотипами.В результате неэффективного роста LNT и LNnT, UMA299 увеличивает соотношение AA: LA и производство муравьиной кислоты / этанола. Это согласуется с гипотезой о том, что снижение способности использовать HMO способствует более высоким концентрациям уксусной кислоты по сравнению с другими углеводами, несмотря на достижение низкой оптической плотности.

Подход с использованием клеточных культур был использован для дальнейшей разработки модели взаимодействий между хозяином и микробами, которая включает неэффективный метаболизм конкретных ОПЗ. Бесклеточные супернатанты от B.Infantis HMO ферментации оценивали по их противовоспалительным свойствам на клетках Caco-2. Учитывая протестированные параметры, оказывается, что B. infantis уменьшает воспаление независимо от источника углеводов в молоке. Специфические противовоспалительные молекулы, представленные или секретируемые B. infantis , остаются гипотетическими. Более того, непонятна степень, в которой другие структуры HMO уменьшают воспалительные исходы.

В заключение, использование LNT и LNnT увеличивало соотношение AA: LA во всех штаммах.В случаях, когда LNT или LNnT использовались неэффективно, углерод шунтировался в сторону секреции муравьиной кислоты и этанола. Полностью интегрированная механистическая модель, лежащая в основе этого фенотипа, остается не полностью разработанной. Таким образом, существует научная потребность в исследовании всех очищенных видов HMO, дополнительных штаммов B. infantis , а также других видов бифидобактерий, чтобы установить связи между структурой HMO и физиологическими реакциями. Это позволит дополнительно уточнить метаболическую модель, с помощью которой бифидобактерии используют HMO для колонизации толстой кишки грудного ребенка.Помимо фундаментальных биологических исследований, они имеют большое значение для питания и здоровья младенцев. Накапливаются данные о том, что рациональное планирование мероприятий по улучшению питания детей грудного возраста потребует разумного выбора ОПЗ. Это может включать включение одного вида ОПЗ или их смеси. Очевидно, что конкретный тетрасахарид HMO имеет различные метаболические последствия в зависимости от популяции B. infantis . Эффекты на уровне штамма могут влиять на новые свойства микробиома кишечника младенца.Учет различий между бифидобактериями, структурами ОПЗ, биологией младенца и размещенными в них сообществами микробиома может позволить обеспечить точное питание и повысить эффективность вмешательства.

Авторские взносы

Эксперименты, разработанные EÖ и DS. EÖ провел эксперименты и подготовил рукопись через несколько итераций. Д.С. задумал исследование, отредактировал и утвердил рукопись.

Заявление о конфликте интересов

Авторы заявляют, что исследование проводилось при отсутствии каких-либо коммерческих или финансовых отношений, которые могут быть истолкованы как потенциальный конфликт интересов.

Рецензент CS и управляющий редактор заявили о своей общей принадлежности.

Благодарности

Авторы благодарят Марию Коррадини, Ашу Рани и Сяомэн Ю за полезные обсуждения различных аспектов исследования. Благодарим Корина Альберта за критическую рецензию рукописи. Авторы благодарят Синди Кейн за техническую помощь и Ханг Сяо за использование оборудования. Авторы благодарят за финансирование Ocean Spray, Inc., Министерство сельского хозяйства США (2016-67017-24425) и Центр безопасности продукции (SCB14056).

Дополнительные материалы

Дополнительные материалы к этой статье можно найти в Интернете по адресу: https://www.frontiersin.org/articles/10.3389/fnut.2018.00046/full#supplementary-material

Список литературы

1. Габриэлли О., Зампини Л., Галеацци Т., Паделла Л., Санторо Л., Пейла С. и др. Олигосахариды молока недоношенных в течение первого месяца лактации. Педиатрия (2011) 128 : e1520–31. DOI: 10.1542 / педс.2011-1206

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

2.Коппа Г., Пиерани П., Зампини Л., Карлони И., Карлуччи А., Габриелли О. Олигосахариды в грудном молоке во время различных фаз лактации. Acta Paediatr Suppl. (1999) 88 : 89–94. DOI: 10.1111 / j.1651-2227.1999.tb01307.x

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

3. Саарела Т., Кокконен Дж., Койвисто М. Макроэлементы и энергетическая ценность фракций грудного молока в течение первых шести месяцев лактации. Acta Paediatr. (2005) 94 : 1176–81.DOI: 10.1080 / 08035250510036499

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

4. Сумиёси В., Урасима Т., Накамура Т., Араи И., Сайто Т., Цумура Н. и др. Определение каждого нейтрального олигосахарида в молоке японских женщин в период лактации. Br J Nutr. (2003) 89 : 61–9. DOI: 10.1079 / BJN2002746

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

6. Турл С., Мю Ллер-Вернер Б., Савацки Г.Н.Количественная оценка отдельных олигосахаридных соединений грудного молока с использованием анионообменной хроматографии с высоким pH. Anal Biochem. (1996) 235 : 202–6. DOI: 10.1006 / abio.1996.0113

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

7. Wu S, Tao N, German JB, Grimm R, Lebrilla CB. Разработка аннотированной библиотеки нейтральных олигосахаридов грудного молока. J Proteome Res. (2010) 9 : 4138–51. DOI: 10.1021 / pr100362f

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

9.Шталь Б., Турл С., Зенг Дж. Р., Карас М., Хилленкамп Ф., Стюп М. и др. Олигосахариды из грудного молока, выявленные с помощью матричной лазерной десорбции / ионизационной масс-спектрометрии. Anal Biochem. (1994) 223 : 218–26. DOI: 10.1006 / abio.1994.1577

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

10. Села Д.А., Чапман Дж., Адеуя А., Ким Дж. Х., Чен Ф., Уайтхед Т. Р. и др. Последовательность генома Bifidobacterium longum subsp. infantis раскрывает адаптацию к усвоению молока в микробиоме младенца. Proc Natl Acad Sci USA. (2008) 105 : 18964–9. DOI: 10.1073 / pnas.0809584105

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

11. Андервуд Массачусетс, Герман Дж. Б., Лебрилла CB, Миллс Д.А. Bifidobacterium longum subpecies infantis: чемпион по колонизации кишечника младенцев. Pediatr Res. (2015) 77 : 229–35. DOI: 10.1038 / pr.2014.156

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

12.Turroni F, Peano C, Pass DA, Foroni E, Severgnini M, Claesson MJ и др. Разнообразие бифидобактерий в кишечной микробиоте младенцев. PLoS ONE (2012) 7 : e36957. DOI: 10.1371 / journal.pone.0036957

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

13. Klaassens ES, Boesten RJ, Haarman M, Knol J, Schuren FH, Vaughan EE, et al. Анализ геномных микрочипов смешанных видов фекалий выявляет дифференциальные транскрипционные реакции бифидобактерий у младенцев, вскармливаемых грудью и искусственными смесями. Appl Environ Microbiol. (2009) 75 : 2668–76. DOI: 10.1128 / AEM.02492-08

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

14. Roger LC, Costabile A, Holland DT, Hoyles L, McCartney AL. Исследование фекальных популяций Bifidobacterium у младенцев, вскармливаемых грудью и искусственными смесями, в течение первых 18 месяцев жизни. Микробиология (2010) 156 : 3329–41. DOI: 10.1099 / mic.0.043224-0

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

15.Села Д.А., Миллс Д.А. Уход за нашей микробиотой: молекулярные связи между бифидобактериями и олигосахаридами молока. Trends Microbiol. (2010) 18 : 298–307. DOI: 10.1016 / j.tim.2010.03.008

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

16. Гарридо Д., Ким Дж. Х., Герман Дж. Б., Рейбоулд Х. Э., Миллс Д. А.. Связывающие олигосахариды белки из Bifidobacterium longum subsp. infantis выявляют предпочтение гликанов хозяина. PLoS ONE (2011 г.) 6 : e17315.DOI: 10.1371 / journal.pone.0017315

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

17. Гарридо Д., Руис-Мояно С., Миллс Д.А. Высвобождение и утилизация N-ацетил-d-глюкозамина из олигосахаридов грудного молока Bifidobacterium longum subsp. infantis. Анаэроб (2012) 18 : 430–435. DOI: 10.1016 / j.anaerobe.2012.04.012

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

18. Sela DA, Li Y, Lerno L, Wu S., Marcobal AM, Bruce German J, et al.Бактериальный комменсал, ассоциированный с младенцами, использует сиалилолигосахариды грудного молока. J. Biol Chem. (2011) 286 : 11909–18. DOI: 10.1074 / jbc.M110.1

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

19. Села Д.А., Гарридо Д., Лерно Л., Ву С., Тан К., Эом Х.-Дж. И др. Bifidobacterium longum subsp. infantis ATCC 15697 α-фукозидазы активны в отношении фукозилированных олигосахаридов грудного молока. Appl Environ Microbiol. (2012) 78 : 795–803.DOI: 10.1128 / AEM.06762-11

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

20. Палфраман Р.Дж., Гибсон Г.Р., Расталл Р.А. Углеводные предпочтения видов Bifidobacterium , выделенных из кишечника человека. Curr Issues Intest Microbiol. (2003) 4 : 71–5.

PubMed Аннотация | Google Scholar

24. Ривьер А., Селак М., Лантин Д., Леруа Ф., Де Вюист Л. Бифидобактерии и бактерии толстой кишки, продуцирующие бутират: важность и стратегии их стимуляции в кишечнике человека. Front Microbiol. (2016) 7 : 979. DOI: 10.3389 / fmicb.2016.00979

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

25. Ван Дер Меулен Р., Адриани Т., Вербруге К., Де Вуйст Л. Кинетический анализ метаболизма бифидобактерий показывает незначительную роль янтарной кислоты в регенерации NAD ⁺ за счет его связанной с ростом продукции. Appl Environ Microbiol. (2006) 72 : 5204–10. DOI: 10.1128 / AEM.00146-06

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

26.Гарридо Д., Руис-Мояно С., Лемай Д. Г., Села Д. А., Герман Дж. Б., Миллс Д. А.. Совместная транскриптомика выявляет ключевые различия в ответе на молочные олигосахариды младенческих кишечных бифидобактерий. Научный доклад (2015) 5 : 13517. DOI: 10.1038 / srep13517

CrossRef Полный текст | Google Scholar

27. Бриджман С.Л., Азад М.Б., Филд С.Дж., Хакк А.М., Беккер А.Б., Мандхан П.Дж. и др. Вариации фекальных короткоцепочечных жирных кислот в зависимости от статуса грудного вскармливания у младенцев в возрасте 4 месяцев: различия в относительных и абсолютных концентрациях. Передняя гайка. (2017) 4 : 11. DOI: 10.3389 / fnut.2017.00011

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

28. Чоу Дж., Панасевич М.Р., Александр Д., Вестер Болер Б.М., Россони Серао М.С., Фабер Т.А. и др. Метаболомика кала здоровых детей, находящихся на грудном вскармливании, по сравнению с младенцами, вскармливаемыми смесью, до и во время ферментации периодической культуры in vitro J Proteome Res. (2014) 13 : 2534–42. DOI: 10.1021 / pr500011w

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

29.Асакума С., Хатакеяма Е., Урасима Т., Йошида Е., Катаяма Т., Ямамото К. и др. Физиология потребления олигосахаридов грудного молока младенческими кишечными бифидобактериями. J. Biol Chem. (2011) 286 : 34583–92. DOI: 10.1074 / jbc.M111.248138

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

30. Локацио Р.Г., Десаи П., Села Д.А., Веймер Б., Миллс Д.А. Широкое сохранение генов утилизации молока у Bifidobacterium longum subsp. infantis , что выявлено сравнительной геномной гибридизацией. Appl Environ Microbiol. (2010) 76 : 7373–81. DOI: 10.1128 / AEM.00675-10

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

31. LoCascio RG, Niñonuevo MR, Kronewitter SR, Freeman SL, German JB, Lebrilla CB, et al. Универсальная и масштабируемая стратегия гликопрофилирования бифидобактериями олигосахаридов грудного молока. Microb Biotechnol. (2009) 2 : 333–42. DOI: 10.1111 / j.1751-7915.2008.00072.x

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

32.LoCascio RG, Ninonuevo MR, Freeman SL, Sela DA, Grimm R, Lebrilla CB и др. Гликопрофилирование потребления олигосахаридов грудного молока бифидобактериями демонстрирует штамм-специфическое, предпочтительное потребление гликанов с небольшой цепью, секретируемых в раннем периоде лактации у человека. J Agric Food Chem. (2007) 55 : 8914–9. DOI: 10.1021 / jf0710480

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

33. Marcobal A, Barboza M, Froehlich JW, Block DE, German JB, Lebrilla CB, et al.Потребление олигосахаридов грудного молока кишечными микробами. J Agric Food Chem. (2010) 58 : 5334–40. DOI: 10.1021 / jf05

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

35. Туррони Ф., Форони Э., Пиццетти П., Джубеллини В., Риббера А., Меруси П. и др. Изучение разнообразия популяции бифидобактерий в кишечном тракте человека. Appl Environ Microbiol. (2009) 75 : 1534–45. DOI: 10.1128 / AEM.02216-08

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

36.Орбан Дж. И., Паттерсон Дж. А. Модификация теста на фосфокетолазу для быстрой идентификации бифидобактерий. J Microbiol Methods (2000) 40 : 221–4. DOI: 10.1016 / S0167-7012 (00) 00133-0

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

37. Satokari RM, Vaughan EE, Akkermans AD, Saarela M, de Vos WM. Разнообразие бифидобактерий в фекалиях человека определяется с помощью родоспецифической ПЦР и денатурирующего градиентного гель-электрофореза. Appl Environ Microbiol. (2001) 67 : 504–13. DOI: 10.1128 / AEM.67.2.504-513.2001

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

38. Льюис З.Т., Шани Г., Масарве К.Ф., Попович М., Фрезе С.А., Села Д.А. и др. Подтверждение идентичности видов и подвидов бифидобактерий в коммерческих пробиотических продуктах. Pediatr Res. (2016) 79 : 445–52. DOI: 10.1038 / pr.2015.244

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

39. Dai Y, McLandsborough LA, Weiss J, Peleg M.Влияние концентрации и порядка применения смесей бензоата натрия и эвгенола на ингибирование роста Saccharomyces cerevisiae и Zygosaccharomyces bailii . J Food Sci. (2010) 75 : 482–8. DOI: 10.1111 / j.1750-3841.2010.01772.x

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

41. Парче С., Белеут М., Реццонико Э., Джейкобс Д., Аригони Ф., Титгемейер Ф. и др. Предпочтение лактозы перед глюкозой у Bifidobacterium longum NCC2705: glcP, кодирующий переносчик глюкозы, подвергается репрессии лактозы. J Bacteriol. (2006) 188 : 1260–5. DOI: 10.1128 / JB.188.4.1260-1265.2006

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

43. Линь Ч., Ван Ю. Х., Чен Ю. В., Лин Ю. Л., Чен Британская Колумбия, Чен М.С. Транскрипционная и посттранскрипционная регуляция экспрессии гена CXCL8 / IL-8, индуцированная фактором роста соединительной ткани. Immunol Res. (2016) 64 : 369–84. DOI: 10.1007 / s12026-015-8670-0

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

44.Такаиши К., Комохара Й., Таширо Х., Отаке Х., Накагава Т., Катабучи Х. и др. Вовлечение M2-поляризованных макрофагов в асцит от продвинутой эпителиальной карциномы яичников в прогрессирование опухоли через активацию Stat3. Cancer Sci. (2010) 101 : 2128–36. DOI: 10.1111 / j.1349-7006.2010.01652.x

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

45. Romieu-Mourez R, Solis M, Nardin A, Goubau D., Baron-Bodo V, Lin R, et al. Различная роль регуляторного фактора IFN (IRF) -3 и IRF-7 в активации противоопухолевых свойств макрофагов человека. Cancer Res. (2006) 66 : 10576–85. DOI: 10.1158 / 0008-5472.CAN-06-1279

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

46. Руис-Мояно С., Тоттен С.М., Гарридо Д.А., Смиловиц Ю.Т., Герман Дж.Б., Лебрилла С.Б., Миллс Д.А. Изменения в потреблении олигосахаридов грудного молока младенческими кишечными штаммами Bifidobacterium breve. Appl Environ Microbiol. (2013) 79 : 6040–9. DOI: 10.1128 / AEM.01843-13

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

47.Гарридо Д., Руис-Мояно С., Хименес-Эспиноза Р., Эом Х. Дж., Блок DE, Миллс Д.А. Использование галактоолигосахаридов Bifidobacterium longum subsp. Infantis изоляты. Food Microbiol. (2013) 33 : 262–70. DOI: 10.1016 / j.fm.2012.10.003

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

48. Falony G, Lazidou K, Verschaeren A, Weckx S, Maes D, De Vuyst L. In vitro кинетический анализ ферментации пребиотических фруктанов инулиноподобного типа с помощью видов Bifidobacterium выявляет четыре различных фенотипа. Appl Environ Microbiol. (2009) 75 : 454–61. DOI: 10.1128 / AEM.01488-08

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

49. Милани С., Андреа Лугли Г., Дюранти С., Туррони Ф, Манкабелли Л., Феррарио С. и др. Бифидобактерии проявляют социальное поведение за счет обмена углеводов в кишечнике. Научный доклад (2015) 5 : 15782. DOI: 10.1038 / srep15782

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

50.Van Der Meulen R, Avonts L., De Vuyst L. Короткие фракции олигофруктозы предпочтительно метаболизируются Bifidobacterium animalis DN-173 010. Appl Environ Microbiol. (2004) 70 : 1923–30. DOI: 10.1128 / AEM.70.4.1923-1930.2004

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

51. Ким Дж. Х., Ан Х. Дж., Гарридо Д., Герман Дж. Б., Лебрилла С.Б., Миллс Д.А. Протеомный анализ Bifidobacterium longum subsp. infantis раскрывает метаболическую информацию о потреблении пребиотиков и гликанов хозяина. PLoS ONE (2013) 8 : e57535. DOI: 10.1371 / journal.pone.0057535

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

52. Йошида Э., Сакурама Х., Киёхара М., Накадзима М., Китаока М., Ашида Х. и др. Bifidobacterium longum subsp. infantis использует две разные галактозидазы для селективного разложения олигосахаридов грудного молока типа 1 и типа 2. Гликобиология (2012) 22 : 361–8. DOI: 10,1093 / гликоб / cwr116

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

53.Викрамасингхе С., Пачеко А.Р., Лемей Д.Г., Миллс Д.А. Бифидобактерии, выращенные на олигосахаридах грудного молока, подавляют экспрессию связанных с воспалением генов в клетках Caco-2. BMC Microbiol. (2015) 15 : 172. DOI: 10.1186 / s12866-015-0508-3

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

54. Чичловски М., Де Лартиг Дж., Герман Дж. Б., Рейбоулд Х. Э., Миллс Д. А.. Бифидобактерии, выделенные от младенцев и культивированные на олигосахаридах грудного молока, влияют на функцию эпителия кишечника. J Pediatr Gastroenterol Nutr. (2012) 55 : 321–7. DOI: 10.1097 / MPG.0b013e31824fb899

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

55. Амаретти А., Бернарди Т., Тамбурини Э., Занони С., Ломма М., Маттеуцци Д. и др. Кинетика и метаболизм Bifidobacterium adolescentis MB 239, растущих на глюкозе, галактозе, лактозе и галактоолигосахаридах. Appl Environ Microbiol. (2007) 73 : 3637–44. DOI: 10.1128 / AEM.02914-06

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

56.Озкан Э, Сун Дж., Роули, округ Колумбия, Села Д.А. Комменсал кишечника человека сбраживает углеводы клюквы с образованием формиата. Appl Environ Microbiol. (2017) 83 : e01097–17. DOI: 10.1128 / AEM.01097-17

CrossRef Полный текст | Google Scholar

57. Ван дер Меулен Р., Макрас Л., Вербруге К., Адриани Т., Де Вуйст Л. In vitro кинетический анализ потребления олигофруктозы бактериями Bacteroides и Bifidobacterium spp. указывает на различные механизмы деградации. Appl Environ Microbiol. (2006) 72 : 1006–12. DOI: 10.1128 / AEM.72.2.1006-1012.2006

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

58. Джеймс К., Мазеруэй, Миссури, Боттачини Ф, ван Синдерен Д., Кейперс ОП. Bifidobacterium breve UCC2003 метаболизирует олигосахариды грудного молока, лакто-N-тетраозу и лакто-N-нео-тетраозу, посредством перекрывающихся, но различных путей. Научный доклад (2016) 6 : 38560. DOI: 10.1038 / srep38560

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

5 лучших видов пробиотиков

Поразительно, сколько пробиотиков сегодня доступно, а количество различных комбинаций, доступных в качестве пищевых добавок в магазинах здорового питания и даже добавленных в продукты, растет.Существует множество различных видов бактерий, которые составляют микробиом человека, но наука определила некоторых основных игроков и активно изучила их как на животных, так и на людях. Поэтому я сосредоточусь на этой основной группе пробиотических видов.

Чтобы максимально упростить задачу поиска и приобретения подходящих смесей, я упростил свою рекомендацию до 5 основных широко доступных видов: Lactobaccilus plantarum, Lactobaccilus acidophilus, Lactobaccilus brevis, Bifidobacterium lactis и Bifidobacterium longum. .Разные штаммы дают разные преимущества, но именно они будут поддерживать биологию вашего тела, делая то же самое, что мы обсуждали с самого начала книги, когда речь идет о поддержании здоровья мозга.

Lactobaccilus plantarum : Этот микроб, содержащийся в кимчи, квашеной капусте и других культивируемых овощах, является одной из самых полезных бактерий в вашем организме. Он долго сохраняется в желудке и выполняет множество функций, которые помогают регулировать иммунитет и контролировать воспаление в кишечнике.Это также помогает укрепить слизистую оболочку кишечника, отражая потенциальных захватчиков, которые могут повредить стенку кишечника и проникнуть в кровоток. Фактически, благотворное влияние L. plantarum на слизистую оболочку кишечника, возможно, является его самым важным признаком, поскольку он снижает проницаемость кишечника, тем самым снижая связанный с этим риск повышенной проницаемости кишечника, включая повышенный риск практически всех заболеваний головного мозга. Более того, L. plantarum может быстро переваривать белок, что в конечном итоге предотвращает пищевую аллергию и даже лечит такие аллергии, когда они возникают.В экспериментальных исследованиях на животных было показано, что он защищает модифицированных мышей от клинических симптомов рассеянного склероза и даже снижает воспалительную реакцию, типичную для этого состояния. Наконец, L. plantarum обладает сверхъестественной способностью поглощать и поддерживать важные питательные вещества, такие как полезные для мозга омега-3 жирные кислоты, витамины и антиоксиданты. Все эти действия делают L. plantarum незаменимым для борьбы с инфекциями и контроля над любыми патогенными бактериями.

Lactobaccilus acidophilus : L.acidophilus — любимец кисломолочных продуктов, в том числе йогуртов. Он контролирует баланс хороших и вредных бактерий и тем самым помогает вашей иммунной системе. У женщин это помогает сдерживать рост Candida albicans, грибка, который может вызывать дрожжевые инфекции. L. acidophilus также получил известность благодаря своей способности поддерживать уровень холестерина. В тонком кишечнике L. acidophilus продуцирует множество полезных веществ, которые борются с патогенными микробами, включая ацидолфилин, ацидолин, бактериоцин и лактоцидин.

Lactobaccilus brevis : квашеная капуста и соленые огурцы во многом обязаны этому микробу, который улучшает иммунную функцию за счет повышения клеточного иммунитета и даже повышения активности Т-клеток-киллеров. Он настолько эффективен в борьбе с вагинозом, распространенной бактериальной инфекцией влагалища, что его добавляют в лекарственные препараты, используемые для его лечения. L. brevis также подавляет действие некоторых кишечных патогенов. Возможно, лучше всего было показано, что он увеличивает уровень звездного гормона роста мозга BDNF.

Bifidobacterium lactis (также называемый B. animalis) : кисломолочные продукты, такие как йогурт, содержат этот драгоценный камень, который, как подтверждено документально, оказывает сильное влияние на предотвращение болезней пищеварения и повышение иммунитета. Также известно, что он помогает избавиться от патогенов пищевого происхождения, таких как сальмонелла, вызывающая диарею.

Bifidobacterium longum : Один из 32 видов, принадлежащих к роду bifidobacterium, это один из первых микробов, которые колонизируют наш организм при рождении.Это было связано с улучшением толерантности к лактозе и предотвращением диареи, пищевой аллергии и распространения патогенов. Также известно, что он обладает антиоксидантными свойствами, а также способностью улавливать свободные радикалы.